Kardiyak İskemi / Reperfüzyonu In Vitro Taklit Etmek için Bir Hücre Ko-Kültür Modelinin Geliştirilmesi

Özet

Uzamsal mesafe, ayrı endotel ve kardiyomiyosit hücre katmanlarının bir ko-kültür modelinde hipoksi / reoksijenasyon hasarının değerlendirilmesinde anahtar bir parametredir, bu da ilk kez, kardiyomiyosit korumasında endotel hücrelerinin rolünü test etmek için uygun bir in vitro model sağlamak için ko-kültür uzamsal ortamının optimize edilmesinin gerekli olduğunu düşündürmektedir.

Özet

İskemik kalp hastalığı dünya çapında önde gelen ölüm ve sakatlık nedenidir. Reperfüzyon iskeminin ötesinde ek yaralanmalara neden olur. Endotel hücreleri (ECs), kardiyomiyositleri (CM'ler) hücre-hücre etkileşimleri yoluyla reperfüzyon hasarından koruyabilir. Ko-kültürler, hücre-hücre etkileşimlerinin rolünü araştırmaya yardımcı olabilir. Karışık bir ko-kültür en basit yaklaşımdır, ancak izole tedaviler ve tek hücre tiplerinin aşağı akış analizleri mümkün olmadığından sınırlıdır. ECs'nin CM hücre hasarını doza bağımlı olarak zayıflatıp zayıflatamayacağını ve bu korumanın iki hücre hattı arasındaki temas mesafesini değiştirerek daha da optimize edilip edilemeyeceğini araştırmak için, hücreler arası katman mesafelerinde 0.5'te değişen üç tip hücre kültürü ekini test etmek için Fare Primer Koroner Arter Endotel Hücreleri ve Yetişkin Fare Kardiyomiyositlerini kullandık. Sırasıyla 1,0 ve 2,0 mm. Sadece CM'lerde, laktat dehidrogenaz (LDH) salınımı ile değerlendirilen hücresel hasar, hipoksi sırasında ve mesafe 0.5 ve 1.0 mm'ye kıyasla 2.0 mm olduğunda reoksijenasyon sonrasında önemli ölçüde artmıştır. ECS ve CM'ler neredeyse doğrudan temas halinde olduğunda (0.5 mm), hipoksi sonrası CM'lerin reoksijenasyon hasarında sadece hafif bir zayıflama vardı. 2.0 mm mesafe ile ECs, hem hipoksi hem de hipoksi / reoksijenasyon sırasında CM yaralanmasını zayıflattı, bu da EC'lerin CM'lerle çapraz konuşması için yeterli kültür mesafesinin gerekli olduğunu gösterdi, böylece salgılanan sinyal molekülleri dolaşabilir ve koruyucu yolları tamamen uyarabilir. Bulgularımız, ilk kez, EC / CM ortak kültür mekansal ortamının optimize edilmesinin, EC'lerin simüle iskemi / reperfüzyon hasarına karşı CM korumasındaki rolünü test etmek için uygun bir in vitro model sağlamak için gerekli olduğunu göstermektedir. Bu raporun amacı, araştırmacıların bu önemli modeli kendi avantajlarına kullanmaları için adım adım bir yaklaşım sağlamaktır.

Giriş

İskemik kalp hastalığı dünya çapında önde gelen ölüm ve sakatlık nedenidir ^1,2. Bununla birlikte, reperfüzyonun tedavi sürecinin kendisi, miyokard iskemisi / reperfüzyon (IR) hasarı olarak bilinen kardiyomiyosit ölümüne neden olabilir, bunun için hala etkili bir ilaç yoktur³. Endotel hücrelerinin (ECs), kardiyomiyositleri (CM'ler) parakrin sinyallerin salgılanması ve hücreden hücreye etkileşimler yoluyla koruduğu öne sürülmüştür⁴.

Hücre ko-kültürü modelleri, otokrin ve / veya parakrin hücre-hücre etkileşimlerinin hücre fonksiyonu ve farklılaşması üzerindeki rolünü araştırmak için yaygın olarak kullanılmıştır. Ko-kültür modelleri arasında, karışık ko-kültür, iki farklı hücre tipinin, istenen hücre oranında tek bir kültür bölmesinde doğrudan temas halinde olduğu en basit^{olanıdır 5}. Bununla birlikte, hücre tipleri arasındaki ayrı tedaviler ve tek bir hücre tipinin aşağı akış analizi, karışık popülasyon göz önüne alındığında kolayca mümkün değildir.

Önceki çalışmalar, hipoksik ve iskemik hakaretlerin, laktat dehidrogenaz (LDH) salınımı ile ölçülen hücre zarının bütünlüğünde önemli hasara neden olduğunu göstermiştir. Bu yaralanma reoksijenasyon üzerine kötüleşir^ve reperfüzyon hasarı ^6,7,8'i taklit eder. Mevcut protokolün amacı, EC'lerin varlığının, hipoksi ve reoksijenasyonun (HR) neden olduğu CM'lerin hücre zarı sızıntısını doza bağımlı olarak azaltabileceği ve EC'lerin koruyucu etkisinin iki hücre hattı arasındaki temas mesafesinin değiştirilmesiyle optimize edilebileceği hipotezlerini test etmekti. Bu nedenle, üç tip hücre kültürü inserti ve Fare Primer Koroner Arter Endotel Hücreleri ve Yetişkin Fare Kardiyomiyositleri kullandık. Corning, Merck Millipore ve Greiner Bio-One markalı kesici uçlar, sırasıyla 0,5, 1,0 ve 2,0 mm'lik hücreler arası hat mesafelerine sahip üç farklı hücre kültürü çapraz konuşma koşulu oluşturmamızı sağladı. Her durumda kesici uç başına 100.000 ECs kaplandı.

Ek olarak, ko-kültürdeki EC'lerin yoğunluğunun bu modelde İK hasarının zayıflamasına katkıda bulunup bulunmadığını belirlemek için, CM'ler tarafından EC konsantrasyonu ve LDH salınımı arasındaki doz-yanıt ilişkisini inceledik. ECs, 2.0 mm'lik kesici uçta kesici uç başına sırasıyla 25.000, 50.000 ve 100.000 olarak kaplandı.

Bu rapor, araştırmacıların bu önemli modeli kendi avantajlarına kullanmaları için adım adım bir yaklaşım sunmaktadır.

Protokol

1. Deneysel hazırlama/kaplama

1. CM'leri ve EC'leri üreticinin talimatlarına göre koruyun.
   1. Satıcılardan geldiklerinde her iki hücre hattını da çözün. Taze maddelerle yıkandıktan sonra T25 şişelerde plaka. Her hücre kültürü ortamının, hücrelerin satın alındığı aynı satıcılardan satın alınması önerilir. Ertesi gün, hücreleri medya ile yenileyin ve birleştiğinde kullanın.
   2. Hücre kültürü inkübatörünü %21 O2, %5 CO₂, %74_N2 ile 37 °_C'de tutun ve nemlendirilmiş halde tutun.
      NOT: Bu protokolde kullanılan Fare Primer Koroner Arter Endotel Hücreleri, C57BL/6 farelerin koroner arterlerinden izole edilir ve Yetişkin Fare Kardiyomiyositleri yetişkin C57BL/6J fare kalplerinden izole edilir ve ticari olarak elde edilir (bkz.
2. Steril koşullar altında plaka CM'leri 24 delikli plakaların dibine (alt tabaka) yerleştirin. 24 saat sonra, plaka EC'leri ko-kültür kuyusunun ekine (veya üst kısmına) sokar. EC kaplamadan 24 saat sonra, EC uçlarını CM plaka tabanlarına yerleştirerek ko-kültür periyoduna başlayın. Kullanmadan önce hücrelerin en az 12-24 saat boyunca birlikte kültürlenmesine izin verin. Bu adımlar aşağıda ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
   1. Bir ışık mikroskobu altında CM hücre hattı akıcılığını tahmin edin. Kültür şişelerinde hücreler% 90 -% 100 oranında akıtılmış gibi göründüğünde, deneysel kaplamaya devam edin.
   2. Ortamları birleşik hücre kültürleri içeren şişelerden çıkarın ve T25 şişeleri için 3-5 mL Tripsin/Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile tripsinize edin. Şişeyi nazikçe çalkalayın, 2-5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin ve ardından enzimatik ilerlemeyi bir ışık mikroskobu altında değerlendirin. Hücreler yuvarlanmaya başladığında, hücreleri yüzeyden ayırmak için bir hücre kazıyıcı kullanın.
   3. Ayrılmadan sonra, tripsin / hücre çözeltisini T25 şişeleri için 10 mL ortam içeren 50 mL'lik bir tüpe ekleyerek tripsin çözeltisini etkisiz hale getirin. Yumuşak bir hücre peleti elde etmek için hücre süspansiyonunu 120 x g'de 2 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı çıkarın ve peleti 5 mL ortamda yeniden askıya alın.
   4. Hücre sayımı yapmak ve hücre canlılığını doğrulamak için, 10 μL yeniden askıya alınmış hücre ve 10 μL tripan mavi boyadan oluşan bir aliquot karıştırın. Bir hücre sayacı kullanarak canlı hücreleri sayın. İstenilen tohumlama yoğunluklarını elde etmek için hücreleri taze normal ortamlarla seyreltin. Hacimler, istenen tohum yoğunluğuna ve stok çözeltilerinin hücre konsantrasyonuna bağlı olarak hesaplanır. Tüm kaplamalar steril koşullar altında yapılmalıdır.
   5. Hücre dışı matris ile önceden kaplanmış 24 delikli bir plakanın dibine kuyu başına 300.000 tohumlama yoğunluğunda plaka CM'leri. Hücreleri_{gece boyunca}% 21 O2 ve% 5 CO₂ ile 37 ° C'de tutun.
   6. 24 saat sonra, plaka uçlara kesici uç başına 100.000 optimum kaplama yoğunluğunda (kültür alanı 33,6^mm2'dir) plakalanır (Şekil 1). 24 saatlik EC kaplamasından sonra, EC uçlarını CM kuyucuklarının içine yerleştirin ve ko-kültürü başlatın. Deneyleri yapmadan önce hücrelerin 12-24 saat boyunca birlikte kültürlenmesine izin verin.
   7. Deneyler gerçekleştirildiğinde, hem CM'lerin hem de EC'lerin %80-%90 akıcılığa ulaştığından emin olun.

2. İskemi / reperfüzyon hasarını simüle etmek için hipoksi / reoksijenasyon In Vitro

NOT: Aşağıdaki adımların açıklandığı gibi gerçekleştirilmesi gerekir, arada duraklamayın.

1. Hipoksik ortamı, 50 mL'lik bir konik tüpe ~ 25 mL ortam dökerek hazırlayın. Üstünü silikon bir membranla hava ile kapatın ve bir delik açmak için sterilize edilmiş bir pipet kullanın. Başka bir delik oluşturun, bu sefer pipeti ortama yaklaşık 2/3 batırılmış halde bırakın.
2. Ortamı hipoksik gazla (%0,0125 O₂, %5 CO 2, %94,99 N₂) 5 dakika boyunca 30 L/dak akış hızında yıkayın. Bu, hipoksi başladığında ortamda çözünen_O2'yi en aza indirir (adım 2.5).
3. Ekli hücreler içeren 24 delikli plakaların veya kültür eklerinin ortamını atın ve 100 μL/kuyucuk dolusu %10 Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS) ile çok nazikçe yıkayın. Daha sonra, taze hazırlanmış hipoksik ortamın 500 μL'sini plakaların veya eklerin her bir oluğuna ekleyin.
   NOT: Ortamdaki hipoksi, hücreler ve medya için gerçek hipoksi adım 2.5'te başlamadan önce bu adımda mümkün olduğunca kısa bir süre kesintiye uğrar.
   1. Normoksik kontrol grubunda, orijinal ortamı glikoz ve serum içeren taze normal ortamlarla değiştirin.
4. Hipoksi odasını, odanın içine steril suyla dolu bir Petri kabı yerleştirerek nemlendirin. Daha sonra, hipoksik grupları içeren plakaları odaya yerleştirin.
5. Hipoksi odacığını hipoksik gazla (%0.0125 O 2, %5 CO 2, %94.99 N₂) 5 dakika boyunca 30 L/dk'lık bir akışla yıkayın. Odayı 24 saat boyunca 37 °C inkübatöre yerleştirin.
6. Hipoksiden sonra, normal koşullar altında CM'leri ve EC'leri yetiştirin. Bunu yapmak için, plakaların/kesici uçların eski ortamını atın, normal ortamla değiştirin (glikoz ve serum içeren; her kuyucuk / ekin 500 μL'si) ve reperfüzyonu taklit etmek için 2 saat boyunca normal kültür koşulları altında (%₂₁ O 2,% 5 CO₂,% 74 N₂, 37 ° C) inkübatörde saklayın.
7. Ortam değişiminin herhangi bir etkisini kontrol etmek için, hipoksik ortam değiştirilirken aynı zamanda normoksik hücrelerin ortamını değiştirin.
   NOT: Şekil 2 , bu protokole şematik bir genel bakış sağlar.

3. Uç nokta değerlendirmesi

1. Hücre kültürü ortamını 24 delikli plakadan 96 delikli bir plakaya aktarın. 24 delikli plakanın her bir kuyucuğundan 200 μL ortam kullanın ve buna göre 96 delikli plakanın dört kuyucuğuna eşit olarak dağıtın. Normoksiye karşı hipoksiye karşı HR için her biri bir plaka kullanın.
2. Hücresel yaralanma derecesini, örneğin, üreticinin talimatlarını izleyerek bir sitotoksisite tahlil kiti kullanarak LDH için absorbansı ölçerek belirleyin. Tahlil protokolünde belirtildiği gibi tahlili 96 kuyucuklu bir plakada gerçekleştirin.

4. İstatistik

1. Parametrik verileri ortalama/standart sapma olarak ve parametrik olmayan verileri medyan/çeyrekler arası aralıklı kutu grafikleri olarak görüntüleyin. Tip-1 hata olasılığını azaltmak için kabul edilebilir post-hoc testlerle yeterli parametrik ve parametrik olmayan çoklu karşılaştırma testleri yapılmalıdır. Anlamlılık tipik olarak 0,05 alfaya (iki kuyruklu) ayarlanır.
2. Mevcut çalışmada yapılan tüm deneyler için, bir deneyde en az üç iyi replikasyon gerçekleştirin. İstatistiksel analiz için kullanılan her deneyin üç ila altı tekrarı vardı.

Sonuçlar

Bu deneyde kullanılan üç kesici uç türü (A, B, C) 0,4 μm'lik aynı gözenek boyutuna sahiptir. Aralarındaki tek fark, iki ortak kültürlü hücre katmanı arasındaki mesafelerin sırasıyla 0,5, 1,0 ve 2,0 mm olmasını sağlayan (Şekil 3) ve farklı satıcılardan (ayrıntılar için bkz.

IR hasarını simüle etmek için HR'ye maruz kalan iki hücre hattının ayrı katmanlarıyla in vitro bir ko-kültür modeli oluşturmak i...

Tartışmalar

Protokoldeki kritik adımlar
Kardiyoproteksiyonun hücresel mekanizmalarını incelemek için hücre ko-kültürü modelleri kullanılmıştır. Bu nedenle, aralarında anlamlı bir mesafe olan iki ayrı katmanın nasıl oluşturulacağı, uygun bir ortak kültür modelinin geliştirilmesi için çok önemlidir. Simüle edilmiş IR, yani HR, yaralanma çalışmasındaki bir zorluk, sadece iskeminin (hipoksi) kendisinin değil, aynı zamanda reperfüzyonun (reoksijenasyon) hücresel işlev bozukluğunu...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adult Mouse Cardiomyocytes (CMs)	Celprogen Inc	11041-14	Isolated from adult C57BL/6J mouse cardiac tissue
Automated Cell Counter Countess II	Invitrogen	A27977	Cell counting for calculating cell numbers
Bio-Safety Cabinet	Nuaire	NU425400	Cell culture sterile hood
Cell Culture Freezing Medium	Cell Biologics Inc	6916	Used for cell freezing for long term cell line storage
Cell Culture Incubator	Nuaire	Nu-5500	To provide normal cell living condition (21%O2, 5%CO2, 74%N2, 37°C, humidified)
Cell Culture Incubator Gas Tank	A-L Compressed Gases	UN1013	Gas needed for cell culture incubator
Cell Culture Inserts A (0.5 mm)	Corning Inc	353095	Used for EC-CM co-culture
Cell Culture Inserts B (1.0 mm)	Millicell Millipore	PIHP01250	Used for EC-CM co-culture
Cell Culture Inserts C (2.0 mm)	Greiner Bio-One	662640	Used for EC-CM co-culture
Centrifuge	Anstel Enterprises Inc	4235	For cell culture plating and passaging
CMs Cell Culture Flasks T25	Celprogen Inc	E11041-14	Used for CMs regular culture, coated by manufacturer
CMs Cell Culture Medium Complete	Celprogen Inc	M11041-14S	CMs culture complete medium
CMs Cell Culture Medium Complete Phenol free	Celprogen Inc	M11041-14PN	CMs culture medium without phenol red used during LDH measurement
CMs Cell Culture Plates 96 well	Celprogen Inc	E11041-14-96well	Used for experiments of LDH measurement, coated by manufacturer
CMs Hypoxia Cell Culture Medium	Celprogen Inc	M11041-14GFPN	CMs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)
Countess cell counting chamber slides	Invitrogen	C10283	Counting slides used for cell counter
Cyquant LDH Cytotoxicity Kit	Thermo Scientific	C20301	LDH measurement kit
ECs Cell Culture Flasks T25	Fisher Scientific	FB012935	Used for ECs regular culture
ECs Cell Culture Medium Complete	Cell Biologics Inc	M1168	ECs culture complete medium
ECs Cell Culture Medium Complete Phenol free	Cell Biologics Inc	M1168PF	ECs culture medium without phenol red used during LDH measurement
ECs Cell Culture Plates 96 well	Fisher Scientific (Costar)	3370	Used for experiments of LDH measurement
ECs Culture Gelatin-Based Coating Solution	Cell Biologics Inc	6950	Used for coating flasks and plates for ECs
ECs Hypoxia Cell Culture Medium	Cell Biologics Inc	GPF1168	ECs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fisher Scientific	MT35011CV	FBS-HI USDA-approved for cell culture and maintenance
Hypoxia Chamber	StemCell Technologies	27310	To create a hypoxic condition with 0.01%O2 environment
Hypoxia Chamber Flow Meter	StemCell Technologies	27311	To connect with hypoxic gas tank for a consistent gas flow speed
Hypoxic Gas Tank (0.01%O2 Cylinder)	A-L Compressed Gases	UN1956	Used to flush hypoxic medium and chamber (0.01%O2/5%CO2/94.99N2)
Microscope	Nikon	TMS	To observe cell condition
Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells (ECs)	Cell Biologics Inc	C57-6093	Isolated from coronary artery of C57BL/6 mice
NUNC 15ML CONICL Tubes	Fisher Scientific	12565269	For cell culture process, experiments, solution preparation etc.
NUNC 50ML CONICL Tubes	Fisher Scientific	12565271	For cell culture process, experiments, solution preparation etc.
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8662	Used for cell washing during culture or experiments
Plate Reader	BioTek Instrument	11120533	Colorimetric or fluorometric plate reading
Reaction 96 Well Palte (clear no lid)	Fisher Scientific	12565226	Used for LDH measurement plate reading
Trypsin/EDTA for CMs	Celprogen Inc	T1509-014	1 x sterile filtered and tissue culture tested
Trypsin/EDTA for ECs	Cell Biologics Inc	6914/0619	0.25%, cell cuture-tested