تطوير نموذج الزراعة المشتركة للخلايا لمحاكاة نقص تروية القلب / التروية في المختبر

Summary

المسافة المكانية هي معلمة رئيسية في تقييم إصابة نقص الأكسجة / إعادة الأكسجين في نموذج الزراعة المشتركة لطبقات الخلايا البطانية وخلايا عضلة القلب المنفصلة ، مما يشير ، لأول مرة ، إلى أن تحسين البيئة المكانية للزراعة المشتركة ضروري لتوفير نموذج موات في المختبر لاختبار دور الخلايا البطانية في حماية الخلايا العضلية القلبية.

Abstract

مرض القلب الإقفاري هو السبب الرئيسي للوفاة والعجز في جميع أنحاء العالم. يسبب التروية إصابة إضافية تتجاوز نقص التروية. يمكن للخلايا البطانية (ECs) حماية الخلايا العضلية القلبية (CMs) من إصابة التروية من خلال التفاعلات بين الخلايا الخلوية. يمكن أن تساعد الثقافات المشتركة في التحقيق في دور التفاعلات بين الخلايا والخلايا. الزراعة المشتركة المختلطة هي أبسط نهج ولكنها محدودة لأن العلاجات المعزولة والتحليلات النهائية لأنواع الخلايا المفردة غير ممكنة. للتحقق مما إذا كان بإمكان ECs تخفيف تلف خلايا CM اعتمادا على الجرعة وما إذا كان يمكن تحسين هذه الحماية بشكل أكبر عن طريق تغيير مسافة الاتصال بين خطي الخلايا ، استخدمنا الخلايا البطانية للشريان التاجي الأولي للماوس والخلايا العضلية القلبية للفأر البالغ لاختبار ثلاثة أنواع من إدخالات زراعة الخلايا التي تختلف في مسافة الطبقة بين الخلايا عند 0.5 ، 1.0 ، و 2.0 مم ، على التوالي. في CMs فقط ، زادت الإصابة الخلوية كما تم تقييمها بواسطة إطلاق نازعة هيدروجيناز اللاكتات (LDH) بشكل كبير أثناء نقص الأكسجة وعند إعادة الأكسجين عندما كانت المسافة 2.0 مم مقارنة ب 0.5 و 1.0 مم. عندما كانت ECs و CMs على اتصال مباشر تقريبا (0.5 مم) ، لم يكن هناك سوى تخفيف خفيف لإصابة إعادة الأكسجين ل CMs بعد نقص الأكسجة. مع مسافة 2.0 مم ، خففت ECs إصابة CM أثناء كل من نقص الأكسجة ونقص الأكسجة / إعادة الأكسجين ، مما يشير إلى أن التباعد الثقافي الكافي ضروري ل ECs للتحدث مع CMs ، بحيث يمكن لجزيئات الإشارة المفرزة أن تدور وتحفز المسارات الوقائية بالكامل. تشير النتائج التي توصلنا إليها ، لأول مرة ، إلى أن تحسين البيئة المكانية للثقافة المشتركة بين EC / CM أمر ضروري لتوفير نموذج موات في المختبر لاختبار دور ECs في حماية CM ضد إصابة نقص التروية / التروية المحاكاة. والهدف من هذا التقرير هو توفير نهج تدريجي للمحققين لاستخدام هذا النموذج الهام لصالحهم.

Introduction

مرض نقص تروية القلب هو السبب الرئيسي للوفاة والعجز في جميع أنحاء العالم ^1,2. ومع ذلك ، فإن عملية علاج التروية يمكن أن تسبب في حد ذاتها وفاة الخلايا العضلية القلبية ، والمعروفة باسم إصابة نقص تروية عضلة القلب / التروية (IR) ، والتي لا يوجد لها حتى الآن علاج فعال³. تم اقتراح الخلايا البطانية (ECs) لحماية الخلايا العضلية القلبية (CMs) من خلال إفراز إشارات paracrine ، وكذلك التفاعلات من خلية إلى خلية⁴.

وقد استخدمت نماذج الزراعة المشتركة للخلايا على نطاق واسع للتحقيق في دور التفاعلات بين الخلايا الأوتوتيكرين و/أو الباراكرين في وظيفة الخلية والتمايز. من بين نماذج الزراعة المشتركة ، تعد الزراعة المشتركة المختلطة هي الأبسط ، حيث يكون هناك نوعان مختلفان من الخلايا على اتصال مباشر داخل حجرة زراعة واحدة بنسبة خلية مطلوبة⁵. ومع ذلك ، فإن العلاجات المنفصلة بين أنواع الخلايا والتحليل النهائي لنوع خلية واحدة ليست ممكنة بسهولة نظرا للسكان المختلطين.

أشارت الدراسات السابقة إلى أن الإهانات الناقصة الأكسجة والإقفارية تسبب أضرارا كبيرة لسلامة غشاء الخلية كما تم قياسها من خلال إطلاق نازعة هيدروجيناز اللاكتات (LDH). تتفاقم هذه الإصابة عند إعادة الأكسجين ، مما يحاكي إصابة إعادة التروية⁶،^7،8. كان الهدف من البروتوكول الحالي هو اختبار الفرضيات القائلة بأن وجود ECs يمكن أن يخفف من تسرب غشاء الخلية من CMs الناجم عن نقص الأكسجة وإعادة الأكسجين (HR) وأن التأثير الوقائي ل ECs يمكن تحسينه عن طريق تغيير مسافة الاتصال بين خطي الخلية. وهكذا ، استخدمنا ثلاثة أنواع من إدراج زراعة الخلايا والخلايا البطانية للشريان التاجي الأولي للفأر والخلايا العضلية القلبية للفأر البالغ. سمحت لنا الإدخالات ، التي تحمل علامة Corning و Merck Millipore و Greiner Bio-One ، بإنشاء ثلاثة ظروف مختلفة للتفاعل بين الخلايا مع مسافات خط بين الخلايا تبلغ 0.5 و 1.0 و 2.0 مم ، على التوالي. تم طلاء 100000 ECs لكل إدراج في كل حالة.

بالإضافة إلى ذلك ، من أجل تحديد ما إذا كانت كثافة ECs في الثقافة المشتركة تساهم في تخفيف إصابات الموارد البشرية في هذا النموذج ، درسنا العلاقة بين الجرعة والاستجابة بين تركيز EC وإطلاق LDH بواسطة CMs. تم طلاء ECs عند 25000 و 50000 و 100000 لكل إدراج ، على التوالي ، في إدراج 2.0 مم.

يقدم هذا التقرير نهجا خطوة بخطوة للمحققين لاستخدام هذا النموذج الهام لصالحهم.

Protocol

1. التحضير التجريبي / الطلاء

1. الحفاظ على CMs و ECs وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
   1. قم بإذابة كلا الخطين الخلويين عند وصولهما من البائعين. طبق في قوارير T25 بعد غسلها بوسائط جديدة. يوصى بشراء كل وسائط زراعة خلايا من نفس البائعين الذين تم شراء الخلايا منهم. في اليوم التالي ، قم بتحديث الخلايا بالوسائط واستخدمها عند الالتقاء.
   2. حافظ على حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 21٪ O₂ ، 5٪ CO 2 ، 74٪ N₂ واحتفظ بها رطبة.
      ملاحظة: يتم عزل الخلايا البطانية للشريان التاجي الأولي للفأر المستخدمة في هذا البروتوكول من الشرايين التاجية للفئران C57BL/6، ويتم عزل الخلايا العضلية القلبية للفئران البالغة من قلوب الفئران C57BL/6J البالغة ويتم الحصول عليها تجاريا (انظر جدول المواد).
2. لوحة CMs تحت ظروف معقمة على الجزء السفلي من لوحات 24 بئر (طبقة أدنى). بعد 24 ساعة ، قم بصب ECs في الإدراج (أو الجزء المتفوق) من الثقافة المشتركة جيدا. بعد 24 ساعة من طلاء EC ، ضع إدخالات EC على قواعد لوحة CM ، بدءا من فترة الثقافة المشتركة. اسمح للخلايا بالزراعة المشتركة لمدة 12-24 ساعة على الأقل قبل الاستخدام. يتم وصف هذه الخطوات بالتفصيل أدناه.
   1. تقدير التقاء خط خلية CM تحت المجهر الضوئي. عندما تبدو الخلايا ملتقية بنسبة 90٪ -100٪ في قوارير المزرعة ، تابع الطلاء التجريبي.
   2. قم بإزالة الوسائط من القوارير التي تحتوي على مزارع الخلايا المتقاربة والتريبسين مع 3-5 مل من التربسين / حمض الإيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك (EDTA) لقوارير T25. حرك القارورة بلطف ، واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 2-5 دقائق ، ثم قم بتقييم التقدم الأنزيمي تحت المجهر الضوئي. بمجرد أن تبدأ الخلايا في التقريب ، استخدم مكشطة الخلايا لفصل الخلايا عن السطح.
   3. بعد الانفصال ، قم بتعطيل محلول التربسين عن طريق إضافة محلول التربسين / الخلية إلى أنبوب سعة 50 مل يحتوي على 10 مل من الوسائط لقوارير T25. الطرد المركزي تعليق الخلية في 120 × غرام لمدة 2 دقيقة للحصول على بيليه خلية لينة. قم بإزالة supernatant وأعد تعليق الكريات في 5 مل من الوسائط.
   4. لإجراء عد الخلايا وتأكيد صلاحية الخلية ، امزج أليكوت من 10 ميكرولتر من الخلايا المعاد تعليقها و 10 ميكرولتر من صبغة التربان الزرقاء. عد الخلايا الحية باستخدام عداد الخلايا. تمييع الخلايا مع وسائط منتظمة جديدة لتحقيق كثافات البذر المطلوبة. يتم حساب الأحجام اعتمادا على كثافة البذور المطلوبة وتركيز الخلايا لمحاليل المخزون. يجب إجراء جميع عمليات الطلاء في ظل ظروف معقمة.
   5. لوحة CMs بكثافات البذر من 300,000 لكل بئر على الجزء السفلي من لوحة 24 بئر مغلفة مسبقا مع مصفوفة خارج الخلية. الحفاظ على الخلايا في 37 درجة مئوية مع 21٪ O 2_و 5٪ CO₂ بين عشية وضحاها.
   6. بعد 24 ساعة، يتم إدخال ECs في الصفائح بكثافة طلاء مثالية تبلغ 100,000 لكل إدراج (مساحة الاستزراع 33.6 مم²)، (الشكل 1). بعد 24 ساعة من طلاء EC ، ضع إدخالات EC داخل آبار CM ، وابدأ الثقافة المشتركة. اسمح للخلايا بالزراعة المشتركة لمدة 12-24 ساعة قبل إجراء التجارب.
   7. تأكد من أنه بحلول الوقت الذي يتم فيه إجراء التجارب ، وصل كل من CMs و ECs إلى 80٪ -90٪ من التقاء.

2. نقص الأكسجة / إعادة الأكسجين لمحاكاة نقص التروية / إصابة التروية في المختبر

ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوات التالية كما هو موضح، لا تتوقف مؤقتا بينهما.

1. تحضير وسائط نقص الأكسجة عن طريق صب ~ 25 مل من الوسائط في أنبوب مخروطي 50 مل. قم بإغلاق الجزء العلوي بالهواء باستخدام غشاء سيليكون واستخدم ماصة معقمة لكمة ثقب. قم بإنشاء ثقب آخر ، هذه المرة ترك الماصة مغمورة بالمياه حوالي 2/3 في الوسائط.
2. اغسل الوسائط بغاز نقص الأكسجة (0.0125٪ O 2 ، 5٪ CO 2 ، 94.99٪ N₂) لمدة 5 دقائق بمعدل تدفق 30 لتر / دقيقة. هذا يقلل من O 2 المذاب في وسائل الإعلام عندما يبدأ نقص الأكسجة (الخطوة_2.5).
3. تخلص من وسائط الألواح أو الإدخالات المستزرعة المكونة من 24 بئرا التي تحتوي على خلايا متصلة واغسلها بلطف شديد باستخدام 100 ميكرولتر / بئر من محلول ملحي مخزنة مؤقتا بنسبة 10٪ من الفوسفات (PBS). بعد ذلك ، أضف 500 ميكرولتر من وسائط نقص الأكسجة الطازجة إلى كل بئر من الألواح أو الإدراجات.
   ملاحظة: ينقطع نقص الأكسجة في الوسائط بأقصر وقت ممكن خلال هذه الخطوة قبل أن يبدأ نقص الأكسجة الحقيقي للخلايا والوسائط في الخطوة 2.5.
   1. في مجموعة التحكم المعيارية ، استبدل الوسائط الأصلية بوسائط طبيعية جديدة تحتوي على الجلوكوز والمصل.
4. ترطيب غرفة نقص الأكسجة عن طريق وضع طبق بتري مملوء بالماء المعقم داخل الغرفة. بعد ذلك ، ضع الألواح التي تضم مجموعات نقص الأكسجة في الغرفة.
5. اغسل غرفة نقص الأكسجة بغاز نقص الأكسجة (0.0125٪ O 2 ، 5٪ CO 2 ، 94.99٪ N₂) لمدة 5 دقائق عند تدفق 30 لتر / دقيقة. ضع الغرفة في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
6. بعد نقص الأكسجة ، قم بزراعة CMs و ECs في ظل الظروف العادية. للقيام بذلك ، تخلص من الوسائط القديمة للألواح / الإدخالات ، واستبدلها بوسائط عادية (تحتوي على الجلوكوز والمصل ؛ 500 ميكرولتر من كل بئر / إدراج) وتخزينها في الحاضنة في ظل ظروف الثقافة العادية (21٪ O 2 ، 5٪ CO 2 ، 74٪ N 2 ، 37 درجة مئوية) لمدة₂ ساعة لتقليد التروية.
7. للتحكم في أي آثار لاستبدال الوسائط ، قم بتغيير وسائط الخلايا المعيارية في نفس الوقت الذي يتم فيه تغيير وسائط نقص الأكسجين.
   ملاحظة: يقدم الشكل 2 لمحة عامة تخطيطية عن هذا البروتوكول.

3. تقييم نقطة النهاية

1. انقل وسائط زراعة الخلايا من لوحة 24 بئرا إلى صفيحة 96 بئرا. استخدم 200 ميكرولتر من الوسائط من كل بئر من الصفيحة المكونة من 24 بئرا وقم بتوزيعها بالتساوي في أربعة آبار من لوحة البئر 96 ، وفقا لذلك. استخدم صفيحة واحدة لكل من النورموكسيا مقابل نقص الأكسجة مقابل الموارد البشرية.
2. تحديد درجة الإصابة الخلوية، على سبيل المثال، عن طريق قياس امتصاص LDH باستخدام مجموعة فحص السمية الخلوية باتباع تعليمات الشركة المصنعة. قم بإجراء الفحص في لوحة 96 بئرا وفقا للتعليمات الواردة في بروتوكول المقايسة.

4. الإحصائيات

1. عرض البيانات البارامترية كانحراف متوسط/معياري وبيانات غير بارامترية كمخططات مربعة ذات نطاق متوسط/ربع سنوي. وينبغي إجراء اختبارات مقارنات متعددة بارامترية كافية مقابل اختبارات مقارنات متعددة غير بارامترية مع اختبارات لاحقة مقبولة لتقليل فرصة حدوث خطأ من النوع 1. عادة ما يتم تعيين الأهمية عند ألفا من 0.05 (ثنائي الذيل).
2. بالنسبة لجميع التجارب التي أجريت في الدراسة الحالية ، قم بإجراء ثلاث نسخ متماثلة جيدة على الأقل في تجربة واحدة. كان هناك ثلاثة إلى ستة تكرارات لكل تجربة تستخدم للتحليل الإحصائي.

النتائج

جميع أنواع الإدخالات الثلاثة (A ، B ، C) المستخدمة في هذه التجربة لها نفس حجم المسام البالغ 0.4 ميكرومتر. والفرق الوحيد بينها هو الارتفاع من الإدراج إلى القاعدة، الذي يسمح بأن تكون المسافات بين طبقتي الخلايا المستزرعتين معا 0.5 و 1.0 و 2.0 ملم، على التوالي، (الشكل 3) وأنها من بائعين ?...

Discussion

الخطوات الحاسمة في البروتوكول
تم استخدام نماذج الزراعة المشتركة للخلايا لدراسة الآليات الخلوية لحماية القلب. وبالتالي ، فإن كيفية إنشاء طبقتين منفصلتين مع مسافة ذات مغزى بينهما أمر بالغ الأهمية لتطوير نموذج مناسب للثقافة المشتركة. التحدي في دراسة محاكاة الأشعة تحت الحمراء ، ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adult Mouse Cardiomyocytes (CMs)	Celprogen Inc	11041-14	Isolated from adult C57BL/6J mouse cardiac tissue
Automated Cell Counter Countess II	Invitrogen	A27977	Cell counting for calculating cell numbers
Bio-Safety Cabinet	Nuaire	NU425400	Cell culture sterile hood
Cell Culture Freezing Medium	Cell Biologics Inc	6916	Used for cell freezing for long term cell line storage
Cell Culture Incubator	Nuaire	Nu-5500	To provide normal cell living condition (21%O2, 5%CO2, 74%N2, 37°C, humidified)
Cell Culture Incubator Gas Tank	A-L Compressed Gases	UN1013	Gas needed for cell culture incubator
Cell Culture Inserts A (0.5 mm)	Corning Inc	353095	Used for EC-CM co-culture
Cell Culture Inserts B (1.0 mm)	Millicell Millipore	PIHP01250	Used for EC-CM co-culture
Cell Culture Inserts C (2.0 mm)	Greiner Bio-One	662640	Used for EC-CM co-culture
Centrifuge	Anstel Enterprises Inc	4235	For cell culture plating and passaging
CMs Cell Culture Flasks T25	Celprogen Inc	E11041-14	Used for CMs regular culture, coated by manufacturer
CMs Cell Culture Medium Complete	Celprogen Inc	M11041-14S	CMs culture complete medium
CMs Cell Culture Medium Complete Phenol free	Celprogen Inc	M11041-14PN	CMs culture medium without phenol red used during LDH measurement
CMs Cell Culture Plates 96 well	Celprogen Inc	E11041-14-96well	Used for experiments of LDH measurement, coated by manufacturer
CMs Hypoxia Cell Culture Medium	Celprogen Inc	M11041-14GFPN	CMs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)
Countess cell counting chamber slides	Invitrogen	C10283	Counting slides used for cell counter
Cyquant LDH Cytotoxicity Kit	Thermo Scientific	C20301	LDH measurement kit
ECs Cell Culture Flasks T25	Fisher Scientific	FB012935	Used for ECs regular culture
ECs Cell Culture Medium Complete	Cell Biologics Inc	M1168	ECs culture complete medium
ECs Cell Culture Medium Complete Phenol free	Cell Biologics Inc	M1168PF	ECs culture medium without phenol red used during LDH measurement
ECs Cell Culture Plates 96 well	Fisher Scientific (Costar)	3370	Used for experiments of LDH measurement
ECs Culture Gelatin-Based Coating Solution	Cell Biologics Inc	6950	Used for coating flasks and plates for ECs
ECs Hypoxia Cell Culture Medium	Cell Biologics Inc	GPF1168	ECs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fisher Scientific	MT35011CV	FBS-HI USDA-approved for cell culture and maintenance
Hypoxia Chamber	StemCell Technologies	27310	To create a hypoxic condition with 0.01%O2 environment
Hypoxia Chamber Flow Meter	StemCell Technologies	27311	To connect with hypoxic gas tank for a consistent gas flow speed
Hypoxic Gas Tank (0.01%O2 Cylinder)	A-L Compressed Gases	UN1956	Used to flush hypoxic medium and chamber (0.01%O2/5%CO2/94.99N2)
Microscope	Nikon	TMS	To observe cell condition
Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells (ECs)	Cell Biologics Inc	C57-6093	Isolated from coronary artery of C57BL/6 mice
NUNC 15ML CONICL Tubes	Fisher Scientific	12565269	For cell culture process, experiments, solution preparation etc.
NUNC 50ML CONICL Tubes	Fisher Scientific	12565271	For cell culture process, experiments, solution preparation etc.
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8662	Used for cell washing during culture or experiments
Plate Reader	BioTek Instrument	11120533	Colorimetric or fluorometric plate reading
Reaction 96 Well Palte (clear no lid)	Fisher Scientific	12565226	Used for LDH measurement plate reading
Trypsin/EDTA for CMs	Celprogen Inc	T1509-014	1 x sterile filtered and tissue culture tested
Trypsin/EDTA for ECs	Cell Biologics Inc	6914/0619	0.25%, cell cuture-tested