Sviluppo di un modello di co-coltura cellulare per imitare l'ischemia/riperfusione cardiaca in vitro

Riepilogo

La distanza spaziale è un parametro chiave nella valutazione del danno da ipossia/riossigenazione in un modello di co-coltura di strati cellulari endoteliali e cardiomiociti separati, suggerendo, per la prima volta, che l'ottimizzazione dell'ambiente spaziale di co-coltura è necessaria per fornire un modello in vitro favorevole per testare il ruolo delle cellule endoteliali nella protezione dei cardiomiociti.

Abstract

La cardiopatia ischemica è la principale causa di morte e disabilità in tutto il mondo. La riperfusione provoca ulteriori lesioni oltre l'ischemia. Le cellule endoteliali (CE) possono proteggere i cardiomiociti (CM) dalle lesioni da riperfusione attraverso le interazioni cellula-cellula. Le co-colture possono aiutare a studiare il ruolo delle interazioni cellula-cellula. Una co-coltura mista è l'approccio più semplice, ma è limitata in quanto i trattamenti isolati e le analisi a valle di singoli tipi di cellule non sono fattibili. Per indagare se le CE possono attenuare in modo dose-dipendente il danno alle cellule CM e se questa protezione può essere ulteriormente ottimizzata variando la distanza di contatto tra le due linee cellulari, abbiamo utilizzato le cellule endoteliali dell'arteria coronaria primaria del topo e i cardiomiociti del topo adulto per testare tre tipi di inserti di coltura cellulare che variavano nella loro distanza dello strato intercellulare a 0,5, 1,0 e 2,0 mm, rispettivamente. Solo nelle CM, il danno cellulare valutato dal rilascio di lattato deidrogenasi (LDH) è aumentato significativamente durante l'ipossia e ulteriormente dopo la riossigenazione quando la distanza era di 2,0 mm rispetto a 0,5 e 1,0 mm. Quando le EC e le CM erano in contatto quasi diretto (0,5 mm), c'era solo una lieve attenuazione del danno da riossigenazione delle CM a seguito di ipossia. Questa attenuazione è stata significativamente aumentata quando la distanza spaziale era di 1,0 mm. Con una distanza di 2,0 mm, le CE hanno attenuato la lesione della CM sia durante l'ipossia che durante l'ipossia / riossigenazione, indicando che è necessario un sufficiente distanziamento di coltura per le CE per incrociare la diafonia con le CM, in modo che le molecole segnale secrete possano circolare e stimolare completamente le vie protettive. I nostri risultati suggeriscono, per la prima volta, che l'ottimizzazione dell'ambiente spaziale di co-coltura EC/CM è necessaria per fornire un modello in vitro favorevole per testare il ruolo degli EC nella protezione CM contro le lesioni da ischemia/riperfusione simulate. L'obiettivo di questo rapporto è quello di fornire un approccio passo-passo per gli investigatori per utilizzare questo importante modello a loro vantaggio.

Introduzione

La cardiopatia ischemica è la principale causa di morte e disabilità in tutto il mondo ^1,2. Tuttavia, il processo di trattamento della riperfusione può causare la morte dei cardiomiociti, nota come lesione da ischemia / riperfusione miocardica (IR), per la quale non esiste ancora un rimedio efficace³. Le cellule endoteliali (CE) sono state suggerite per proteggere i cardiomiociti (CM) attraverso la secrezione di segnali paracrini, nonché le interazioni cellula-cellula⁴.

I modelli di co-coltura cellulare sono stati ampiamente utilizzati per studiare il ruolo delle interazioni cellula-cellula autocrine e/o paracrine sulla funzione e la differenziazione cellulare. Tra i modelli di co-coltura, la co-coltura mista è la più semplice, in cui due diversi tipi di cellule sono in contatto diretto all'interno di un singolo compartimento di coltura con un rapporto cellulare desiderato⁵. Tuttavia, trattamenti separati tra tipi di cellule e analisi a valle di un singolo tipo di cellula non sono prontamente fattibili data la popolazione mista.

Studi precedenti hanno indicato che gli insulti ipossici e ischemici causano danni significativi all'integrità della membrana cellulare misurata dal rilascio di lattato deidrogenasi (LDH). Questa lesione è peggiorata con la riossigenazione, imitando la lesione da riperfusione ^6,7,8. L'obiettivo dell'attuale protocollo era quello di testare le ipotesi che la presenza di EC possa attenuare in modo dose-dipendente la perdita di CM della membrana cellulare causata da ipossia e riossigenazione (HR) e che l'effetto protettivo degli EC possa essere ottimizzato variando la distanza di contatto tra le due linee cellulari. Pertanto, abbiamo impiegato tre tipi di inserti di coltura cellulare e cellule endoteliali coronariche primarie di topo e cardiomiociti di topo adulti. Gli inserti, marchiati da Corning, Merck Millipore e Greiner Bio-One, ci hanno permesso di creare tre diverse condizioni di diafonia della coltura cellulare con distanze intercellulari di 0,5, 1,0 e 2,0 mm, rispettivamente. 100.000 CE sono stati placcati per inserto in ciascun caso.

Inoltre, al fine di determinare se la densità delle CE in cocoltura contribuisca all'attenuazione del danno hr in questo modello, abbiamo studiato la relazione dose-risposta tra concentrazione CE e rilascio di LDH da parte dei CM. Le CE sono state placcate rispettivamente a 25.000, 50.000 e 100.000 per inserto, nell'inserto da 2,0 mm.

Questo rapporto fornisce un approccio passo-passo per gli investigatori per utilizzare questo importante modello a loro vantaggio.

Protocollo

1. Preparazione/placcatura sperimentale

1. Mantenere CM ed EC secondo le istruzioni del produttore.
   1. Scongelare entrambe le linee cellulari quando arrivano dai fornitori. Piastra in palloni T25 dopo essere stata lavata con mezzi freschi. Si consiglia di acquistare ogni terreno di coltura cellulare dagli stessi fornitori da cui sono state acquistate le cellule. Il giorno successivo, aggiornare le celle con i supporti e utilizzarle quando sono confluenti.
   2. Mantenere l'incubatore di colture cellulari a 37 °C con 21% O₂, 5% CO₂, 74% N₂ e mantenerlo umidificato.
      NOTA: Le cellule endoteliali dell'arteria coronaria primaria del topo utilizzate in questo protocollo sono isolate dalle arterie coronarie dei topi C57BL/6 e i cardiomiociti di topo adulti sono isolati da cuori di topo C57BL/6J adulti e ottenuti commercialmente (vedere Tabella dei materiali).
2. Cm di piastre in condizioni sterili sul fondo di piastre a 24 pozzetti (strato inferiore). 24 ore dopo, placcare ECs nell'inserto (o porzione superiore) del pozzo di co-coltura. 24 ore dopo la placcatura CE, posizionare gli inserti EC su basi di piastre CM, iniziando il periodo di co-coltura. Lasciare che le cellule co-colturano per almeno 12-24 ore prima dell'uso. Questi passaggi sono descritti in dettaglio di seguito.
   1. Stimare la confluenza della linea cellulare CM al microscopio ottico. Quando le cellule sembrano essere confluenti al 90%-100% nei palloni di coltura, procedere con la placcatura sperimentale.
   2. Rimuovere il materiale dai palloni contenenti colture cellulari confluenti e tripsinizzare con 3-5 mL di tripsina/acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) per i palloni T25. Agitare delicatamente il matraccio, incubare a 37 °C per 2-5 minuti, quindi valutare i progressi enzimatici al microscopio ottico. Una volta che le cellule iniziano ad arrotondare, utilizzare un raschietto cellulare per staccare le cellule dalla superficie.
   3. Dopo il distacco, inattivare la soluzione di tripsina aggiungendo la soluzione di tripsina/cella a un tubo da 50 mL contenente 10 mL di fluido per i palloni T25. Centrifugare la sospensione cellulare a 120 x g per 2 minuti per ottenere un pellet a celle morbide. Rimuovere il surnatante e risospesciare il pellet in 5 ml di supporto.
   4. Per eseguire il conteggio cellulare e confermare la vitalità cellulare, mescolare un'aliquota di 10 μL di cellule risospese e 10 μL di colorante blu di tripano. Conta le cellule viventi usando un contatore di celle. Diluire le cellule con mezzi regolari freschi per ottenere le densità di semina desiderate. I volumi sono calcolati in base alla densità di seme desiderata e alla concentrazione cellulare delle soluzioni madre. Tutta la placcatura deve essere eseguita in condizioni sterili.
   5. CM di piastra a densità di semina di 300.000 per pozzetto sul fondo di una piastra a 24 pozzetti pre-rivestita con matrice extracellulare. Mantenere le celle a 37 °C con il 21% di O_{2 e} il 5% di CO₂ durante la notte.
   6. Dopo 24 ore, le cec della piastra in inserti ad una densità di placcatura ottimale di 100.000 per inserto (l'area di coltura è di 33,6 mm²) (Figura 1). Dopo 24 ore di placcatura CE, posizionare gli inserti EC all'interno dei pozzetti CM, avviando la co-coltura. Consentire alle cellule di co-coltivare per 12-24 ore prima di eseguire gli esperimenti.
   7. Assicurarsi che, al momento dell'esecuzione degli esperimenti, sia i CM che gli EC abbiano raggiunto l'80%-90% di confluenza.

2. Ipossia/reossigenazione per simulare ischemia/danno da riperfusione in vitro

NOTA: i seguenti passaggi devono essere eseguiti come descritto, non mettere in pausa nel mezzo.

1. Preparare il mezzo ipossico versando ~ 25 ml di media in un tubo conico da 50 ml. Sigillare ad aria la parte superiore con una membrana in silicone e utilizzare una pipetta sterilizzata per praticare un foro. Creare un altro foro, questa volta lasciando la pipetta immersa di circa 2/3 nel supporto.
2. Lavare il fluido con gas ipossico (0,0125% O₂, 5% CO₂, 94,99% N₂) per 5 minuti ad una portata di 30 L/min. Ciò riduce al minimo l'O₂ disciolto nel mezzo quando inizia l'ipossia (passaggio 2.5).
3. Scartare il mezzo delle piastre a 24 pozzetti o degli inserti di coltura contenenti cellule attaccate e lavare con 100 μL/pozzetto di 10% di fosfato tamponato saline (PBS) molto delicatamente. Successivamente, aggiungere 500 μL del mezzo ipossico appena preparato a ciascun pozzetto delle piastre o degli inserti.
   NOTA: l'ipossia nei media viene interrotta il più brevemente possibile durante questo passaggio prima che la vera ipossia per le cellule e i media inizi nel passaggio 2.5.
   1. Nel gruppo di controllo normossico, sostituire il supporto originale con mezzo normale fresco contenente glucosio e siero.
4. Umidificare la camera dell'ipossia posizionando una capsula di Petri riempita con acqua sterile all'interno della camera. Quindi, posizionare le piastre che comprendono i gruppi ipossici nella camera.
5. Lavare la camera dell'ipossia con gas ipossico (0,0125% O₂, 5% CO₂, 94,99% N₂) per 5 minuti ad una portata di 30 L/min. Posizionare la camera nell'incubatrice a 37 °C per 24 ore.
6. Dopo l'ipossia, coltivare CM ed EC in condizioni normali. Per fare ciò, scartare il vecchio mezzo delle piastre/inserti, sostituirlo con un mezzo normale (contenente glucosio e siero; 500 μL di ciascun pozzetto/inserto) e conservarlo nell'incubatore in condizioni normali di coltura (21% O₂, 5% CO₂, 74% N₂, 37 °C) per 2 ore per imitare la riperfusione.
7. Per controllare eventuali effetti della sostituzione dei supporti, modificare il mezzo delle cellule normossiche contemporaneamente alla modifica del mezzo ipossico.
   Nota : figura 2 fornisce una panoramica schematica di questo protocollo.

3. Valutazione degli endpoint

1. Trasferire il terreno di coltura cellulare dalla piastra a 24 pozzetti in una piastra a 96 pozzetti. Utilizzare 200 μL di mezzi da ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti e distribuire equamente in quattro pozzetti della piastra da 96 pozzetti, di conseguenza. Utilizzare una piastra ciascuno per normossia contro ipossia contro HR.
2. Determinare il grado di lesione cellulare, ad esempio, misurando l'assorbanza per LDH utilizzando un kit di analisi della citotossicità seguendo le istruzioni del produttore. Eseguire il test in una piastra a 96 pozzetti come indicato nel protocollo di analisi.

4. Statistiche

1. Visualizzare i dati parametrici come deviazione media/standard e i dati non parametrici come box plot con intervallo mediano/interquartile. Dovrebbero essere eseguiti adeguati test di confronto multiplo parametrico rispetto a quelli non parametrici con test post-hoc accettabili per ridurre la possibilità di un errore di tipo 1. La significatività è in genere impostata su un alfa di 0,05 (a due code).
2. Per tutti gli esperimenti condotti nel presente studio, eseguire almeno tre ben replicati all'interno di un esperimento. C'erano da tre a sei ripetizioni di ogni esperimento utilizzato per l'analisi statistica.

Risultati

Tutti e tre i tipi di inserti (A, B, C) utilizzati in questo esperimento hanno la stessa dimensione dei pori di 0,4 μm. L'unica differenza tra loro è l'altezza da inserto a base, che consente alle distanze tra i due strati cellulari co-coltivati di essere rispettivamente di 0,5, 1,0 e 2,0 mm (Figura 3) e che provengono da fornitori diversi (per i dettagli vedere Tabella dei materiali).

Per stabilire un modello di co-coltura in vitro con...

Discussione

Passaggi critici nel protocollo
Modelli di co-coltura cellulare sono stati utilizzati per studiare i meccanismi cellulari di cardioprotezione. Come creare due strati separati con una distanza significativa tra loro è, quindi, cruciale per lo sviluppo di un modello di co-cultura adatto. Una sfida nello studio della lesione IR simulata, cioè HR, è che non solo l'ischemia (ipossia) stessa, ma anche la riperfusione (reossigenazione) aggrava la disfunzione cellulare. Pertanto, un modello realistico deve...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adult Mouse Cardiomyocytes (CMs)	Celprogen Inc	11041-14	Isolated from adult C57BL/6J mouse cardiac tissue
Automated Cell Counter Countess II	Invitrogen	A27977	Cell counting for calculating cell numbers
Bio-Safety Cabinet	Nuaire	NU425400	Cell culture sterile hood
Cell Culture Freezing Medium	Cell Biologics Inc	6916	Used for cell freezing for long term cell line storage
Cell Culture Incubator	Nuaire	Nu-5500	To provide normal cell living condition (21%O2, 5%CO2, 74%N2, 37°C, humidified)
Cell Culture Incubator Gas Tank	A-L Compressed Gases	UN1013	Gas needed for cell culture incubator
Cell Culture Inserts A (0.5 mm)	Corning Inc	353095	Used for EC-CM co-culture
Cell Culture Inserts B (1.0 mm)	Millicell Millipore	PIHP01250	Used for EC-CM co-culture
Cell Culture Inserts C (2.0 mm)	Greiner Bio-One	662640	Used for EC-CM co-culture
Centrifuge	Anstel Enterprises Inc	4235	For cell culture plating and passaging
CMs Cell Culture Flasks T25	Celprogen Inc	E11041-14	Used for CMs regular culture, coated by manufacturer
CMs Cell Culture Medium Complete	Celprogen Inc	M11041-14S	CMs culture complete medium
CMs Cell Culture Medium Complete Phenol free	Celprogen Inc	M11041-14PN	CMs culture medium without phenol red used during LDH measurement
CMs Cell Culture Plates 96 well	Celprogen Inc	E11041-14-96well	Used for experiments of LDH measurement, coated by manufacturer
CMs Hypoxia Cell Culture Medium	Celprogen Inc	M11041-14GFPN	CMs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)
Countess cell counting chamber slides	Invitrogen	C10283	Counting slides used for cell counter
Cyquant LDH Cytotoxicity Kit	Thermo Scientific	C20301	LDH measurement kit
ECs Cell Culture Flasks T25	Fisher Scientific	FB012935	Used for ECs regular culture
ECs Cell Culture Medium Complete	Cell Biologics Inc	M1168	ECs culture complete medium
ECs Cell Culture Medium Complete Phenol free	Cell Biologics Inc	M1168PF	ECs culture medium without phenol red used during LDH measurement
ECs Cell Culture Plates 96 well	Fisher Scientific (Costar)	3370	Used for experiments of LDH measurement
ECs Culture Gelatin-Based Coating Solution	Cell Biologics Inc	6950	Used for coating flasks and plates for ECs
ECs Hypoxia Cell Culture Medium	Cell Biologics Inc	GPF1168	ECs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fisher Scientific	MT35011CV	FBS-HI USDA-approved for cell culture and maintenance
Hypoxia Chamber	StemCell Technologies	27310	To create a hypoxic condition with 0.01%O2 environment
Hypoxia Chamber Flow Meter	StemCell Technologies	27311	To connect with hypoxic gas tank for a consistent gas flow speed
Hypoxic Gas Tank (0.01%O2 Cylinder)	A-L Compressed Gases	UN1956	Used to flush hypoxic medium and chamber (0.01%O2/5%CO2/94.99N2)
Microscope	Nikon	TMS	To observe cell condition
Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells (ECs)	Cell Biologics Inc	C57-6093	Isolated from coronary artery of C57BL/6 mice
NUNC 15ML CONICL Tubes	Fisher Scientific	12565269	For cell culture process, experiments, solution preparation etc.
NUNC 50ML CONICL Tubes	Fisher Scientific	12565271	For cell culture process, experiments, solution preparation etc.
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8662	Used for cell washing during culture or experiments
Plate Reader	BioTek Instrument	11120533	Colorimetric or fluorometric plate reading
Reaction 96 Well Palte (clear no lid)	Fisher Scientific	12565226	Used for LDH measurement plate reading
Trypsin/EDTA for CMs	Celprogen Inc	T1509-014	1 x sterile filtered and tissue culture tested
Trypsin/EDTA for ECs	Cell Biologics Inc	6914/0619	0.25%, cell cuture-tested