פיתוח מודל של תרבות משותפת של תאים כדי לחקות איסכמיה לב/רפרטפוזיה במבחנה במבחנה

Summary

מרחק מרחבי הוא פרמטר מרכזי בהערכת פגיעה היפוקסיה/ראוקסיגניה במודל של תרבות משותפת של שכבות תאי אנדותל וקרדיומיוציטים נפרדות, מה שמרמז, לראשונה, כי אופטימיזציה של הסביבה המרחבית של תרבות משותפת נחוצה כדי לספק מודל הפריה חוץ גופית חיובי לבדיקת התפקיד של תאי אנדותל בהגנה על קרדיומיוציטים.

Abstract

מחלת לב איסכמית היא הגורם המוביל למוות ולמוגבלות ברחבי העולם. רפרטפוזיה גורמת לפציעה נוספת מעבר לאיסכמיה. תאי אנדותל (ECs) יכולים להגן על קרדיומיוציטים (CMs) מפני פגיעה ברפרטוזיה באמצעות אינטראקציות בין תאים לתאים. תרבויות משותפות יכולות לעזור לחקור את התפקיד של אינטראקציות בין תאים לתאים. תרבות משותפת מעורבת היא הגישה הפשוטה ביותר, אך מוגבלת מכיוון שטיפולים מבודדים וניתוחים במורד הזרם של סוגי תאים בודדים אינם אפשריים. כדי לחקור אם ECs יכול למנות תלוי מינון להחליש נזק לתאי CM והאם הגנה זו יכולה להיות ממוטבת עוד יותר על ידי שינוי מרחק המגע בין שני קווי התאים, השתמשנו בתאי אנדותל עורק הכלילי הראשי של העכבר הראשי ובקרדיומיוציטים של עכבר בוגר כדי לבדוק שלושה סוגים של תוספות תרבית תאים שהשתנו במרחק השכבה הבין-תאית שלהם ב- 0.5, 1.0, ו 2.0 מ"מ, בהתאמה. ב- CMs בלבד, פגיעה תאית כפי שהוערכה על ידי שחרור לקטט דהידרוגנאז (LDH) גדלה באופן משמעותי במהלך היפוקסיה ובהמשך על reoxygenation כאשר המרחק היה 2.0 מ"מ לעומת 0.5 ו 1.0 מ"מ. כאשר ECs וCMs היו במגע כמעט ישיר (0.5 מ"מ), היה רק החלקה קלה של פגיעה reoxygenation של CMs בעקבות היפוקסיה. הנחתה זו הוגדלה באופן משמעותי כאשר המרחק המרחבי היה 1.0 מ"מ. עם מרחק של 2.0 מ"מ, ECs החלישו פגיעת CM במהלך היפוקסיה והיפוקסיה / reoxygenation, המציין כי התרחקות תרבותית מספקת נחוצה עבור ECs כדי להצליב עם CMs, כך מולקולות אות מופרש יכול להסתובב ולעורר באופן מלא מסלולי הגנה. הממצאים שלנו מראים, בפעם הראשונה, כי אופטימיזציה של הסביבה המרחבית של תרבות משותפת EC / CM נחוצה כדי לספק מודל הפריה חוץ גופית חיובי לבדיקת התפקיד של ECs בהגנה CM מפני איסכמיה מדומה / פגיעה reperfusion. מטרתו של דו"ח זה היא לספק גישה צעד אחר צעד לחוקרים להשתמש במודל חשוב זה לטובתם.

Introduction

מחלת לב איסכמית היא הגורם המוביל למוות ונכות ברחבי העולם ^1,2. עם זאת, תהליך הטיפול של רפרטפוזיה יכול עצמו לגרום למוות cardiomyocyte, המכונה איסכמיה שריר הלב / רפרטפוזיה (IR) פגיעה, אשר עדיין אין תרופה יעילה³. תאי אנדותל (ECs) הוצעו להגן על cardiomyocytes (CMs) באמצעות הפרשת אותות paracrine, כמו גם אינטראקציות תא לתא⁴.

מודלים של תרבות משותפת של תאים שימשו בהרחבה כדי לחקור את התפקיד של אינטראקציות אוטוקרין ו/או פראקרין תא-תא על תפקוד התא וההבחנה. בין מודלים של תרבות משותפת, תרבות משותפת מעורבת היא הפשוטה ביותר, שבה שני סוגים שונים של תאים נמצאים במגע ישיר בתוך תא תרבות יחיד ביחס התא הרצוי⁵. עם זאת, טיפולים נפרדים בין סוגי תאים וניתוח במורד הזרם של סוג תא יחיד אינם אפשריים בקלות בהתחשב באוכלוסייה המעורבת.

מחקרים קודמים הצביעו על כך עלבונות היפוקסיים ואיסכמיים לגרום נזק משמעותי לשלמות של קרום התא כפי שנמדד על ידי שחרורו של לקטט דהידרוגנאז (LDH). פציעה זו מחמירה עם reoxygenation, מחקה פגיעה reperfusion ^6,7,8. מטרת הפרוטוקול הנוכחי הייתה לבדוק את ההשערות כי נוכחותם של רדיקלים אלקטרוניים יכולה להחליש באופן תלוי במינון דליפת קרום התא של CMs הנגרמת על ידי היפוקסיה ו reoxygenation (HR) וכי ההשפעה המגנה של ECs ניתן למטב על ידי שינוי מרחק המגע בין שני קווי התא. לכן, העסקנו שלושה סוגים של תוספות תרבית תאים ותאי אנדותל עורקים כליליים עיקריים עכבר ו Cardiomyocytes עכבר מבוגר. התוספות, ממותגות על ידי קורנינג, מרק מיליפור, ו Greiner Bio-One אפשרו לנו ליצור שלושה תנאים שונים של תרבית תאים צולבת עם מרחקי קו בין תאים של 0.5, 1.0 ו -2.0 מ"מ, בהתאמה. 100,000 ECs היו מצופים לכל הוספה בכל מקרה.

בנוסף, על מנת לקבוע אם הצפיפות של ECs בתרבות משותפת תורמת להחלשת פגיעה במשאבי אנוש במודל זה, חקרנו את יחסי תגובת המינון בין ריכוז EC לשחרור LDH על ידי CMs. ECs היו מצופים ב 25,000, 50,000 ו 100,000 לכל הוספה, בהתאמה, בתוספת 2.0 מ"מ.

דו"ח זה מספק גישה צעד אחר צעד לחוקרים להשתמש במודל חשוב זה לטובתם.

Protocol

1. הכנה/ציפוי ניסיוני

1. שמור על CMs ו- ECs בהתאם להוראות היצרן.
   1. להפשיר את שני קווי התא כאשר הם מגיעים מספקים. צלחת בבקבוקונים T25 לאחר שטף עם מדיה טרייה. מומלץ לרכוש כל מדיה של תרבית תאים מאותם ספקים שמהם נרכשו התאים. למחרת, רענן את התאים עם מדיה והשתמש כאשר הם נפגשים.
   2. לשמור על אינקובטור תרבית התא ב 37 °C (37 °F) עם 21% O₂, 5% CO₂, 74% N₂ ולשמור אותו לח.
      הערה: תאי אנדותל העורק הכליליים העיקריים המשמשים בפרוטוקול זה מבודדים מעורקים כלילית של עכברי C57BL/6, וקרדיומיוציטים של עכברים בוגרים מבודדים מלבבות עכבר C57BL/ 6J בוגרים ומתקבלים באופן מסחרי (ראה טבלת חומרים).
2. לוחות CMs בתנאים סטריליים על החלק התחתון של לוחות 24 בארות (שכבה נחותה). 24 שעות מאוחר יותר, צלחת ECs לתוך הכנס (או חלק מעולה) של התרבות המשותפת היטב. 24 שעות לאחר ציפוי EC, מקם תוספות EC על בסיס לוח CM, החל את תקופת התרבות המשותפת. אפשר לתאים להתאים לתרבות משותפת למשך 12-24 שעות לפחות לפני השימוש. שלבים אלה מתוארים בפירוט להלן.
   1. הערכת מפגש קו תא CM תחת מיקרוסקופ אור. כאשר תאים נראים 90%-100% מפגש בבקבוקי תרבות, להמשיך עם ציפוי ניסיוני.
   2. הסר את המדיה מן הבקבוקונים המכילים תרביות תאים בולווים ו trypsinize עם 3-5 מ"ל של חומצה טריפסין / אתילנדימינטטטראסטית (EDTA) עבור בקבוקונים T25. להסעיר את הבקבוק בעדינות, לדגור ב 37 °C (5 °F) במשך 2-5 דקות, ולאחר מכן להעריך את ההתקדמות אנזימטית תחת מיקרוסקופ אור. לאחר שהתאים מתחילים לעגל כלפי מעלה, השתמש במגרד תאים כדי לנתק את התאים מפני השטח.
   3. לאחר הניתוק, להשבית את פתרון הטריפסין על ידי הוספת פתרון טריפסין / תא לצינור 50 מ"ל המכיל 10 מ"ל של מדיה עבור צלוחיות T25. צנטריפוגה השעיית התא ב 120 x g במשך 2 דקות כדי לקבל גלולה תא רך. הסר את supernatant ו resuspend את הכדור ב 5 מ"ל של מדיה.
   4. כדי לבצע ספירת תאים ולאשר את הכדאיות של התא, לערבב aliquot של 10 μL של תאים resuspended ו 10 μL של צבע כחול טריפאן. ספור את התאים החיים באמצעות מונה תאים. לדלל את התאים עם מדיה רגילה טרייה כדי להשיג את צפיפות הזריעה הרצויה. כרכים מחושבים בהתאם לצפיפות הזרעים הרצויה וריכוז התאים של פתרונות מלאי. כל הציפוי צריך להתבצע בתנאים סטריליים.
   5. CMs צלחת בצפיפות זריעה של 300,000 לבאר על החלק התחתון של צלחת 24 באר מצופה מראש עם מטריצה חוץ תאית. לשמור על התאים ב 37 °C (55 °F) עם 21% O_{2 ו} 5% CO₂ לילה.
   6. לאחר 24 שעות, לוח ECs לתוך תוספות בצפיפות ציפוי אופטימלית של 100,000 לכל הוספה (שטח התרבות הוא 33.6 מ"מ²), (איור 1). לאחר 24 שעות של ציפוי EC, למקם EC מוסיף בתוך בארות CM, ייזום תרבות משותפת. אפשר לתאים לתרבות משותפת למשך 12-24 שעות לפני ביצוע הניסויים.
   7. ודא כי עד לביצוע הניסויים, הן ספקי שירותי אינטרנט והן מחשבים אלקטרוניים הגיעו למפגש של 80%-90%.

2. היפוקסיה/reoxygenation כדי לדמות איסכמיה / פגיעה reperfusion במבחנה

הערה: השלבים הבאים צריכים להתבצע כמתואר, לא להשהות בין לבין.

1. הכן את המדיה היפוקסית על ידי שפיכת ~ 25 מ"ל של מדיה בצינור חרוטי 50 מ"ל. יש לאטום את החלק העליון עם קרום סיליקון ולהשתמש בפיפטה מעוקרת כדי לנקב חור. צור חור נוסף, הפעם משאיר את פיפטה שקועה כ 2/3 לתוך התקשורת.
2. לשטוף את המדיה עם גז היפוקסי (0.0125% O₂, 5% CO₂, 94.99% N₂) במשך 5 דקות בקצב זרימה של 30 ליטר / דקה. פעולה זו ממזערת O₂ מומס במדיה כאשר היפוקסיה מתחילה (שלב 2.5).
3. השלך את המדיה של 24-well-wells או תוספות תרבות המכילות תאים מצורפים ולשטוף עם 100 μL / היטב של 10% תמיסת מלח מאגר פוספט (PBS) בעדינות רבה. לאחר מכן, להוסיף 500 μL של מדיה היפוקסית טרי מוכן לכל באר של הצלחות או מוסיף.
   הערה: היפוקסיה במדיה מופרעת בקצרה ככל האפשר במהלך שלב זה לפני היפוקסיה אמיתית עבור תאים ומדיה מתחילה בשלב 2.5.
   1. בקבוצת הביקורת הנורמוקסית, החלף את המדיה המקורית במדיה רגילה ורעננה המכילה גלוקוז וסרום.
4. לחות את תא היפוקסיה על ידי הצבת צלחת פטרי מלא מים סטריליים בתוך החדר. לאחר מכן, מניחים את הצלחות המרכיבות את הקבוצות ההיפוקסיות לתוך התא.
5. לשטוף את תא היפוקסיה עם גז היפוקסי (0.0125% O₂, 5% CO₂, 94.99% N₂) במשך 5 דקות בזרימה של 30 ליטר / דקה. מניחים את התא באינקובטור 37 °C (37 °F) במשך 24 שעות.
6. לאחר היפוקסיה, לטפח CMs ו- ECs בתנאים רגילים. לשם כך, השליכו את המדיה הישנה של הלוחות/תוספות, החליפו אותה במדיה רגילה (המכילה גלוקוז וסרום; 500 μL של כל באר/הוספה) ואחסנו אותה באינקובטור בתנאי תרבות רגילים (21% O₂, 5% CO₂, 74% N₂, 37 °C (37 °C) למשך 2 שעות כדי לחקות רפורמציה.
7. כדי לשלוט בהשפעות כלשהן של החלפת מדיה, שנה את המדיה של תאים נורמוקסיים בו-זמנית עם שינוי המדיה ההיפוקסית.
   הערה: איור 2 מספק סקירה סכמטית של פרוטוקול זה.

3. הערכת נקודות קצה

1. העבר את מדיית תרבית התאים מלוחית 24 הבאר לצלחת של 96 בארות. השתמש 200 μL של מדיה מכל באר של צלחת 24-well ולהפיץ באותה מידה לארבע בארות של צלחת 96-well, בהתאם. השתמש צלחת אחת כל אחד לנורמוקסיה לעומת היפוקסיה לעומת משאבי אנוש.
2. לקבוע את מידת הפגיעה התאית, למשל, על ידי מדידת ספיגה עבור LDH באמצעות ערכת בדיקת ציטוטוקסיות בהתאם להוראות היצרן. בצע את הבדיקה בלוחית 96-well כפי שהונחה בפרוטוקול הבדיקה.

4. סטטיסטיקה

1. הצג את הנתונים הפרמטריים כסטיית תקן/ממוצעת ונתונים שאינם פרמטריים כהתווי תיבות עם טווח חציון/בין-שוויוני. בדיקות השוואות פרמטריות נאותות לעומת בדיקות השוואות מרובות שאינן פרמטריות עם בדיקות פוסט-הוק מקובלות כדי להקטין את הסיכוי לשגיאה מסוג 1 יש לבצע. המשמעות מוגדרת בדרך כלל באלפא של 0.05 (דו-זנבי).
2. עבור כל הניסויים שבוצעו במחקר הנוכחי, לבצע לפחות שלושה משתכפל היטב בתוך ניסוי אחד. היו שלוש עד שש חזרות על כל ניסוי ששימשו לניתוח סטטיסטי.

תוצאות

כל שלושת סוגי התוספות (A, B, C) המשמשים בניסוי זה הם בעלי גודל נקבוביות זהה של 0.4 מיקרומטר. ההבדל היחיד ביניהם הוא גובה ההוספה לבסיס, המאפשר למרחקים בין שתי שכבות התאים בתרבית משותפת להיות 0.5, 1.0 ו-2.0 מ"מ, בהתאמה, (איור 3) ושהם מספקים שונים (לפרטים ראו טבלת חומרים).

Discussion

שלבים קריטיים בפרוטוקול
מודלים של תרבות משותפת של תאים שימשו לחקר מנגנונים תאיים של cardioprotection. כיצד ליצור שתי שכבות נפרדות עם מרחק משמעותי ביניהן הוא, אם כן, חיוני לפיתוח מודל תרבות משותפת מתאים. אתגר בחקר IR מדומה, כלומר, משאבי אנוש, פגיעה הוא כי לא רק איסכמיה (היפוקסיה) עצמה, אלא ג?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adult Mouse Cardiomyocytes (CMs)	Celprogen Inc	11041-14	Isolated from adult C57BL/6J mouse cardiac tissue
Automated Cell Counter Countess II	Invitrogen	A27977	Cell counting for calculating cell numbers
Bio-Safety Cabinet	Nuaire	NU425400	Cell culture sterile hood
Cell Culture Freezing Medium	Cell Biologics Inc	6916	Used for cell freezing for long term cell line storage
Cell Culture Incubator	Nuaire	Nu-5500	To provide normal cell living condition (21%O2, 5%CO2, 74%N2, 37°C, humidified)
Cell Culture Incubator Gas Tank	A-L Compressed Gases	UN1013	Gas needed for cell culture incubator
Cell Culture Inserts A (0.5 mm)	Corning Inc	353095	Used for EC-CM co-culture
Cell Culture Inserts B (1.0 mm)	Millicell Millipore	PIHP01250	Used for EC-CM co-culture
Cell Culture Inserts C (2.0 mm)	Greiner Bio-One	662640	Used for EC-CM co-culture
Centrifuge	Anstel Enterprises Inc	4235	For cell culture plating and passaging
CMs Cell Culture Flasks T25	Celprogen Inc	E11041-14	Used for CMs regular culture, coated by manufacturer
CMs Cell Culture Medium Complete	Celprogen Inc	M11041-14S	CMs culture complete medium
CMs Cell Culture Medium Complete Phenol free	Celprogen Inc	M11041-14PN	CMs culture medium without phenol red used during LDH measurement
CMs Cell Culture Plates 96 well	Celprogen Inc	E11041-14-96well	Used for experiments of LDH measurement, coated by manufacturer
CMs Hypoxia Cell Culture Medium	Celprogen Inc	M11041-14GFPN	CMs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)
Countess cell counting chamber slides	Invitrogen	C10283	Counting slides used for cell counter
Cyquant LDH Cytotoxicity Kit	Thermo Scientific	C20301	LDH measurement kit
ECs Cell Culture Flasks T25	Fisher Scientific	FB012935	Used for ECs regular culture
ECs Cell Culture Medium Complete	Cell Biologics Inc	M1168	ECs culture complete medium
ECs Cell Culture Medium Complete Phenol free	Cell Biologics Inc	M1168PF	ECs culture medium without phenol red used during LDH measurement
ECs Cell Culture Plates 96 well	Fisher Scientific (Costar)	3370	Used for experiments of LDH measurement
ECs Culture Gelatin-Based Coating Solution	Cell Biologics Inc	6950	Used for coating flasks and plates for ECs
ECs Hypoxia Cell Culture Medium	Cell Biologics Inc	GPF1168	ECs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fisher Scientific	MT35011CV	FBS-HI USDA-approved for cell culture and maintenance
Hypoxia Chamber	StemCell Technologies	27310	To create a hypoxic condition with 0.01%O2 environment
Hypoxia Chamber Flow Meter	StemCell Technologies	27311	To connect with hypoxic gas tank for a consistent gas flow speed
Hypoxic Gas Tank (0.01%O2 Cylinder)	A-L Compressed Gases	UN1956	Used to flush hypoxic medium and chamber (0.01%O2/5%CO2/94.99N2)
Microscope	Nikon	TMS	To observe cell condition
Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells (ECs)	Cell Biologics Inc	C57-6093	Isolated from coronary artery of C57BL/6 mice
NUNC 15ML CONICL Tubes	Fisher Scientific	12565269	For cell culture process, experiments, solution preparation etc.
NUNC 50ML CONICL Tubes	Fisher Scientific	12565271	For cell culture process, experiments, solution preparation etc.
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8662	Used for cell washing during culture or experiments
Plate Reader	BioTek Instrument	11120533	Colorimetric or fluorometric plate reading
Reaction 96 Well Palte (clear no lid)	Fisher Scientific	12565226	Used for LDH measurement plate reading
Trypsin/EDTA for CMs	Celprogen Inc	T1509-014	1 x sterile filtered and tissue culture tested
Trypsin/EDTA for ECs	Cell Biologics Inc	6914/0619	0.25%, cell cuture-tested