シロイヌナズナ種子の表面滅菌のための高スループット、堅牢で高い時間融性の高い方法

要約

シロイヌズナ(シロイヌズナ)種子の表面滅菌のためのハイスループットプロトコルが提供され、真空ポンプで構成された簡単な吸引装置で液体処理ステップを最適化する。何百もの種子サンプルを1日で表面滅菌することができます。

要約

シロイヌナズナは、機能研究に最も広く使用されている植物モデル種です。シロイヌナズナの種子の表面滅菌は、この目的に向かって必要とされる基本的なステップです。したがって、数十~数百個のサンプル(トランスジェニックライン、エコタイプ、または変異体)を一度に処理するハイスループットシロイヌナズナシス種子表面滅菌法を確立することが最も重要です。一般的な真空ポンプから構築された自家製の吸引装置を用いたチューブ内の液体の効率的な除去に基づく種子表面滅菌法を本研究で紹介する。この方法で、1日に数百個のサンプルを処理することで、労働集約的なハンズオン時間を劇的に短縮することで、少しの労力で可能になります。シリーズタイムコース分析は、高い発芽率を維持することにより、表面滅菌の非常に柔軟な時間範囲をさらに示しました。この方法は、種子サイズに応じて吸引装置の簡単なカスタマイズ、および液体を排除するために望まれる速度で、他の種類の小さな種子の表面滅菌に容易に適応することができる。

概要

シロイヌナズナは、ブラッシカ科に属する二分植物種です。その比較的短いライフサイクル(長い日の成長条件下で一世代あたり2ヶ月)、小さな植物のサイズ、および植物ごとに何百もの種子の生産と自己受粉は、それを最初の基本的な植物モデル種^1、2にしました。さらに、そのゲノムは^{完全に配列}3であり、広範な逆遺伝学ツール(飽和T-DNA、トランスポゾン、および化学的変異体化された集団)が利用可能である^4、5、6、および効果的なアグロバクテリウム媒介変換は、さらに下流作業のための十分なトランスジェニックラインを得るために十分確立されている⁷ .したがって、過去20年間に、自然、遺伝的、表現型のバリエーション^8、9を含む分子レベルで植物生物学の多様な側面を解剖するためのモデル種としてシロイヌナズナシスを使用して大きな進歩が達成されました。

シロイヌナズナの目的の遺伝子を機能的に特徴付けるためには、種子表面滅菌は、無菌培養を必要とする多くの下流プロトコルの前提条件となる真菌および細菌汚染物質を排除する。過剰発現¹⁰に対する遺伝的形質転換は、ノックダウン(RNA-I11)またはノックアウト(ゲノム編集^12、13)の遺伝子機能、細胞内局在化^14、プロモーター活性^15、16、タンパク質タンパク質¹⁷およびタンパク質-DNA相互作用¹⁸の、最も一般的な用途のみを引用し、すべて種子表面滅菌工程を必要とする。したがって、その相対的な単純さにもかかわらず、種子表面滅菌は、多くの機能解析において基本的な役割を果たす。

これまで、2つの主要なカテゴリーの種子表面滅菌方法が、気相滅菌法または液相滅菌^法19に基づいて開発されてきた。ガス相シード表面滅菌のスループットは中~高であるが、有害試薬塩素ガスを表面殺菌剤として用いることは、その広い用途を妨げている。逆に液相殺菌に基づく方法は、表面殺菌のためにエタノールや漂白剤溶液のような穏やかな化学物質に依存しており、塩素燻蒸よりも本質的に低い効率を有するにもかかわらず、より広く使用されています。一般に、液体試薬を用いる2つの異なる方法が一般的に使用されている。1つの主に使用される方法は、時間^20、21の異なる期間の異なる濃度でエタノール^と漂白剤で洗浄に基づいている。別の方法は、漂白剤のみの^21、22の適用に基づいています。どちらの方法も主に小規模な種子表面滅菌に適用されます。しかしながら、多くの実験において、1つの変換^15、23、または画面から得られる多くのシロイヌナズナのトランスジェニックラインを^、異なる変換^24,25から生成される多くのトランスジェニックラインを並行してスクリーニングする必要がある。我々の知る限りでは、高スループット種子表面滅菌のための液体ベースの方法は公開されておらず、これはほとんど認識されていないが、機能的ゲノミクスのアプローチのための重要なボトルネックである。したがって、種子表面滅菌のための安全で堅牢で高スループットな方法を開発することは、一度に多くの遺伝子の機能的特性評価の成功に向けて必要かつ重要なステップです。

この目的のために、現在の研究では、シロイヌナズナの種子の表面滅菌のための改善された方法が提示される。この方法は安全で、低コストで、非常に堅牢で、高スループットで、種表面滅菌の初めからペトリ皿の種子播種の終わりまで1時間以内に96本の独立したラインを取り扱うことを可能にします。この方法は、真空ポンプ、消耗品、プラスチック製品などの広く利用可能な基本的な実験室機器に依存しています。この改良された方法は、シロイヌナプシスおよび他の非モデル植物種における近代的な機能的ゲノミクスアプローチに十分なスループットを備えた種子表面滅菌を合理化するための安全でシンプルで手頃な価格のアプローチを科学界に提供する。

プロトコル

1. 試薬および媒体調製

1. 70%エタノール溶液を調製:蒸留水263mLに95%のテクニカルエタノールの737 mLを加えます。よく混ぜます。
   注:無菌の作業台に70%エタノール溶液を準備してください。
   注意:エタノールは非常に可燃性であり、目に深刻な刺激を引き起こす可能性があります。炎や熱源から遠ざけてください。目に触れた場合は、豊富な水ですすいでください。
2. 5%漂白液を調製する:家庭用漂白剤5mL(次亜塩素酸ナトリウム、NaClOの約3.5%を含む)を95mLの滅菌蒸留水に加えます。非イオン性洗剤(例えば、Tween 20)を数滴加え、十分に混ぜます。
   注:ラミナーフードの中に5%の漂白剤溶液を準備してください。
   注意:漂白剤の活性成分である次亜塩素酸ナトリウムは、非常に刺激性が高い。それは非常に腐食性であり、胃腸管に深刻な損傷を引き起こす可能性があります。接触した場合は、すぐに豊富な水ですすいでください。摂取の場合は、毒物管理センターまたは医師に相談して治療のアドバイスを受けてください。
3. ハーフストレングスムラシゲとスクーグ(1/2 MS)培地²⁶を準備します。
   1. 蒸留水800mLにMS培地パウダー2.2g(ビタミンを含む)と10gのスクロースを加えます。1 M KOH を使用して溶液の pH を調整し、蒸留水を使用して 1 L までの体積を持って下さい。アリコート500mLを1Lボトルに入れ、4gの寒天を加えて固体培地を調製する。ソリューションをオートクレーブします。
   2. オートクレーブした後、水浴で媒体を50〜53°Cに冷却し、層流フードの下のペトリ皿に注ぎます。選択培地を調製するには、50mg/mLカナマイシンストック溶液の1000μL/Lを加える(蒸留水10mLに500mgのカナマイシン硫酸一水和物を混ぜ、フィルター滅菌して-20°Cで保存する)培地(50-53°C)に入れる。渦巻いてよく混ぜ、前に述べたようにペトリ料理に注ぎます。

2. 吸引器のセットアップ

メモ: 計測器のセットアップは 図 1に要約されています。

1. 真空ポンプの入口を適当なサイズのポリエチレン(PE)チューブの一端に接続します。チューブのもう一方の端を、デカンテーションボトルの双方向蓋の出口に接続します。チューブの接合部を密閉フィルム(材料表)でしっかりと包み込み、気密接続を確保します。
2. 2番目のPEチューブをデカンテーションボトルのスクリューキャップの入口(ボトルの内側に突き出た穴)に接続します。チューブの反対側を水槽バルブの出口に合わせます。必要に応じて、接合部に沿ってシールフィルムで包み、空気漏れを除去します。
3. 使用直前に、薄層流れフードの下の水槽フィルターの入口に滅菌200 μLピペットチップを取り付けます。

図1:滅菌液の高スループット除去用吸引装置の模式図。わかりやすくするために、単一の部品はスケールに描画されません。レター(A)は真空ポンプ、(B)リザーバーボトルが液体(エタノール、漂白剤、滅菌水)を集め、液体の還流を避けるバルブ、滅菌200μLピペットチップ、および(E)種子および滅菌液を含む1.5 mLマイクロ遠心チューブを示す。矢印は、気流の方向を示します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

種子の3スループットの高い液体表面滅菌

注:全体的な手順と 96 独立したサンプルを持つヒリン野生型(Col-0)(シロイヌナズナシス)種子の表面滅菌に必要な最小の時間を 図2にまとめます。

1. 永久的なマーカーの48 x 1.5 mLのマイクロ遠心分離管の2つのバッチが進歩的な数とラベル。
2. 96個の無菌1.5 mLマイクロ遠心分離チューブ(チューブの円錐端の底面から約1〜2mm)のそれぞれに100-200シビジ種子を加えます。
3. アリコート 70% エタノールの約 1000 μL を各チューブに 10 mL の滅菌血清学的ピペットを使用して、ラミナーフローフード (シード バッチ 1,48 チューブ) を使用し、慎重に蓋を閉じます。
   注:分配された容積が種子の量の数倍高い限り、ソリューションを分配することは非常に正確である必要はありません。あるいは、このステップを層状フードの外側(非滅菌状態)で行う。
4. シェーカーで少なくとも3分間、8.0 Hzの振動周波数でチューブを振ります。
5. シェーカーからアダプターを取り外し、ベンチトップマイクロ遠心分離機のバスケットに移します。
6. パルス関数(ほとんどのベンチトップ遠心分離機に存在する)を使用して種子を素早くスピンダウンし、1880 x g(〜15 s)に達します。
   注: 長い時間またはそれ以上の遠心力は、種子の発芽に悪影響を与えます。
7. アダプターから 48 個のチューブを 1 つのラックに移し、すべてのチューブを層流フードの下に開きます。チューブに取り付けられる蓋の部分に触れないでください。蓋が互いに近すぎる場合は、チューブを2つのラックに分割して取り扱いが容易にします。
8. 滅菌200 μL黄色の先端を、ラミナーフローフードの下の自家製アスピレーターのアクアリウムバルブ入口に取り付け、ポンプのスイッチを入れます。
9. 黄色の先端を種子のレベルのすぐ上に挿入して、液体を吸うときに種子に触れないようにします。または、先端をチューブの下部に素早く配置します。種子が液体の吸引をブロックする場合は、黄色の先端を排除し、新しいものを挿入します。
10. アリコートは、層流フード内の10 mL滅菌血清学的ピペットを使用して、5%漂白剤の約1000 μLの各チューブに入る。
11. すべての蓋をしっかりと閉じ、すべてのチューブをシェーカーアダプターに戻します。シェーカーで少なくとも3分間、8.0 Hzの振動周波数でチューブを振ります。
12. 1880 x g (~15 s) に達するために必要な時間のベンチトップ遠心分離機のパルス関数を使用して、種子を素早くスピンダウンします。
13. 新しい滅菌200 μL黄色の先端を、層流フードの下の真空ポンプに接続された水槽バルブに取り付け、ポンプをスイッチします。
14. 漂白剤溶液を吸うときに種子に触れないように、種子のレベルの上に黄色の先端を挿入します。
15. アリコートは、層流フード内の10 mLの無菌血清ピペットを使用して、1000 μLの殺菌されたH₂Oの周りに各チューブに入る。
    注: 2 つのシード バッチを組み合わせて、操作時間を最小限に抑えます。
16. 新しい滅菌200 μL黄色の先端を、層流フードの下の真空ポンプに接続された水槽バルブに取り付け、ポンプのスイッチを入れます。
17. H2 Oを吸うときに種子に触れないように、種子のレベルのすぐ上に黄色の先端を挿入します。
18. アリコートは、10 mLの滅菌血清学的ピペットを使用して、滅菌された_H2Oの約500 μLの各チューブに入り、層流フード内のすべての蓋を閉じる。種をまく準備ができています。必要に応じて、チューブを室温で数時間、または一晩4 °Cに保ちます。
19. 十分な量の水で液体を収集するために使用される貯水池のボトルを充填し、それをオートクレーブ。その後、液体を通常のシンクに捨てます。
    注:リザーバ内のすべての種子を殺すために液体をオートクレーブ。

図2:96個の独立サンプルを用いたシロイヌナズナ種子の表面滅菌に必要な手順と最小時間の概要。 提示された実験では、96個の独立したサンプルが2つの等しいサイズのバッチで処理されます。手順全体は両方のバッチで同じで、並列処理されますが、バッチ 2 はバッチ 1 と比較して 1 ステップの遅延で処理されます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

4. 1/2 MSプレート上のシロイヌナズナのめっきとスコアリング

1. 種子と300-400 μLの滅菌_H2Oをペトリ皿に移し、1000 μLピペットで優しくピペットを入れます。
2. 10本のチューブを移管した後、抗生物質なしで溶かした1/2 MS培地の1.5〜2.0 mLの周りに各プレートに注ぎます。
   注:固まりを避けるために、予め溶融し、その後、50〜53°Cに設定されたサーモスタットバスに1/2 MS溶融培地を保ちます。種子の発芽性を低下させないために、温度が58°Cを超えないようにしてください。
3. すぐにプレートを旋回して、その中に種子を分配します。反対側のプレートをテープで貼ります。
4. プレートをプラスチックまたはアルミホイルで包み、暗闇の中で3日間冷蔵庫(4°C)に入れて均一な発芽を得ます。
5. 100-120 μmol·m^-2·s^-1 と60%相対湿度の光強度で長い日の条件(16時間光/8時間暗)の下で23°Cに設定された成長チャンバーにプレートを移します。
6. 2日後、ラジクルの存在によって植物をスコア付けします。ラジクルの出現と緑色のコチルドン形成(2つのコチルドンの完全な開口部)を検出して、種子の発芽を評価します。

5. 統計分析

注:ここでは、Tukeyの対次検定を統計的分析に使用しました。

1. 0.01 未満の P 値は統計的に有意であると考えてください。少なくとも5つの生物学的複製ですべての実験を行う。

結果

種子滅菌手順全体に要する時間を評価するために、現在のプロトコルにおける液体処理96サンプルの時間差を計算し、従来のピペット法と比較した。この結果は、現在のプロトコルが時間を節約し、従来のプロトコルで液体処理時間をその 4 分の 1 に短縮することを示しています (表 1)。この表はさらに、現在のプロトコルの液体除去時間は、従来の方法よりも多くの時間を節約?...

ディスカッション

種子の滅菌は、シロイヌナズナの機能研究の基本的なステップです。多くの異なる目的のために頻繁に行われますが、シロイヌズナでのハイスループット種子表面滅菌に関する限定的な研究が可能です。

これまで、最も高いスループットを有する方法の1つは、漂白剤と濃縮HClを混合して発生した塩素ガスを用いることで行なわれた。この方法は、限られた実務時間を必?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aquarium valve	Amazon	B074CYC5SD	Kit including 2 valves and thin-walled tubings. The valve prevents the liquids to go back to the sterile tip
Arabidopsis Col-0 wild-type seeds	Nottingham Arabidopsis Stock Center	N1093	Wild type seeds (sensitive to kanamycin)
Arabidopsis transgenic line AdoIspS-79 seeds	NA	NA	Transgenic line overexpressing an isoprene synthase gene from Arundo donax transformed in the Col-0 background, resistant to kanamycin (Li et al. (2017) Mol. Biol. Evol., 34, 2583–2599). Available on request from the authors
Microcentrifuge	Eppendorf	EP022628188	Benchtop microcentrifuge used for spinning down the seeds
Murashige & Skoog medium including vitamins	Duchefa	M0222	Standard medium for plant sterile culture
Pipette controller	Brand	26300	Used to operate the serological pipette
Polyethylene tube 1	Roth	9591.1	Tube for connection from vacuum pump to decantation bottle (inner diameter: 7 mm; outer diameter: 9 mm)
Polyethylene tube 2	Roth	9587.1	Tube for connection from decantation bottle to the aquarium valve  (inner diameter: 5 mm; outer diameter: 7 mm)
Screw cap with connectors	Roth	PY86.1	2-way dispenser screw cap GL45 in polypropylene for decanting bottle
Serological pipette	Brand	27823	Graduated glass (reusable) serological pipette. Disposable pipettes can be used instead
Shakeret al.	Qiagen	85300	TissueLyser II bead mill used normally for tissue homogenization. Without the addition of beads to the tubes it works as shaker.
Technical ethanol	ITW Reagents (Nova Chimica Srl)	212800	Ethanol 96% v/v partially denatured technical grade
Tween 20	Merck Millipore	655205	Non-ionic detergent acting as surfactant
Universal tubing connectors	Roth	Y523.1	Can be used to improve/simplify tubing connections
Vacuum pump	Merck Millipore	WP6222050	Used for making the suction device