Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يتم توفير بروتوكول عالي الإنتاجية للتعقيم السطحي لبذور Arabidopsisthaliana (Arabidopsis) ، وتحسين خطوات التعامل مع السائل باستخدام جهاز شفط بسيط تم بناؤه بمضخة فراغ. يمكن تعقيم مئات عينات البذور في يوم واحد.

Abstract

أربيدوبسيس هو إلى حد بعيد الأنواع نموذج النبات الأكثر استخداما على نطاق واسع للدراسات الوظيفية. التعقيم السطحي لبذور أربيدوبسيس هو خطوة أساسية مطلوبة لتحقيق هذه الغاية. وبالتالي، من الأهمية بمكان إنشاء طرق عالية الإنتاجية لتعقيم سطح بذور أربيدوبسيس للتعامل مع عشرات إلى مئات العينات (على سبيل المثال، الخطوط المعدلة وراثيا، أو الأنماط الإيكولوجية، أو المسوخ) في وقت واحد. يتم تقديم طريقة التعقيم السطحي للبذور على أساس القضاء الفعال على السائل في الأنابيب مع جهاز شفط محلي الصنع تم بناؤه من مضخة فراغ مشتركة في هذه الدراسة. من خلال الحد بشكل كبير من العمل الكثيف التدريب العملي على الوقت مع هذه الطريقة التعامل مع عدة مئات من العينات في يوم واحد ممكن مع القليل من الجهد. كما أشارت تحليلات الدورة الزمنية السلسلية إلى نطاق زمني مرن للغاية للتعقيم السطحي من خلال الحفاظ على معدلات إنبات عالية. يمكن تكييف هذه الطريقة بسهولة للتعقيم السطحي لأنواع أخرى من البذور الصغيرة مع تخصيص بسيط لجهاز الشفط وفقا لحجم البذور ، والسرعة المطلوبة للقضاء على السائل.

Introduction

أربيدوبسيس هو نوع نباتي ثنائي الفصي ينتمي إلى عائلة براسيكاي. دورة حياتها قصيرة نسبيا (شهرين لكل جيل في ظل ظروف النمو ليوم طويل)، وحجم النبات الصغير، والتلقيح الذاتي مع إنتاج مئات البذور لكل نبات جعلت من أول نوع نموذج نباتي أساسي1،2. وبالإضافة إلى ذلك، كان تسلسل الجينوم لها تماما3،واسعة أدوات علم الوراثة العكسي (المشبعة T-DNA، transposon، والسكان المعدلة كيميائيا) متوفرة4،5،6، وفعالة Agrobacterium-بوساطة التحول راسخة للحصول على خطوط معدلة وراثيا كافية لمزيد من العمل المصب7 . وهكذا، خلال العقدين الماضيين، تم تحقيق تقدم كبير باستخدام Arabidopsis كنوع نموذجي لتشريح جوانب متنوعة من بيولوجيا النبات على المستوى الجزيئي، بما في ذلك الاختلاف الطبيعي والوراثي والفينوتيبيك8،9.

لتوصيف وظيفيا الجينات ذات الاهتمام في Arabidopsis، التعقيم السطحي البذور للقضاء على الملوثات الفطرية والبكتيرية هو الخطوة الأساسية لكثير من بروتوكولات المصب التي تتطلب الثقافات المحورية. التحول الوراثي لفرط التعبير10، الضربة القاضية (RNA-I11)أو خروج المغلوب (تحرير الجينوم12،13)من وظيفة الجينات ، توطين subcellular14، نشاط المروج15،16، البروتين البروتين17 والتفاعل بين البروتين والحمض النووي18، على سبيل المثال لا يذكر سوى التطبيقات الأكثر شيوعا ، وكلها تتطلب خطوة التعقيم سطح البذور. وهكذا، على الرغم من بساطته النسبية، يلعب تعقيم سطح البذور دورا أساسيا في العديد من التحليلات الوظيفية.

حتى الآن، وقد وضعت فئتين رئيسيتين من أساليب التعقيم السطحي البذور على أساس إما الغاز أو على التعقيم في مرحلة السائل19. وفي حين أن إنتاجية التعقيم السطحي للبذور في مرحلة الغاز متوسطة إلى عالية، فإن استخدام غاز الكلور الكاشف الخطر كعامل تعقيم سطحي أعاق تطبيقه على نطاق واسع. تعتمد الطرق القائمة على التعقيم في المرحلة السائلة ، على العكس من ذلك ، على مواد كيميائية أكثر اعتدالا مثل الإيثانول وحلول التبييض للتعقيم السطحي ، وتستخدم على نطاق أوسع على الرغم من أن إنتاجها أقل بطبيعته من تبخير الكلور. بشكل عام، يتم استخدام طريقتين مختلفتين تستخدمان الكواشف السائلة بشكل عام. ويستند أسلوب واحد يستخدم إلى حد كبير على الغسيل مع الإيثانول والتبييض بتركيزات مختلفة لمدة مختلفة من الوقت20،21. ويستند أسلوب آخر على تطبيق التبييض فقط21،22. وتطبق كلتا الطريقتين أساسا لتعقيم سطح البذور على نطاق صغير. ومع ذلك، في العديد من التجارب، فمن الضروري لفحص العديد من خطوط أربيدوبسي المعدلة وراثيا المستمدة من تحويل واحد15،23 أو الشاشة في موازاة العديد من خطوط المعدلة وراثيا ولدت من التحولات المختلفة24،25. وعلى حد علمنا، لم تنشر أي طريقة قائمة على السوائل لتعقيم سطح البذور عالي الإنتاجية، مما يشكل، على الرغم من عدم الاعتراف به، اختناقا هاما لنهج الجينوم الوظيفي. لذلك، تطوير أساليب آمنة وقوية وعالية الإنتاجية لتعقيم سطح البذور هو خطوة ضرورية وحاسمة نحو نجاح التوصيف الوظيفي للعديد من الجينات في وقت واحد.

وتحقيقا لهذه الغاية، في الدراسة الحالية، يتم تقديم طريقة محسنة للتعقيم السطحي لبذور الأرابيدوسيس. هذه الطريقة آمنة ومنخفضة التكلفة وقوية للغاية وعالية الإنتاجية ، مما يسمح بالتعامل مع 96 خطا مستقلا في غضون ساعة واحدة من بداية تعقيم سطح البذور حتى نهاية بذر البذور في أطباق بيتري. تعتمد الطريقة التي أثبتت على الأجهزة المختبرية الأساسية المتاحة على نطاق واسع مثل مضخة فراغ ، وأواني زجاجية قابلة للاستهلاك ، وأدوات بلاستيكية. توفر هذه الطريقة المحسنة للمجتمع العلمي نهجا آمنا وبسيطا وبأسعار معقولة لتبسيط تعقيم سطح البذور مع إنتاجية كافية لنهج الجينوم الوظيفي الحديث في Arabidopsis وغيرها من الأنواع النباتية غير النموذجية.

Protocol

1. الكواشف وإعداد وسائل الإعلام

  1. إعداد محلول الإيثانول بنسبة 70٪: أضف 737 مل من الإيثانول التقني بنسبة 95٪ إلى 263 مل من الماء المقطر. تخلط جيدا.
    ملاحظة: إعداد محلول الإيثانول 70٪ على مقاعد البدلاء العمل غير عقيمة.
    تنبيه: الإيثانول شديد الاشتعال ويمكن أن يسبب تهيجا خطيرا في العينين. الابتعاد عن النيران ومصادر الحرارة. في حالة ملامسة العينين، اشطفي بالماء الوفير.
  2. إعداد محلول التبييض بنسبة 5٪: أضف 5 مل من التبييض المنزلي (يحتوي على ~ 3.5٪ من هيبوكلوريت الصوديوم، NaClO) إلى 95 مل من الماء المقطر العقيم. أضف بضع قطرات من المنظفات غير الأيونية (على سبيل المثال، توين 20) واخلطها جيدا.
    ملاحظة: إعداد محلول التبييض 5٪ داخل غطاء محرك السيارة صفح.
    تنبيه: هيبوكلوريت الصوديوم، المكون النشط للتبييض، هو مزعج للغاية. وهو شديد التآكل ويمكن أن يسبب أضرارا جسيمة للجهاز الهضمي. في حالة الاتصال، شطف فورا مع وفرة المياه. في حالة الابتلاع، اتصل بمركز مكافحة السموم أو طبيب للحصول على المشورة العلاجية.
  3. إعداد نصف قوة Murashige وسكوغ (1/2 MS)المتوسطة 26.
    1. أضف 2.2 غرام من مسحوق MS المتوسط (بما في ذلك الفيتامينات) و 10 غرام من السكروز في 800 مل من الماء المقطر. ضبط درجة الحموضة للمحلول باستخدام 1 M KOH وبذلك يصل حجم إلى 1 لتر باستخدام الماء المقطر. Aliquot 500 مل في زجاجة 1 لتر وإضافة 4G من أجار لإعداد وسيطة صلبة. أوتوكلاف الحل.
    2. بعد الالاستعباد التلقائي، تبرد المتوسطة إلى 50-53 درجة مئوية في حمام مائي وتصب في أطباق بيتري تحت غطاء محرك السيارة تدفق صفح. لإعداد المتوسطة الانتقائية، أضف 1000 ميكرولتر/لتر من محلول مخزون كاناميسين 50 ملغم/مل (اخلط 500 ملغ من الكاناميسين كبريتات أحادية الهيدروهيدرات في 10 مل من الماء المقطر، وتصفية التعقيم وتخزينها عند -20 درجة مئوية) إلى الوسط (50-53 درجة مئوية). تخلط جيدا عن طريق الدوامة، وتصب في أطباق بيتري كما ذكر من قبل.

2. الإعداد أسبيراتور

ملاحظة: يتم تلخيص إعداد الأداة في الشكل 1.

  1. قم بتوصيل مدخل مضخة الفراغ بأحد طرفي أنبوب البولي إيثيلين (PE) بحجم مناسب. قم بتوصيل الطرف الآخر من الأنبوب بمنفذ الغطاء ثنائي الاتجاه لزجاجة التكتكة. التفاف تقاطع الأنابيب بإحكام مع فيلم الختم(جدول المواد)لضمان اتصال الهواء ضيق.
  2. توصيل أنبوب PE الثاني إلى مدخل (ثقب جاحظ إلى داخل الزجاجة) من screwcap على زجاجة decantation. تناسب الجانب الآخر من الأنبوب إلى منفذ صمام حوض السمك. إذا لزم الأمر، التفاف مع فيلم الختم على طول تقاطع للقضاء على تسرب الهواء.
  3. قبل الاستخدام مباشرة، تناسب العقيمة 200 ميكرولتر ماصة تلميح إلى مدخل مرشح الحوض تحت غطاء محرك السيارة تدفق صفح.

figure-protocol-2609
الشكل 1: الرسم التخطيطي لجهاز الشفط لإزالة عالية الإنتاجية من السوائل التعقيم. للوضوح، لا يتم رسم أجزاء واحدة إلى الحجم. الحرف (أ) يشير إلى مضخة فراغ،(ب)زجاجة الخزان لجمع السوائل (الإيثانول، التبييض، أو المياه العقيمة)،(ج)صمام لتجنب ارتجاع السوائل،(D)العقيمة 200 ميكرولتر ماصة تلميح، و (ه) أنبوب الطرد الدقيق 1.5 مل تحتوي على البذور والتعقيم السائل. تشير الأسهم إلى اتجاه تدفق الهواء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. عالية الإنتاجية السائل تعقيم سطح البذور

ملاحظة: الإجراء العام والحد الأدنى من الوقت اللازم للتعقيم السطحي ل Arabidopsis thaliana (L.) Heynh البرية نوع (كول-0) (Arabidopsis) البذور مع 96 عينات مستقلة هي تلخيصها في الشكل 2.

  1. تسمية مع علامة دائمة دفعتين من أنابيب الطرد الدقيق 48 × 1.5 مل مع أرقام التدريجي.
  2. إضافة 100-200 بذور Arabidopsis إلى كل من أنابيب الطرد الدقيق 1.5 مل معقمة 96 (ما يقرب من 1-2 مم فوق الجزء السفلي من نهاية مخروطية من الأنبوب).
  3. Aliquot حوالي 1000 ميكرولتر من الإيثانول 70٪ في كل أنبوب باستخدام ماصة المصلية المعقمة 10 مل داخل غطاء محرك السيارة تدفق صفح (دفعة البذور واحد، 48 أنابيب) وإغلاق بعناية الأغطية.
    ملاحظة: الاستغناء عن الحلول لا تحتاج إلى أن تكون دقيقة للغاية، طالما أن حجم الاستغناء عدة مرات أعلى من حجم البذور. بدلا من ذلك، قم بتنفيذ هذه الخطوة خارج غطاء غطاء الرأس (حالة غير معقمة).
  4. هز الأنابيب على تردد التذبذب من 8.0 هرتز لمدة 3 دقائق على الأقل في شاكر.
  5. إزالة المحولات من شاكر ونقلها إلى سلة من جهاز الطرد المركزي على مقاعد البدلاء.
  6. تدور بسرعة أسفل البذور باستخدام وظيفة نبض (موجودة في معظم أجهزة الطرد المركزي benchtop) للوصول إلى 1880 × ز (~ 15 ق).
    ملاحظة: تؤثر قوى الطرد المركزي الأطول أو الأعلى سلبا على إنبات البذور.
  7. نقل أنابيب 48 من المحولات إلى رف واحد وفتح جميع الأنابيب تحت غطاء محرك السيارة تدفق صفح. تجنب التلوث بعدم لمس جزء من الأغطية المناسب في الأنابيب. إذا كانت الأغطية قريبة جدا من بعضها البعض، فقسم الأنابيب إلى رفين لتسهيل التعامل معها.
  8. تناسب العقيمة 200 μL تلميح أصفر على مدخل صمام الحوض من الطامح محلية الصنع تحت غطاء محرك السيارة تدفق صفح والتبديل على المضخة.
  9. أدخل الطرف الأصفر فوق مستوى البذور لتجنب لمس البذور عند مص السائل. بدلا من ذلك، بسرعة وضع طرف في الجزء السفلي من الأنبوب. إذا كانت البذور كتل شفط السائل، والقضاء على طرف أصفر وإدراج واحدة جديدة.
  10. Aliquot في كل أنبوب حوالي 1000 ميكرولتر من 5٪ التبييض باستخدام ماصة المصلية العقيمة 10 مل داخل غطاء محرك السيارة تدفق صفح.
  11. أغلق جميع الأغطية بإحكام وضع جميع الأنابيب مرة أخرى في محولات شاكر. هز الأنابيب على تردد التذبذب من 8.0 هرتز لمدة 3 دقائق على الأقل في شاكر.
  12. تدور بسرعة أسفل البذور باستخدام وظيفة نبض الطرد المركزي benchtop للوقت اللازم للوصول إلى 1880 × ز (~ 15 ق).
  13. تناسب العقيمة الجديدة 200 μL تلميح أصفر على صمام الحوض متصلة مضخة فراغ تحت غطاء محرك السيارة تدفق صفح، والتبديل على المضخة.
  14. أدخل الطرف الأصفر فوق مستوى البذور لتجنب لمس البذور عند مص محلول التبييض.
  15. Aliquot في كل أنبوب حول 1000 ميكرولتر من تعقيم H2O باستخدام ماصة المصلية المعقمة 10 مل في غطاء محرك السيارة تدفق صفح.
    ملاحظة: ضم دفعتين من البذور لتقليل وقت العملية.
  16. تناسب جديدة عقيمة 200 ميكرولتر تلميح أصفر على صمام الحوض متصلة مضخة فراغ تحت غطاء محرك السيارة تدفق صفح والتبديل على المضخة.
  17. إدراج طرف أصفر فقط فوق مستوى البذور لتجنب لمس البذور عند مص H2O.
  18. Aliquot في كل أنبوب حول 500 ميكرولتر من تعقيم H2O باستخدام ماصة المصلية المعقمة 10 مل وإغلاق جميع الأغطية في غطاء محرك السيارة تدفق صفح. البذور جاهزة للنواة. إذا لزم الأمر، والحفاظ على أنابيب في درجة حرارة الغرفة لبضع ساعات كحد أقصى أو في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  19. ملء زجاجة الخزان المستخدمة لجمع السائل مع كمية كافية من المياه وautclave ذلك. بعد ذلك، تجاهل السائل في بالوعة عادية.
    ملاحظة: أوتوكلاف السائل لقتل جميع البذور داخل الخزان.

figure-protocol-6841
الشكل 2:نظرة عامة على الإجراء والحد الأدنى من الوقت اللازم للتعقيم السطحي لبذور Arabidopsis مع 96 عينات مستقلة. وفي التجربة المقدمة، تعالج 96 عينة مستقلة على دفعتين متساويتي الحجم. الإجراء بأكمله هو نفسه لكلا الدفعتين، وتتم معالجتها بالتوازي، ولكن تتم معالجة الدفعة الثانية مع تأخير خطوة واحدة مقارنة بالدفعة الأولى. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

4. الطلاء وتسجيل Arabidopsis على لوحات MS 1/2

  1. نقل البذور و300-400 ميكرولتر من H2O المعقمة في طبق بيتري عن طريق الأنابيب لطيف مع ماصة 1000 ميكرولتر.
  2. بعد نقل 10 أنابيب، تصب في كل لوحة حول 1.5-2.0 مل من المتوسطة 1/2 MS الذائبة دون المضادات الحيوية.
    ملاحظة: تذوب مقدما ثم تبقى 1/2 MS ذاب المتوسطة في حمام الحرارة تعيين في 50-53 درجة مئوية لتجنب التجسيد. تأكد من أن درجة الحرارة لا تتجاوز 58 درجة مئوية لتجنب تقليل قابلية البذور للانبات.
  3. دوامة بسرعة لوحة لتوزيع البذور داخله. الشريط لوحات على طرفي نقيض.
  4. لف الأطباق في رقائق بلاستيكية أو الألومنيوم ثم وضعها في الثلاجة (4 درجة مئوية) لمدة 3 أيام في الظلام للحصول على الإنبات موحدة.
  5. نقل لوحات في غرفة النمو المحددة في 23 درجة مئوية في ظل ظروف اليوم الطويل (16 ساعة ضوء / 8 ساعة الظلام) مع كثافة الضوء من 100-120 ميكرومول ·م-2· ق-1 و 60٪ الرطوبة النسبية.
  6. بعد يومين، يسجل النباتات من خلال وجود الشقوق. الكشف عن ظهور شعاعي وتشكيل كوتيليدون الخضراء (فتح كامل من اثنين من cotyledons) لتقييم إنبات البذور.

5. التحليلات الإحصائية

ملاحظة: هنا، تم استخدام اختبار توكي الثنائي للتحليلات الإحصائية.

  1. النظر في القيم P أقل من 0.01 كما ذات دلالة إحصائية. إجراء جميع التجارب على الأقل مع خمس نسخ بيولوجية.

النتائج

من أجل تقييم الوقت اللازم لإجراء تعقيم البذور بأكمله ، تم حساب الاختلافات الزمنية للتعامل مع السائل 96 عينة في البروتوكول الحالي ومقارنتها مع طرق الأنابيب التقليدية. وتشير النتيجة إلى أن البروتوكول الحالي يوفر الوقت، مما يقلل من وقت المناولة السائلة إلى ربع ذلك مع البروتوكولات التقليدية<...

Discussion

تعقيم البذور هو الخطوة الأساسية للدراسات الوظيفية في Arabidopsis. على الرغم من أنه كثيرا ما يتم تنفيذها لأغراض مختلفة كثيرة، تتوفر دراسات محدودة على التعقيم السطحي للبذور عالية الإنتاجية في Arabidopsis.

حتى الآن، واحدة من الطرق ذات الإنتاجية العالية هي استخدام غاز الكلور الناتج عن خ?...

Disclosures

جميع المؤلفين لا يعلنون عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم تمويل هذا البحث من قبل مقاطعة ترينتو المستقلة من خلال التمويل الأساسي لمجموعة الاقتصاد البيئي التابعة لمنظمة فوندازيون ماخ.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Aquarium valveAmazonB074CYC5SDKit including 2 valves and thin-walled tubings. The valve prevents the liquids to go back to the sterile tip
Arabidopsis Col-0 wild-type seedsNottingham Arabidopsis Stock CenterN1093Wild type seeds (sensitive to kanamycin)
Arabidopsis transgenic line AdoIspS-79 seedsNANATransgenic line overexpressing an isoprene synthase gene from Arundo donax transformed in the Col-0 background, resistant to kanamycin (Li et al. (2017) Mol. Biol. Evol., 34, 2583–2599). Available on request from the authors
MicrocentrifugeEppendorfEP022628188Benchtop microcentrifuge used for spinning down the seeds
Murashige & Skoog medium including vitaminsDuchefaM0222Standard medium for plant sterile culture
Pipette controllerBrand26300Used to operate the serological pipette
Polyethylene tube 1Roth9591.1Tube for connection from vacuum pump to decantation bottle (inner diameter: 7 mm; outer diameter: 9 mm)
Polyethylene tube 2Roth9587.1Tube for connection from decantation bottle to the aquarium valve  (inner diameter: 5 mm; outer diameter: 7 mm)
Screw cap with connectorsRothPY86.12-way dispenser screw cap GL45 in polypropylene for decanting bottle
Serological pipetteBrand27823Graduated glass (reusable) serological pipette. Disposable pipettes can be used instead
Shakeret al.Qiagen85300TissueLyser II bead mill used normally for tissue homogenization. Without the addition of beads to the tubes it works as shaker.
Technical ethanolITW Reagents (Nova Chimica Srl)212800Ethanol 96% v/v partially denatured technical grade
Tween 20Merck Millipore655205Non-ionic detergent acting as surfactant
Universal tubing connectorsRothY523.1Can be used to improve/simplify tubing connections
Vacuum pumpMerck MilliporeWP6222050Used for making the suction device

References

  1. Somerville, C., Koornneef, M. A fortunate choice: The history of Arabidopsis as a model plant. Nature Reviews Genetics. 3 (11), 883-889 (2002).
  2. Koornneef, M., Meinke, D. The development of Arabidopsis as a model plant. Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).
  3. Initiative, T. A. G. Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature. 408 (6814), 796-815 (2000).
  4. Krysan, P. J., Young, J. C., Sussman, M. R. T-DNA as an insertional mutagen in Arabidopsis. Plant Cell. 11 (12), 2283-2290 (1999).
  5. Speulman, E., et al. A two-component enhancer-inhibitor transposon mutagenesis system for functional analysis of the arabidopsis genome. Plant Cell. 11 (10), 1853-1866 (1999).
  6. Jander, G., et al. Ethylmethanesulfonate saturation mutagenesis in Arabidopsis to determine frequency of herbicide resistance. Plant Physiology. 131 (1), 139-146 (2003).
  7. Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. -. S., Niu, Q. -. W., Chua, N. -. H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).
  8. Togninalli, M., et al. AraPheno and the AraGWAS catalog 2020: A major database update including RNA-Seq and knock-out mutation data for Arabidopsis thaliana. Nucleic Acids Research. 48 (1), 1063-1068 (2020).
  9. Lan, Y., et al. AtMAD: Arabidopsis thaliana multi-omics association database. Nucleic Acids Research. 49 (1), 1445-1451 (2021).
  10. Xu, J., Trainotti, L., Li, M., Varotto, C. Overexpression of isoprene synthase affects ABA-and drought-related gene expression and enhances tolerance to abiotic stress. International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 1-21 (2020).
  11. Czarnecki, O., et al. Simultaneous knock-down of six non-family genes using a single synthetic RNAi fragment in Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 12 (1), 1-11 (2016).
  12. Yan, L., et al. high-efficiency genome editing in arabidopsis using YAO promoter-driven CRISPR/Cas9 system. Molecular Plant. 8 (12), 1820-1823 (2015).
  13. Liu, Y., Gao, Y., Gao, Y., Zhang, Q. Targeted deletion of floral development genes in Arabidopsis with CRISPR/Cas9 using the RNA endoribonuclease Csy4 processing system. Horticulture Research. 6 (1), (2019).
  14. Grefen, C., et al. Subcellular localization and in vivo interactions of the Arabidopsis thaliana ethylene receptor family members. Molecular Plant. 1 (2), 308-320 (2008).
  15. Gazzani, S., et al. Evolution of MIR168 paralogs in Brassicaceae. BMC Evolutionary Biology. 9 (1), (2009).
  16. Lee, S., Korban, S. S. Transcriptional regulation of Arabidopsis thaliana phytochelatin synthase (AtPCS1) by cadmium during early stages of plant development. Planta. 215 (4), 689-693 (2002).
  17. Long, Y., et al. In vivo FRET-FLIM reveals cell-type-specific protein interactions in Arabidopsis roots. Nature. 548 (7665), 97-102 (2017).
  18. Freire-Rios, A., et al. Architecture of DNA elements mediating ARF transcription factor binding and auxin-responsive gene expression in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (39), 24557-24566 (2020).
  19. Rivero, L., et al. Handling arabidopsis plants: Growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses. Methods in Molecular Biology. 1062, 3-25 (2014).
  20. Chen, J. H., et al. Drought and salt stress tolerance of an arabidopsis glutathione S-transferase U17 knock-out mutant are attributed to the combined effect of glutathione and abscisic acid. Plant Physiology. 158 (1), 340-351 (2012).
  21. Li, D. Z., et al. Comparative analysis of a large dataset indicates that internal transcribed spacer (ITS) should be incorporated into the core barcode for seed plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (49), 19641-19646 (2011).
  22. Mathur, J., Koncz, C. Establishment and maintenance of cell suspension cultures. Arabidopsis Protocols. Methods in Molecular Biology. 82, 27-30 (1998).
  23. Li, M., Cappellin, L., Xu, J., Biasioli, F., Varotto, C. High-throughput screening for in planta characterization of VOC biosynthetic genes by PTR-ToF-MS. Journal of Plant Research. 133 (1), 123-131 (2020).
  24. Li, M., et al. In planta recapitulation of isoprene synthase evolution from ocimene synthases. Molecular Biology and Evolution. 34 (10), 2583-2599 (2017).
  25. Li, M., et al. Evolution of isoprene emission in Arecaceae (palms). Evolutionary Applications. 14, 902-914 (2020).
  26. Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum. 15 (3), 473-497 (1962).
  27. Bent, A. Arabidopsis thaliana floral dip transformation method. Methods in Molecular Biology. 343, 87-104 (2006).
  28. Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome. Nature. 488 (7409), 86-90 (2012).
  29. Tkacz, A., Cheema, J., Chandra, G., Grant, A., Poole, P. S. Stability and succession of the rhizosphere microbiota depends upon plant type and soil composition. ISME Journal. 9 (11), 2349-2359 (2015).
  30. Singh, N., Gaddam, S. R., Singh, D., Trivedi, P. K. Regulation of arsenic stress response by ethylene biosynthesis and signaling in Arabidopsis thaliana. Environmental and Experimental Botany. 185, 104408 (2021).
  31. Lindsey, B. E., Rivero, L., Calhoun, C. S., Grotewold, E., Brkljacic, J. Standardized method for high-throughput sterilization of Arabidopsis seeds. Journal of Visualized Experiments: JOVE. (128), e56587 (2017).
  32. Acemi, A., Özen, F. Optimization of in vitro asymbiotic seed germination protocol for Serapias vomeracea. The EuroBiotech Journal. 3 (3), 143-151 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

176

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved