Método de alto rendimiento, robusto y altamente flexible en el tiempo para la esterilización superficial de semillas de Arabidopsis

Resumen

Se proporciona un protocolo de alto rendimiento para la esterilización superficial de semillas de Arabidopsisthaliana (Arabidopsis), optimizando los pasos de manejo de líquidos con un dispositivo de succión simple construido con una bomba de vacío. Cientos de muestras de semillas pueden ser esterilizadas superficialmente en un día.

Resumen

Arabidopsis es, con mucho, la especie modelo de planta más utilizada para estudios funcionales. La esterilización superficial de las semillas de Arabidopsis es un paso fundamental requerido para este fin. Por lo tanto, es primordial establecer métodos de esterilización de la superficie de semillas de Arabidopsis de alto rendimiento para manejar decenas a cientos de muestras (por ejemplo, líneas transgénicas, ecotipos o mutantes) a la vez. En este estudio se presenta un método de esterilización de la superficie de la semilla basado en la eliminación eficiente de líquido en tubos con un dispositivo de succión casero construido a partir de una bomba de vacío común. Al reducir drásticamente el tiempo práctico intensivo en mano de obra con este método, es posible manejar varios cientos de muestras en un día con poco esfuerzo. Los análisis de series indicaron además un rango de tiempo altamente flexible de esterilización de superficies al mantener altas tasas de germinación. Este método podría adaptarse fácilmente para la esterilización superficial de otros tipos de semillas pequeñas con una simple personalización del dispositivo de succión de acuerdo con el tamaño de la semilla y la velocidad deseada para eliminar el líquido.

Introducción

Arabidopsis es una especie de planta diploide perteneciente a la familia Brassicaceae. Su ciclo de vida relativamente corto (dos meses por generación en condiciones de crecimiento de días largos), el pequeño tamaño de la planta y la autopolinización con la producción de cientos de semillas por planta la han convertido en la primera especie modelo de planta fundamental^1,2. Además, su genoma fue completamente secuenciado^3,extensas herramientas de genética inversa (ADN-T saturado, transposón y poblaciones químicamente mutagenizadas) están disponibles^4,5,6,y la transformación efectiva mediada por Agrobacteriumestá bien establecida para obtener suficientes líneas transgénicas para futuros trabajos aguas^{abajo 7} . Así, durante las últimas dos décadas, se han logrado grandes avances utilizando Arabidopsis como especie modelo para diseccionar diversos aspectos de la biología vegetal a nivel molecular, incluyendo la variación natural, genética y fenotípica^8,9.

Para caracterizar funcionalmente los genes de interés en Arabidopsis, la esterilización de la superficie de la semilla para eliminar los contaminantes fúngicos y bacterianos es el paso previo para muchos protocolos posteriores que requieren cultivos axénicos. La transformación genética para la sobreexpresión^10,knock-down (ARN-I¹¹⁾o knock-out (edición del genoma^12,13)de la función génica, localización subcelular^14,actividad promotora^15,16,proteína-proteína¹⁷ e interacción proteína-ADN^18,por citar solo las aplicaciones más comunes, todas requieren un paso de esterilización de la superficie de la semilla. Por lo tanto, a pesar de su relativa simplicidad, la esterilización de la superficie de la semilla juega un papel fundamental en muchos análisis funcionales.

Hasta ahora, se han desarrollado dos categorías principales de métodos de esterilización de la superficie de las semillas basados en la esterilización en fase gaseosa o líquida¹⁹. Si bien el rendimiento de la esterilización superficial de semillas en fase gaseosa es de medio a alto, el uso del peligroso reactivo gas cloro como agente de esterilización superficial ha obstaculizado su amplia aplicación. Los métodos basados en la esterilización en fase líquida, por el contrario, se basan en productos químicos más suaves como el etanol y las soluciones de lejía para la esterilización de superficies, y se utilizan más ampliamente a pesar de que tienen un rendimiento inherentemente menor que la fumigación con cloro. En general, se utilizan comúnmente dos métodos diferentes que utilizan reactivos líquidos. Un método muy utilizado se basa en el lavado con etanol y lejía a diferentes concentraciones durante diferentes períodos de tiempo^20,21. Otro método se basa en la aplicación de lejía solo^21,22. Ambos métodos se aplican principalmente para la esterilización de la superficie de semillas a pequeña escala. Sin embargo, en muchos experimentos, es necesario cribar muchas líneas transgénicas de Arabidopsis derivadas de una transformación^15,23 o cribar en paralelo muchas líneas transgénicas generadas a partir de diferentes transformaciones^24,25. Hasta donde sabemos, no se ha publicado ningún método a base de líquido para la esterilización de superficies de semillas de alto rendimiento, lo que constituye, aunque poco reconocido, un cuello de botella importante para los enfoques de genómica funcional. Por lo tanto, el desarrollo de métodos seguros, robustos y de alto rendimiento para la esterilización de la superficie de las semillas es un paso necesario y crítico hacia el éxito de la caracterización funcional de muchos genes a la vez.

Con este fin, en el estudio actual, se presenta un método mejorado para la esterilización superficial de semillas de Arabidopsis. Este método es seguro, de bajo costo, altamente robusto y de alto rendimiento, lo que permite manejar 96 líneas independientes dentro de una hora desde el comienzo de la esterilización de la superficie de la semilla hasta el final de la siembra de semillas en placas de Petri. El método demostrado se basa en instrumentación de laboratorio básica ampliamente disponible, como una bomba de vacío, cristalería consumible y artículos de plástico. Este método mejorado proporciona a la comunidad científica un enfoque seguro, simple y asequible para agilizar la esterilización de la superficie de las semillas con un rendimiento adecuado a los enfoques modernos de genómica funcional en Arabidopsis y otras especies de plantas no modelo.

Protocolo

1. Reactivos y preparación de medios

1. Preparar solución de etanol al 70%: Añadir 737 mL de etanol técnico al 95% a 263 mL de agua destilada. Homogeneizar.
   NOTA: Prepare una solución de etanol al 70% en un banco de trabajo no estéril.
   PRECAUCIÓN: El etanol es altamente inflamable y puede causar irritación grave en los ojos. Mantener alejado de llamas y fuentes de calor. En caso de contacto con los ojos, enjuague con abundante agua.
2. Prepare una solución de lejía al 5%: Agregue 5 ml de lejía doméstica (que contenga ~ 3.5% de hipoclorito de sodio, NaClO) a 95 ml de agua destilada estéril. Agregue unas gotas de detergente no iónico (por ejemplo, Tween 20) y mezcle bien.
   NOTA: Prepare una solución de lejía al 5% dentro de la campana laminar.
   PRECAUCIÓN: El hipoclorito de sodio, el componente activo de la lejía, es altamente irritante. Es altamente corrosivo y puede causar daños graves al tracto gastrointestinal. En caso de contacto, enjuague inmediatamente con abundante agua. En caso de ingestión, llame al centro de control de intoxicaciones o a un médico para obtener asesoramiento sobre el tratamiento.
3. Preparar Murashige de media fuerza y Skoog (1/2 MS) medio²⁶.
   1. Añadir 2,2 g de polvo medio de EM (incluidas las vitaminas) y 10 g de sacarosa en 800 ml de agua destilada. Ajuste el pH de la solución usando 1 M KOH y lleve el volumen hasta 1 L usando agua destilada. Alícuota 500 ml en una botella de 1 L y agregue 4 g de agar para preparar un medio sólido. Autoclave la solución.
   2. Después del autoclave, enfríe el medio a 50-53 ° C en un baño de agua y viértalo en placas de Petri debajo de la campana de flujo laminar. Para preparar el medio selectivo, agregue 1000 μL/L de solución madre de kanamicina de 50 mg/ml (mezcle 500 mg de sulfato de kanamicina monohidrato en 10 ml de agua destilada, filtre y almacene a -20 °C) al medio (50-53 °C). Mezcle bien girando y vierta en placas de Petri como se mencionó anteriormente.

2. Configuración del aspirador

NOTA: La configuración del instrumento se resume en la Figura 1.

1. Conecte la entrada de la bomba de vacío a un extremo de un tubo de polietileno (PE) de tamaño adecuado. Conecte el otro extremo del tubo a la salida de la tapa bidireccional de la botella de decantación. Envuelva la unión del tubo herméticamente con una película de sellado(Tabla de materiales)para garantizar una conexión hermética.
2. Conecte un segundo tubo de PE a la entrada (el orificio que sobresale al interior de la botella) del tapón de rosca de la botella de decantación. Ajuste el otro lado del tubo a la salida de una válvula de acuario. Si es necesario, envuélvalo con una película de sellado a lo largo de la unión para eliminar las fugas de aire.
3. Justo antes de usar, coloque una punta de pipeta estéril de 200 μL en la entrada del filtro del acuario debajo de la campana de flujo laminar.

Figura 1: Dibujo esquemático del dispositivo de succión para la eliminación de líquidos de esterilización de alto rendimiento. Para mayor claridad, las partes individuales no se dibujan a escala. La letra (A) indica la bomba de vacío, (B) la botella del depósito para recoger líquidos (etanol, lejía o agua estéril), (C) la válvula para evitar el reflujo de los líquidos, (D) la punta estéril de la pipeta de 200 μL, y (E) el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contiene semillas y líquido de esterilización. Las flechas indican la dirección del flujo de aire. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Esterilización de superficie líquida de alto rendimiento de semillas

NOTA: El procedimiento general y el tiempo mínimo requerido para la esterilización superficial de las semillas de Arabidopsis thaliana (L.) Heynh de tipo silvestre (Col-0) (Arabidopsis) con 96 muestras independientes se resumen en la Figura 2.

1. Etiquete con un marcador permanente dos lotes de tubos de microcentrífuga de 48 x 1,5 ml con números progresivos.
2. Agregue 100-200 semillas de Arabidopsis a cada uno de los 96 tubos estériles de microcentrífuga de 1,5 ml (aproximadamente 1-2 mm por encima de la parte inferior del extremo cónico del tubo).
3. Alícuota alrededor de 1000 μL de etanol al 70% en cada tubo utilizando una pipeta serológica estéril de 10 ml dentro de la campana de flujo laminar (lote de semilla uno, 48 tubos) y cierre cuidadosamente las tapas.
   NOTA: La dispensación de las soluciones no necesita ser extremadamente precisa, siempre y cuando el volumen dispensado sea varias veces mayor que el volumen de semillas. Alternativamente, realice este paso fuera de la campana laminar (condición no estéril).
4. Agite los tubos a una frecuencia de oscilación de 8.0 Hz durante al menos 3 minutos en un agitador.
5. Retire los adaptadores del agitador y transfiéralos a la cesta de una microcentrífuga de sobremesa.
6. Gire rápidamente las semillas utilizando la función de pulso (presente en la mayoría de las centrífugas de sobremesa) para alcanzar 1880 x g (~ 15 s).
   NOTA: El tiempo más largo o las fuerzas de centrifugación más altas afectan negativamente la germinación de las semillas.
7. Transfiera los 48 tubos de los adaptadores a un bastidor y abra todos los tubos debajo de la campana de flujo laminar. Evite contaminaciones al no tocar la parte de las tapas que encajan en los tubos. Si las tapas están demasiado cerca unas de otras, divida los tubos en dos bastidores para facilitar el manejo.
8. Coloque una punta amarilla estéril de 200 μL en la entrada de la válvula de acuario del aspirador casero debajo de la campana de flujo laminar y encienda la bomba.
9. Inserte la punta amarilla justo por encima del nivel de las semillas para evitar tocar las semillas al chupar el líquido. Alternativamente, coloque rápidamente la punta en la parte inferior del tubo; si una semilla bloquea la succión del líquido, elimine la punta amarilla e inserte una nueva.
10. Alícuota en cada tubo alrededor de 1000 μL de lejía al 5% utilizando una pipeta serológica estéril de 10 ml dentro de la campana de flujo laminar.
11. Cierre herméticamente todas las tapas y vuelva a colocar todos los tubos en los adaptadores del agitador. Agite los tubos a una frecuencia de oscilación de 8.0 Hz durante al menos 3 minutos en el agitador.
12. Gire rápidamente las semillas utilizando la función de pulso de la centrífuga de sobremesa durante el tiempo necesario para alcanzar 1880 x g (~ 15 s).
13. Coloque una nueva punta amarilla estéril de 200 μL en la válvula de acuario conectada a la bomba de vacío debajo de la campana de flujo laminar y encienda la bomba.
14. Inserte la punta amarilla por encima del nivel de las semillas para evitar tocar las semillas al succionar la solución de lejía.
15. Alícuota en cada tubo alrededor de 1000 μL de H₂O esterilizado utilizando una pipeta serológica estéril de 10 ml en la campana de flujo laminar.
    NOTA: Combine los dos lotes de semillas para minimizar el tiempo de operación.
16. Coloque una nueva punta amarilla estéril de 200 μL en la válvula de acuario conectada a la bomba de vacío debajo de la campana de flujo laminar y encienda la bomba.
17. Inserte la punta amarilla justo por encima del nivel de las semillas para evitar tocar las semillas al chupar el H₂O.
18. Alícuota en cada tubo alrededor de 500 μL de H₂O esterilizado utilizando una pipeta serológica estéril de 10 ml y cierre todas las tapas de la campana de flujo laminar. Las semillas están listas para ser sembradas. Si es necesario, mantenga los tubos a temperatura ambiente durante unas horas como máximo o a 4 °C durante la noche.
19. Llene la botella del depósito utilizada para recoger el líquido con una cantidad adecuada de agua y hágalo en autoclave. Después, deseche el líquido en un fregadero normal.
    NOTA: Autoclave el líquido para matar todas las semillas dentro del reservorio.

Figura 2: Descripción general del procedimiento y tiempo mínimo requerido para la esterilización superficial de semillas de Arabidopsis con 96 muestras independientes. En el experimento presentado, se manejan 96 muestras independientes en dos lotes de igual tamaño. Todo el procedimiento es el mismo para ambos lotes, y se procesan en paralelo, pero el lote dos se procesa con un retraso de un paso en comparación con el lote uno. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Chapado y puntuación de Arabidopsis en placas de 1/2 MS

1. Transfiera las semillas y 300-400 μL de H₂O estéril a una placa de Petri mediante pipeteo suave con una pipeta de 1000 μL.
2. Después de transferir 10 tubos, vierta en cada placa alrededor de 1.5-2.0 ml de medio derretido de 1/2 MS sin antibióticos.
   NOTA: Derrita por adelantado y luego mantenga el medio fundido 1/2 MS en un baño termostático a 50-53 ° C para evitar la solidificación. Asegúrese de que la temperatura no supere los 58 °C para evitar disminuir la germinabilidad de las semillas.
3. Revuelva rápidamente el plato para distribuir las semillas dentro de él. Pega las placas en lados opuestos.
4. Envuelva las placas en un papel de plástico o aluminio y luego colóquelas en un refrigerador (4 ° C) durante 3 días en la oscuridad para obtener una germinación uniforme.
5. Transfiera las placas a una cámara de crecimiento a 23 °C en condiciones de día largo (16 h de luz/8 h de oscuridad) con una intensidad de luz de 100-120 μmol·m^-2·s^-1 y 60% de humedad relativa.
6. Después de dos días, puntúe las plantas por la presencia de radículas. Detectar la emergencia radicular y la formación de cotiledón verde (apertura completa de los dos cotiledones) para evaluar la germinación de la semilla.

5. Análisis estadísticos

NOTA: Aquí, se utilizó la prueba por pares de Tukey para los análisis estadísticos.

1. Considere los valores de P por debajo de 0,01 como estadísticamente significativos. Realice todos los experimentos al menos con cinco réplicas biológicas.

Resultados

Con el fin de evaluar el tiempo requerido para todo el procedimiento de esterilización de semillas, se calcularon las diferencias de tiempo para el manejo de líquidos 96 muestras en el protocolo actual y se compararon con los métodos tradicionales de pipeteo. El resultado indica que el protocolo actual ahorra tiempo, reduciendo el tiempo de manipulación de líquidos a una cuarta parte del de los protocolos tradicionales(Tabla 1). La tabla destaca además que el tiempo de eliminación de líquidos en ...

Discusión

La esterilización de semillas es el paso fundamental para los estudios funcionales en Arabidopsis. Aunque con frecuencia se lleva a cabo para muchos propósitos diferentes, se dispone de estudios limitados sobre la esterilización de la superficie de semillas de alto rendimiento en Arabidopsis.

Hasta ahora, uno de los métodos con mayor rendimiento es el uso de gas cloro generado por la mezcla de lejía con HCl concentrado. Aunque este método requiere un tiempo práctico limitado, utiliza un...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aquarium valve	Amazon	B074CYC5SD	Kit including 2 valves and thin-walled tubings. The valve prevents the liquids to go back to the sterile tip
Arabidopsis Col-0 wild-type seeds	Nottingham Arabidopsis Stock Center	N1093	Wild type seeds (sensitive to kanamycin)
Arabidopsis transgenic line AdoIspS-79 seeds	NA	NA	Transgenic line overexpressing an isoprene synthase gene from Arundo donax transformed in the Col-0 background, resistant to kanamycin (Li et al. (2017) Mol. Biol. Evol., 34, 2583–2599). Available on request from the authors
Microcentrifuge	Eppendorf	EP022628188	Benchtop microcentrifuge used for spinning down the seeds
Murashige & Skoog medium including vitamins	Duchefa	M0222	Standard medium for plant sterile culture
Pipette controller	Brand	26300	Used to operate the serological pipette
Polyethylene tube 1	Roth	9591.1	Tube for connection from vacuum pump to decantation bottle (inner diameter: 7 mm; outer diameter: 9 mm)
Polyethylene tube 2	Roth	9587.1	Tube for connection from decantation bottle to the aquarium valve  (inner diameter: 5 mm; outer diameter: 7 mm)
Screw cap with connectors	Roth	PY86.1	2-way dispenser screw cap GL45 in polypropylene for decanting bottle
Serological pipette	Brand	27823	Graduated glass (reusable) serological pipette. Disposable pipettes can be used instead
Shakeret al.	Qiagen	85300	TissueLyser II bead mill used normally for tissue homogenization. Without the addition of beads to the tubes it works as shaker.
Technical ethanol	ITW Reagents (Nova Chimica Srl)	212800	Ethanol 96% v/v partially denatured technical grade
Tween 20	Merck Millipore	655205	Non-ionic detergent acting as surfactant
Universal tubing connectors	Roth	Y523.1	Can be used to improve/simplify tubing connections
Vacuum pump	Merck Millipore	WP6222050	Used for making the suction device