체외에서 심장 허혈/재관류를 모방하기 위한 세포 공동 배양 모델 개발

요약

공간 거리는 별도의 내피 및 심근 세포 세포층의 공동 배양 모델에서 저산소증 / 재 산소화 손상을 평가하는 핵심 매개 변수이며, 처음으로 공동 배양 공간 환경을 최적화하여 심근 세포 보호에서 내피 세포의 역할을 테스트하기위한 유리한 시험관 내 모델을 제공 할 필요가 있음을 시사합니다.

초록

허혈성 심장 질환은 전 세계적으로 사망 및 장애의 주요 원인입니다. 재관류는 허혈을 넘어 추가적인 부상을 일으킨다. 내피 세포 (ECs)는 세포 - 세포 상호 작용을 통해 재관류 손상으로부터 심근 세포 (CM)를 보호 할 수 있습니다. 공동 배양은 세포 - 세포 상호 작용의 역할을 조사하는 데 도움이 될 수 있습니다. 혼합 공동 배양은 가장 간단한 접근법이지만 단리 처리 및 단일 세포 유형의 하류 분석이 가능하지 않기 때문에 제한됩니다. ECs가 용량 의존적으로 CM 세포 손상을 감쇠시킬 수 있는지 여부와 두 세포주 사이의 접촉 거리를 변화시킴으로써 이러한 보호가 더욱 최적화될 수 있는지 여부를 조사하기 위해, 우리는 마우스 일차 관상동맥 내피 세포와 성인 마우스 심근세포를 사용하여 0.5에서 세포간 층간 거리가 변화한 세 가지 유형의 세포 배양 삽입물을 테스트했습니다. 각각 1.0 및 2.0 mm. CMs-전용에서, 락테이트 데하이드로게나제 (LDH) 방출에 의해 평가된 바와 같은 세포 손상은 저산소증 동안 그리고 거리가 0.5 및 1.0 mm에 비해 2.0 mm일 때 재산소화 시에 유의하게 증가하였다. EC와 CM이 거의 직접 접촉했을 때 (0.5mm), 저산소증에 따른 CM의 재 산소 부상의 경미한 감쇠 만있었습니다. 공간 거리가 1.0mm일 때 이러한 감쇠가 크게 증가하였다. 2.0mm 거리에서, ECs는 저산소증과 저산소증/재산소화 둘 동안 CM 손상을 감쇠시켰으며, 이는 EC가 CM과 교차하는 데 충분한 배양 거리두기가 필요함을 나타내므로, 분비된 신호 분자가 순환하고 보호 경로를 완전히 자극할 수 있다. 우리의 연구 결과는 시뮬레이션 된 허혈 / 재관류 손상에 대한 CM 보호에서 EC의 역할을 테스트하기위한 유리한 시험관 내 모델을 제공하기 위해 EC / CM 공동 배양 공간 환경을 최적화하는 것이 필요하다는 것을 처음으로 시사합니다. 이 보고서의 목표는 조사관이이 중요한 모델을 유리하게 사용할 수있는 단계별 접근 방식을 제공하는 것입니다.

서문

허혈성 심장 질환은 전 세계적으로 사망 및 장애의 주요 원인입니다 ^1,2. 그러나 재관류의 치료 과정 자체가 심근 허혈 / 재관류 (IR) 손상으로 알려진 심근 세포 사망을 유발할 수 있으며 여전히 효과적인 치료법이 없습니다³. 내피 세포 (ECs)는 파라크린 신호의 분비뿐만 아니라 세포 간 상호 작용을 통해 심근 세포 (CMs)를 보호하기 위해 제안되었습니다⁴.

세포 공동 배양 모델은 세포 기능 및 분화에 대한 자가분비 및/또는 파라크린 세포-세포 상호작용의 역할을 조사하기 위해 광범위하게 사용되어 왔다. 공동 배양 모델 중에서, 혼합 공동 배양은 가장 간단하며, 여기서 두 가지 유형의 세포가 원하는 세포 비율⁵로 단일 배양 구획 내에서 직접 접촉합니다. 그러나, 세포 유형 사이의 분리된 처리와 단일 세포 유형의 하류 분석은 혼합 집단을 고려할 때 쉽게 실현 가능하지 않다.

이전의 연구에 따르면 저산소 및 허혈성 모욕은 젖산 탈수소 효소 (LDH)의 방출에 의해 측정 된 세포막의 완전성에 심각한 손상을 일으킨다. 이 부상은 재관류 손상^6,7,8을 모방하여 재산소화시 악화됩니다. 현재 프로토콜의 목표는 EC의 존재가 저산소증 및 재산소화 (HR)로 인한 CM의 세포막 누출을 용량 의존적으로 감쇠시킬 수 있고 두 세포주 간의 접촉 거리를 변화시킴으로써 EC의 보호 효과를 최적화 할 수 있다는 가설을 테스트하는 것이 었습니다. 따라서 우리는 세 가지 유형의 세포 배양 삽입물과 마우스 일차 관상 동맥 내피 세포 및 성인 마우스 심근 세포를 사용했습니다. Corning, Merck Millipore 및 Greiner Bio-One이 브랜드 한 인서트를 통해 세포주 간 거리가 각각 0.5, 1.0 및 2.0mm인 세 가지 세포 배양 누화 조건을 만들 수있었습니다. 각 경우에 인서트당 100,000개의 EC를 도금하였다.

또한, 공동 배양에서 EC의 밀도가 이 모델에서 HR 손상 감쇠에 기여하는지 여부를 결정하기 위해, CMs에 의한 EC 농도와 LDH 방출 사이의 용량-반응 관계를 연구하였다. ECs는 2.0 mm 인서트에서 인서트당 각각 25,000, 50,000 및 100,000으로 플레이팅되었다.

이 보고서는 조사관이이 중요한 모델을 유리하게 사용할 수있는 단계별 접근 방식을 제공합니다.

프로토콜

1. 실험 준비/도금

1. 제조업체의 지침에 따라 CM 및 EC를 유지 관리합니다.
   1. 두 세포주가 공급 업체에서 도착하면 해동하십시오. 신선한 배지로 세척 한 후 T25 플라스크에 접시를 넣으십시오. 세포를 구입 한 동일한 공급 업체로부터 각 세포 배양 배지를 구입하는 것이 좋습니다. 다음날 배지로 세포를 새로 고치고 합류 할 때 사용하십시오.
   2. 세포 배양 인큐베이터를 21% O2, 5% CO2, 74%_N2로 37°C에서 유지하고 가습_된 상태로 유지한다.
      참고: 이 프로토콜에 사용된 마우스 일차 관상동맥 내피 세포는 C57BL/6 마우스의 관상동맥으로부터 분리되고, 성인 마우스 심근세포는 성인 C57BL/6J 마우스 심장으로부터 분리되고 상업적으로 수득된다( 표 참조).
2. 멸균 조건 하에서 플레이트 CM을 24웰 플레이트(열등층)의 바닥에 놓습니다. 24시간 후, 플레이트 ECs를 공동배양 웰의 삽입물(또는 우수한 부분) 내로 넣는다. EC 도금 후 24시간 후, EC 삽입물을 CM 플레이트 베이스 상에 놓고, 공동 배양 기간을 시작한다. 사용 전에 세포를 적어도 12-24 시간 동안 공동 배양하도록 허용하십시오. 이러한 단계는 아래에 자세히 설명되어 있습니다.
   1. 광학 현미경으로 CM 세포주 합류도를 추정한다. 세포가 배양 플라스크에서 90%-100% 합류하는 것으로 보이면, 실험 플레이팅을 진행한다.
   2. 합류성 세포 배양물을 함유하는 플라스크에서 배지를 제거하고 T25 플라스크용 트립신/에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 3-5 mL로 트립신화한다. 플라스크를 부드럽게 교반하고, 37°C에서 2-5분 동안 인큐베이션한 다음, 광학 현미경 하에서 효소 진행을 평가한다. 세포가 둥글기 시작하면 셀 스크레이퍼를 사용하여 표면에서 세포를 분리하십시오.
   3. 분리 후, 트립신/세포 용액을 T25 플라스크용 배지 10mL가 들어있는 50mL 튜브에 첨가하여 트립신 용액을 불활성화시킨다. 세포 현탁액을 120 x g 에서 2분 동안 원심분리하여 연질 세포 펠릿을 얻었다. 상청액을 제거하고 펠렛을 5 mL의 배지에 재현탁시켰다.
   4. 세포 계수를 수행하고 세포 생존율을 확인하려면 재현탁 세포 10μL의 분취량과 10μL의 트리판 블루 염료를 혼합한다. 세포 계수기를 사용하여 살아있는 세포를 계산하십시오. 원하는 파종 밀도를 얻기 위해 세포를 신선한 일반 배지로 희석하십시오. 부피는 원하는 종자 밀도 및 원액의 세포 농도에 따라 계산됩니다. 모든 도금은 멸균 조건에서 수행되어야합니다.
   5. 웰당 300,000의 시딩 밀도에서 세포외 매트릭스로 사전 코팅된 24웰 플레이트의 바닥에 플레이트 CM을 시딩합니다. 세포를₂₁% O2 및 5%_CO2로 하룻밤 동안 37°C에서 유지시킨다.
   6. 24시간 후, EC를 인서트당 100,000의 최적 도금 밀도(배양 면적은 33.6mm2)로 인서트에 플레이트합니다(그림 1). EC 도금 24시간 후, EC 삽입물을 CM 웰 내부에 배치하여 공동 배양을 시작합니다. 실험을 수행하기 전에 세포를 12-24 h 동안 공동 배양하도록 허용하십시오.
   7. 실험이 수행될 때까지 CM과 EC가 모두 80%-90%의 합류율에 도달했는지 확인합니다.

2. 저산소증/재산소화로 허혈/재관류 손상을 체외에서 시뮬레이션하기 위한

참고: 다음 단계는 설명된 대로 수행해야 하며 중간에 일시 중지하지 마십시오.

1. 50 mL 원뿔형 튜브에 ~25 mL의 배지를 부어 저산소 배지를 제조하였다. 실리콘 멤브레인으로 상단을 공기 밀봉하고 멸균 된 피펫을 사용하여 구멍을 뚫습니다. 다른 구멍을 만들면 이번에는 피펫이 미디어에 약 2/3 정도 잠겨 있습니다.
2. 매체를 저산소 가스(0.0125% O2, 5%_CO2, 94.99%_N2)로 30L/min의 유속으로 5분 동안 플러시합니다. 이것은 저산소증이 시작될 때 매체에 용해된_O2를 최소화한다(단계 2.5).
3. 부착된 세포를 함유하는 24-웰 플레이트 또는 배양 인서트의 배지를 버리고 10% 인산염 완충 식염수(PBS)의 100μL/웰로 매우 부드럽게 세척한다. 그 후, 새로 준비된 저산소 배지 500 μL를 플레이트 또는 인서트의 각 웰에 첨가한다.
   참고: 배지의 저산소증은 2.5단계에서 세포와 배지에 대한 진정한 저산소증이 시작되기 전에 이 단계에서 가능한 한 잠깐 중단됩니다.
   1. normoxic 대조군에서는 원래의 배지를 포도당과 혈청을 함유 한 신선한 정상 배지로 교체하십시오.
4. 챔버 내에 멸균수로 채워진 페트리 접시를 배치하여 저산소증 챔버를 가습하십시오. 다음으로, 저산소 그룹을 포함하는 플레이트를 챔버 내로 놓는다.
5. 저산소증 챔버를 저산소 가스 (0.0125% O2, 5%_CO2, 94.99%_N2)로 30 L/min의 흐름에서 5분 동안 플러시하십시오. 챔버를 24시간 동안 37°C 인큐베이터에 놓는다.
6. 저산소증 후 정상적인 조건에서 CM과 EC를 배양하십시오. 이렇게하려면 플레이트 / 인서트의 오래된 배지를 버리고 일반 배지 (포도당 및 혈청 함유; 각 웰 / 인서트의 500 μL)로 교체하고 재관류를 모방하기 위해 2 시간 동안 정상 배양 조건 (₂₁ % O2, 5 %_CO2, 74 %_N2, 37 °C)하에 인큐베이터에 보관하십시오.
7. 배지 대체의 효과를 조절하려면 저산소 배지가 변경되는 것과 동시에 노목산 세포의 배지를 변경하십시오.
   참고: 그림 2 에서는 이 프로토콜에 대한 개략적인 개요를 제공합니다.

3. 엔드포인트 평가

1. 세포 배양 배지를 24-웰 플레이트로부터 96-웰 플레이트로 옮긴다. 24-웰 플레이트의 각 웰로부터 200 μL의 배지를 사용하고, 그에 따라 96-웰 플레이트의 네 웰에 균등하게 분배한다. 노목시아 대 저산소증 대 HR에 대해 각각 하나의 플레이트를 사용하십시오.
2. 세포 손상의 정도를 결정, 예를 들어, 제조자의 지시에 따라 세포독성 분석 키트를 사용하여 LDH에 대한 흡광도를 측정한다. 분석 프로토콜에 지시된 대로 96-웰 플레이트에서 검정을 수행한다.

4. 통계

1. 파라메트릭 데이터를 평균/표준 편차로 표시하고 비모수 데이터를 중앙값/사분위수 범위의 상자 플롯으로 표시합니다. 유형 1 오류의 가능성을 줄이기 위해 허용되는 사후 테스트를 사용하여 적절한 파라메트릭 대 비모수 다중 비교 테스트를 수행해야 합니다. 유의성은 일반적으로 0.05의 알파(두 꼬리)로 설정됩니다.
2. 현재 연구에서 수행 된 모든 실험에 대해 하나의 실험 내에서 적어도 세 번의 웰 반복실험을 수행하십시오. 통계 분석에 사용된 각 실험의 반복은 서너 번이었다.

결과

이 실험에 사용된 세 가지 유형의 삽입물(A, B, C)은 모두 0.4 μm의 동일한 기공 크기를 갖는다. 이들 사이의 유일한 차이점은 인서트-베이스 높이인데, 이는 두 공동 배양된 세포층 사이의 거리가 각각 0.5, 1.0 및 2.0mm가 되도록 허용하고(그림 3), 서로 다른 공급업체에서 온 것이라는 점입니다(자세한 내용은 재료 표 참조).

IR 손상을 시뮬레이션?...

토론

프로토콜의 중요한 단계
세포 공동 배양 모델은 심장 보호의 세포 메커니즘을 연구하기 위해 사용되어 왔습니다. 따라서 두 개의 서로 의미있는 거리를 가진 두 개의 개별 레이어를 만드는 방법은 적절한 공동 문화 모델을 개발하는 데 중요합니다. 시뮬레이션 된 IR, 즉 HR을 연구 할 때의 도전은 허혈 (저산소증) 자체뿐만 아니라 재관류 (재 산소화)가 세포 기능 장애를 악화시킨다는...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adult Mouse Cardiomyocytes (CMs)	Celprogen Inc	11041-14	Isolated from adult C57BL/6J mouse cardiac tissue
Automated Cell Counter Countess II	Invitrogen	A27977	Cell counting for calculating cell numbers
Bio-Safety Cabinet	Nuaire	NU425400	Cell culture sterile hood
Cell Culture Freezing Medium	Cell Biologics Inc	6916	Used for cell freezing for long term cell line storage
Cell Culture Incubator	Nuaire	Nu-5500	To provide normal cell living condition (21%O2, 5%CO2, 74%N2, 37°C, humidified)
Cell Culture Incubator Gas Tank	A-L Compressed Gases	UN1013	Gas needed for cell culture incubator
Cell Culture Inserts A (0.5 mm)	Corning Inc	353095	Used for EC-CM co-culture
Cell Culture Inserts B (1.0 mm)	Millicell Millipore	PIHP01250	Used for EC-CM co-culture
Cell Culture Inserts C (2.0 mm)	Greiner Bio-One	662640	Used for EC-CM co-culture
Centrifuge	Anstel Enterprises Inc	4235	For cell culture plating and passaging
CMs Cell Culture Flasks T25	Celprogen Inc	E11041-14	Used for CMs regular culture, coated by manufacturer
CMs Cell Culture Medium Complete	Celprogen Inc	M11041-14S	CMs culture complete medium
CMs Cell Culture Medium Complete Phenol free	Celprogen Inc	M11041-14PN	CMs culture medium without phenol red used during LDH measurement
CMs Cell Culture Plates 96 well	Celprogen Inc	E11041-14-96well	Used for experiments of LDH measurement, coated by manufacturer
CMs Hypoxia Cell Culture Medium	Celprogen Inc	M11041-14GFPN	CMs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)
Countess cell counting chamber slides	Invitrogen	C10283	Counting slides used for cell counter
Cyquant LDH Cytotoxicity Kit	Thermo Scientific	C20301	LDH measurement kit
ECs Cell Culture Flasks T25	Fisher Scientific	FB012935	Used for ECs regular culture
ECs Cell Culture Medium Complete	Cell Biologics Inc	M1168	ECs culture complete medium
ECs Cell Culture Medium Complete Phenol free	Cell Biologics Inc	M1168PF	ECs culture medium without phenol red used during LDH measurement
ECs Cell Culture Plates 96 well	Fisher Scientific (Costar)	3370	Used for experiments of LDH measurement
ECs Culture Gelatin-Based Coating Solution	Cell Biologics Inc	6950	Used for coating flasks and plates for ECs
ECs Hypoxia Cell Culture Medium	Cell Biologics Inc	GPF1168	ECs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fisher Scientific	MT35011CV	FBS-HI USDA-approved for cell culture and maintenance
Hypoxia Chamber	StemCell Technologies	27310	To create a hypoxic condition with 0.01%O2 environment
Hypoxia Chamber Flow Meter	StemCell Technologies	27311	To connect with hypoxic gas tank for a consistent gas flow speed
Hypoxic Gas Tank (0.01%O2 Cylinder)	A-L Compressed Gases	UN1956	Used to flush hypoxic medium and chamber (0.01%O2/5%CO2/94.99N2)
Microscope	Nikon	TMS	To observe cell condition
Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells (ECs)	Cell Biologics Inc	C57-6093	Isolated from coronary artery of C57BL/6 mice
NUNC 15ML CONICL Tubes	Fisher Scientific	12565269	For cell culture process, experiments, solution preparation etc.
NUNC 50ML CONICL Tubes	Fisher Scientific	12565271	For cell culture process, experiments, solution preparation etc.
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8662	Used for cell washing during culture or experiments
Plate Reader	BioTek Instrument	11120533	Colorimetric or fluorometric plate reading
Reaction 96 Well Palte (clear no lid)	Fisher Scientific	12565226	Used for LDH measurement plate reading
Trypsin/EDTA for CMs	Celprogen Inc	T1509-014	1 x sterile filtered and tissue culture tested
Trypsin/EDTA for ECs	Cell Biologics Inc	6914/0619	0.25%, cell cuture-tested