Développement d’un modèle de co-culture cellulaire pour imiter l’ischémie cardiaque / reperfusion in vitro

Résumé

La distance spatiale est un paramètre clé dans l’évaluation des lésions d’hypoxie / réoxygénation dans un modèle de co-culture de couches cellulaires endothéliales et cardiomyocytaires séparées, suggérant, pour la première fois, que l’optimisation de l’environnement spatial de co-culture est nécessaire pour fournir un modèle in vitro favorable pour tester le rôle des cellules endothéliales dans la protection des cardiomyocytes.

Résumé

Les cardiopathies ischémiques sont la principale cause de décès et d’invalidité dans le monde. La reperfusion provoque des blessures supplémentaires au-delà de l’ischémie. Les cellules endothéliales (CE) peuvent protéger les cardiomyocytes (CM) contre les lésions de reperfusion par le biais d’interactions cellule-cellule. Les co-cultures peuvent aider à étudier le rôle des interactions cellule-cellule. Une co-culture mixte est l’approche la plus simple, mais elle est limitée car les traitements isolés et les analyses en aval de types de cellules uniques ne sont pas réalisables. Pour déterminer si les CE peuvent atténuer les dommages aux cellules CM en fonction de la dose et si cette protection peut être encore optimisée en faisant varier la distance de contact entre les deux lignées cellulaires, nous avons utilisé des cellules endothéliales de l’artère coronaire primaire de souris et des cardiomyocytes de souris adultes pour tester trois types d’inserts de culture cellulaire qui variaient dans leur distance de couche intercellulaire à 0,5, 1,0 et 2,0 mm, respectivement. Dans les CM seulement, les lésions cellulaires évaluées par la libération de lactate déshydrogénase (LDH) ont augmenté de manière significative pendant l’hypoxie et plus loin lors de la réoxygénation lorsque la distance était de 2,0 mm par rapport à 0,5 et 1,0 mm. Lorsque les EC et les CM étaient en contact presque direct (0,5 mm), il n’y avait qu’une légère atténuation de la lésion de réoxygénation des CM après une hypoxie. Cette atténuation a été considérablement augmentée lorsque la distance spatiale était de 1,0 mm. Avec une distance de 2,0 mm, les CE atténuaient les lésions cm pendant l’hypoxie et l’hypoxie/réoxygénation, ce qui indique qu’une distance de culture suffisante est nécessaire pour que les CE puissent communiquer avec les CM, afin que les molécules de signal sécrétées puissent circuler et stimuler pleinement les voies protectrices. Nos résultats suggèrent, pour la première fois, que l’optimisation de l’environnement spatial de co-culture EC/CM est nécessaire pour fournir un modèle in vitro favorable pour tester le rôle des CE dans la protection contre la CM contre les lésions simulées d’ischémie / reperfusion. L’objectif de ce rapport est de fournir une approche étape par étape permettant aux enquêteurs d’utiliser cet important modèle à leur avantage.

Introduction

Les cardiopathies ischémiques sont la principale cause de décès et d’invalidité dans le monde ^1,2. Cependant, le processus de traitement de la reperfusion peut lui-même provoquer la mort des cardiomyocytes, connue sous le nom de lésion d’ischémie / reperfusion myocardique (IR), pour laquelle il n’existe toujours pas de remède efficace³. Les cellules endothéliales (CE) ont été suggérées pour protéger les cardiomyocytes (CM) par la sécrétion de signaux paracrines, ainsi que par des interactions de cellule à cellule⁴.

Les modèles de co-culture cellulaire ont été largement utilisés pour étudier le rôle des interactions cellule-cellule autocrine et/ou paracrine sur la fonction et la différenciation cellulaires. Parmi les modèles de co-culture, la co-culture mixte est la plus simple, où deux types différents de cellules sont en contact direct dans un seul compartiment de culture à un rapport cellulaire souhaité⁵. Cependant, des traitements distincts entre les types de cellules et l’analyse en aval d’un seul type de cellule ne sont pas facilement réalisables compte tenu de la population mixte.

Des études antérieures ont indiqué que les insultes hypoxiques et ischémiques causent des dommages importants à l’intégrité de la membrane cellulaire mesurée par la libération de lactate déshydrogénase (LDH). Cette blessure est aggravée lors de la réoxygénation, imitant la lésion de reperfusion ^6,7,8. L’objectif du protocole actuel était de tester les hypothèses selon lesquelles la présence d’EC peut atténuer en fonction de la dose les fuites de membrane cellulaire des CM causées par l’hypoxie et la réoxygénation (HR) et que l’effet protecteur des CE peut être optimisé en faisant varier la distance de contact entre les deux lignées cellulaires. Ainsi, nous avons utilisé trois types d’inserts de culture cellulaire et des cellules endothéliales de l’artère coronaire primaire de souris et des cardiomyocytes de souris adultes. Les inserts, marqués par Corning, Merck Millipore et Greiner Bio-One, nous ont permis de créer trois conditions de diaphonie de culture cellulaire différentes avec des distances intercellulaires de 0,5, 1,0 et 2,0 mm, respectivement. 100 000 CE ont été plaqués par insert dans chaque cas.

De plus, afin de déterminer si la densité des CE en co-culture contribue à l’atténuation des lésions HR dans ce modèle, nous avons étudié la relation dose-réponse entre la concentration d’EC et la libération de LDH par les CM. Les EC ont été plaqués à 25 000, 50 000 et 100 000 par insert, respectivement, dans l’insert de 2,0 mm.

Le présent rapport offre aux enquêteurs une approche étape par étape pour qu’ils utilisent cet important modèle à leur avantage.

Protocole

1. Préparation/placage expérimental

1. Entretenez les CM et les CE conformément aux instructions du fabricant.
   1. Décongelez les deux lignées cellulaires lorsqu’elles arrivent des fournisseurs. Plaque dans des flacons T25 après avoir été lavée avec du milieu frais. Il est recommandé d’acheter chaque milieu de culture cellulaire auprès des mêmes fournisseurs que ceux auprès desquels les cellules ont été achetées. Le lendemain, rafraîchissez les cellules avec un support et utilisez-les lorsqu’elles sont confluentes.
   2. Maintenez l’incubateur de culture cellulaire à 37 °C avec 21 % O₂, 5 % CO₂, 74 % N₂ et maintenez-le humidifié.
      REMARQUE: Les cellules endothéliales de l’artère coronaire primaire de souris utilisées dans ce protocole sont isolées des artères coronaires de souris C57BL / 6, et les cardiomyocytes de souris adultes sont isolés à partir de cœurs de souris C57BL / 6J adultes et obtenus commercialement (voir tableau des matériaux).
2. Plaques CM dans des conditions stériles sur le fond de plaques de 24 puits (couche inférieure). 24 h plus tard, plaquez les CE dans l’insert (ou la partie supérieure) du puits de co-culture. 24 h après le placage EC, placez les inserts EC sur des bases de plaques CM, commençant la période de co-culture. Laisser les cellules co-cultiver pendant au moins 12-24 h avant utilisation. Ces étapes sont décrites en détail ci-dessous.
   1. Estimer la confluence des lignées cellulaires CM au microscope optique. Lorsque les cellules semblent être confluentes à 90% à 100% dans des flacons de culture, procédez au placage expérimental.
   2. Retirer le milieu des flacons contenant des cultures cellulaires confluentes et trypsiniser avec 3 à 5 mL de trypsine/acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) pour les flacons de T25. Agiter doucement la fiole, incuber à 37 °C pendant 2 à 5 min, puis évaluer la progression enzymatique au microscope optique. Une fois que les cellules commencent à s’arrondir, utilisez un grattoir à cellules pour détacher les cellules de la surface.
   3. Après le détachement, inactiver la solution de trypsine en ajoutant la solution de trypsine/cellule dans un tube de 50 mL contenant 10 mL de milieu pour les flacons de T25. Centrifuger la suspension de la cellule à 120 x g pendant 2 min pour obtenir une pastille de cellule molle. Retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 5 mL de support.
   4. Pour effectuer le comptage cellulaire et confirmer la viabilité cellulaire, mélanger une aliquote de 10 μL de cellules remises en suspension et 10 μL de colorant bleu de trypan. Comptez les cellules vivantes à l’aide d’un compteur de cellules. Diluer les cellules avec des milieux frais réguliers pour obtenir les densités d’ensemencement souhaitées. Les volumes sont calculés en fonction de la densité de graines souhaitée et de la concentration cellulaire des solutions mères. Tout placage doit être effectué dans des conditions stériles.
   5. Plaques CM à des densités d’ensemencement de 300 000 par puits sur le fond d’une plaque de 24 puits pré-enduite de matrice extracellulaire. Maintenez les cellules à 37 °C avec 21 % d’O2_et 5 % de CO₂ pendant la nuit.
   6. Après 24 h, les EC de plaque dans des inserts à une densité de placage optimale de 100 000 par insert (la surface de culture est de 33,6 mm²) (Figure 1). Après 24 h de placage EC, placez des inserts EC à l’intérieur des puits CM, initiant ainsi la co-culture. Permettre aux cellules de co-cultiver pendant 12-24 h avant d’effectuer les expériences.
   7. Assurez-vous qu’au moment où les expériences sont effectuées, les CM et les CE ont atteint une confluence de 80 % à 90 %.

2. Hypoxie/réoxygénation pour simuler une lésion d’ischémie/reperfusion in vitro

REMARQUE: Les étapes suivantes doivent être effectuées comme décrit, ne faites pas de pause entre les deux.

1. Préparez le milieu hypoxique en versant environ 25 mL de milieu dans un tube conique de 50 mL. Scellez le dessus à l’air avec une membrane en silicone et utilisez une pipette stérilisée pour percer un trou. Créez un autre trou, cette fois en laissant la pipette immergée environ 2/3 dans le média.
2. Rincer le milieu avec du gaz hypoxique (0,0125 % O₂, 5 % CO₂, 94,99 % N₂) pendant 5 min à un débit de 30 L/min. Cela minimise_l’O2 dissous dans le milieu lorsque l’hypoxie commence (étape 2.5).
3. Jeter les milieux des plaques de 24 puits ou des inserts de culture contenant des cellules attachées et laver avec 100 μL / puits de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à 10% très doucement. Ensuite, ajoutez 500 μL de milieux hypoxiques fraîchement préparés à chaque puits des plaques ou des inserts.
   REMARQUE: L’hypoxie dans les médias est interrompue aussi brièvement que possible au cours de cette étape avant que la véritable hypoxie pour les cellules et les médias ne commence à l’étape 2.5.
   1. Dans le groupe témoin normoxique, remplacez le milieu d’origine par un milieu normal frais contenant du glucose et du sérum.
4. Humidifiez la chambre d’hypoxie en plaçant une boîte de Petri remplie d’eau stérile dans la chambre. Ensuite, placez les plaques comprenant les groupes hypoxiques dans la chambre.
5. Rincer la chambre d’hypoxie avec du gaz hypoxique (0,0125% O₂, 5% CO₂, 94,99% N₂) pendant 5 min à un débit de 30 L/min. Placez la chambre dans l’incubateur à 37 °C pendant 24 h.
6. Après l’hypoxie, cultivez les CM et les CE dans des conditions normales. Pour ce faire, jetez l’ancien milieu des plaques/inserts, remplacez-le par un milieu normal (contenant du glucose et du sérum; 500 μL de chaque puits/insert) et conservez-le dans l’incubateur dans des conditions de culture normales (21 % O₂, 5 % CO₂, 74 % N₂, 37 °C) pendant 2 h pour imiter la reperfusion.
7. Pour contrôler les effets du remplacement du milieu, modifiez le milieu des cellules normoxiques en même temps que le milieu hypoxique est modifié.
   REMARQUE : La figure 2 fournit une vue d’ensemble schématique de ce protocole.

3. Évaluation des points de terminaison

1. Transférer le milieu de culture cellulaire de la plaque de 24 puits dans une plaque de 96 puits. Utilisez 200 μL de média de chaque puits de la plaque de 24 puits et répartissez également dans quatre puits de la plaque de 96 puits, en conséquence. Utilisez une plaque chacune pour la normoxie par rapport à l’hypoxie par rapport à la HR.
2. Déterminer le degré de lésion cellulaire, par exemple, en mesurant l’absorbance de la LDH à l’aide d’une trousse de dosage de cytotoxicité en suivant les instructions du fabricant. Effectuez le test dans une plaque de 96 puits comme indiqué dans le protocole d’essai.

4. Statistiques

1. Affichez les données paramétriques sous forme d’écart-type moyen et les données non paramétriques sous forme de diagrammes en boîte avec plage médiane/interquartile. Des tests de comparaisons multiples paramétriques et non paramétriques adéquats avec des tests post-hoc acceptables pour réduire le risque d’erreur de type 1 doivent être effectués. La signification est généralement fixée à un alpha de 0,05 (à deux queues).
2. Pour toutes les expériences réalisées dans la présente étude, effectuer au moins trois répliques de puits dans une expérience. Il y avait trois à six répétitions de chaque expérience utilisée pour l’analyse statistique.

Résultats

Les trois types d’inserts (A, B, C) utilisés dans cette expérience ont la même taille de pores de 0,4 μm. La seule différence entre eux est la hauteur de l’insert à la base, qui permet aux distances entre les deux couches cellulaires co-cultivées d’être de 0,5, 1,0 et 2,0 mm, respectivement, (Figure 3) et qu’elles proviennent de fournisseurs différents (pour plus de détails, voir tableau des matériaux).

Pour établir un modèle ...

Discussion

Étapes critiques du protocole
Des modèles de co-culture cellulaire ont été utilisés pour étudier les mécanismes cellulaires de la cardioprotection. Comment créer deux couches distinctes avec une distance significative entre elles est donc crucial pour le développement d’un modèle de co-culture approprié. Un défi dans l’étude de la lésion simulée IR, c’est-à-dire HR, est que non seulement l’ischémie (hypoxie) elle-même, mais aussi la reperfusion (réoxygénation) aggravent le ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adult Mouse Cardiomyocytes (CMs)	Celprogen Inc	11041-14	Isolated from adult C57BL/6J mouse cardiac tissue
Automated Cell Counter Countess II	Invitrogen	A27977	Cell counting for calculating cell numbers
Bio-Safety Cabinet	Nuaire	NU425400	Cell culture sterile hood
Cell Culture Freezing Medium	Cell Biologics Inc	6916	Used for cell freezing for long term cell line storage
Cell Culture Incubator	Nuaire	Nu-5500	To provide normal cell living condition (21%O2, 5%CO2, 74%N2, 37°C, humidified)
Cell Culture Incubator Gas Tank	A-L Compressed Gases	UN1013	Gas needed for cell culture incubator
Cell Culture Inserts A (0.5 mm)	Corning Inc	353095	Used for EC-CM co-culture
Cell Culture Inserts B (1.0 mm)	Millicell Millipore	PIHP01250	Used for EC-CM co-culture
Cell Culture Inserts C (2.0 mm)	Greiner Bio-One	662640	Used for EC-CM co-culture
Centrifuge	Anstel Enterprises Inc	4235	For cell culture plating and passaging
CMs Cell Culture Flasks T25	Celprogen Inc	E11041-14	Used for CMs regular culture, coated by manufacturer
CMs Cell Culture Medium Complete	Celprogen Inc	M11041-14S	CMs culture complete medium
CMs Cell Culture Medium Complete Phenol free	Celprogen Inc	M11041-14PN	CMs culture medium without phenol red used during LDH measurement
CMs Cell Culture Plates 96 well	Celprogen Inc	E11041-14-96well	Used for experiments of LDH measurement, coated by manufacturer
CMs Hypoxia Cell Culture Medium	Celprogen Inc	M11041-14GFPN	CMs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)
Countess cell counting chamber slides	Invitrogen	C10283	Counting slides used for cell counter
Cyquant LDH Cytotoxicity Kit	Thermo Scientific	C20301	LDH measurement kit
ECs Cell Culture Flasks T25	Fisher Scientific	FB012935	Used for ECs regular culture
ECs Cell Culture Medium Complete	Cell Biologics Inc	M1168	ECs culture complete medium
ECs Cell Culture Medium Complete Phenol free	Cell Biologics Inc	M1168PF	ECs culture medium without phenol red used during LDH measurement
ECs Cell Culture Plates 96 well	Fisher Scientific (Costar)	3370	Used for experiments of LDH measurement
ECs Culture Gelatin-Based Coating Solution	Cell Biologics Inc	6950	Used for coating flasks and plates for ECs
ECs Hypoxia Cell Culture Medium	Cell Biologics Inc	GPF1168	ECs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fisher Scientific	MT35011CV	FBS-HI USDA-approved for cell culture and maintenance
Hypoxia Chamber	StemCell Technologies	27310	To create a hypoxic condition with 0.01%O2 environment
Hypoxia Chamber Flow Meter	StemCell Technologies	27311	To connect with hypoxic gas tank for a consistent gas flow speed
Hypoxic Gas Tank (0.01%O2 Cylinder)	A-L Compressed Gases	UN1956	Used to flush hypoxic medium and chamber (0.01%O2/5%CO2/94.99N2)
Microscope	Nikon	TMS	To observe cell condition
Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells (ECs)	Cell Biologics Inc	C57-6093	Isolated from coronary artery of C57BL/6 mice
NUNC 15ML CONICL Tubes	Fisher Scientific	12565269	For cell culture process, experiments, solution preparation etc.
NUNC 50ML CONICL Tubes	Fisher Scientific	12565271	For cell culture process, experiments, solution preparation etc.
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8662	Used for cell washing during culture or experiments
Plate Reader	BioTek Instrument	11120533	Colorimetric or fluorometric plate reading
Reaction 96 Well Palte (clear no lid)	Fisher Scientific	12565226	Used for LDH measurement plate reading
Trypsin/EDTA for CMs	Celprogen Inc	T1509-014	1 x sterile filtered and tissue culture tested
Trypsin/EDTA for ECs	Cell Biologics Inc	6914/0619	0.25%, cell cuture-tested