Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Пространственное расстояние является ключевым параметром при оценке повреждения гипоксией/реоксигенацией в кокультурной модели отдельных эндотелиальных и кардиомиоцитарных клеточных слоев, впервые предполагая, что оптимизация пространственной среды кокультуры необходима для обеспечения благоприятной модели in vitro для тестирования роли эндотелиальных клеток в защите кардиомиоцитов.
Ишемическая болезнь сердца является основной причиной смерти и инвалидности во всем мире. Реперфузия вызывает дополнительные травмы, помимо ишемии. Эндотелиальные клетки (ЭК) могут защищать кардиомиоциты (КМ) от реперфузионного повреждения посредством клеточных взаимодействий. Кокультуры могут помочь исследовать роль клеточно-клеточных взаимодействий. Смешанная кокультура является простейшим подходом, но ограничена, поскольку изолированные методы лечения и последующие анализы отдельных типов клеток невозможны. Чтобы выяснить, могут ли ЭК дозозависимо ослаблять повреждение клеток СМ и может ли эта защита быть дополнительно оптимизирована путем изменения расстояния контакта между двумя клеточными линиями, мы использовали эндотелиальные клетки первичной коронарной артерии мыши и кардиомиоциты взрослой мыши для тестирования трех типов вставок клеточной культуры, которые варьировались в их межклеточном слое на расстоянии 0,5, 1,0 мм и 2,0 мм соответственно. При только КМ клеточное повреждение, оцениваемое высвобождением лактатдегидрогеназы (ЛДГ), значительно увеличивалось во время гипоксии и далее при реоксигенации, когда расстояние составляло 2,0 мм по сравнению с 0,5 и 1,0 мм. Когда ЭК и КМ находились в почти прямом контакте (0,5 мм), наблюдалось лишь легкое ослабление повреждения реоксигенации КМ после гипоксии. Это затухание было значительно увеличено, когда пространственное расстояние составляло 1,0 мм. С расстоянием 2,0 мм ЕС ослабляли повреждение СМ как во время гипоксии, так и гипоксии / реоксигенации, что указывает на то, что для эк необходимы достаточные культурные дистанцирования для перекрестных помех с КМ, так что секретируемые сигнальные молекулы могут циркулировать и полностью стимулировать защитные пути. Наши результаты впервые показывают, что оптимизация пространственной среды кокультуры ЕС / СМ необходима для обеспечения благоприятной модели in vitro для тестирования роли ЭК в CM-защите от моделируемой ишемии / реперфузионного повреждения. Цель настоящего доклада состоит в том, чтобы предоставить исследователям поэтапный подход к использованию этой важной модели в своих интересах.
Ишемическая болезнь сердца является основной причиной смерти и инвалидности во всем мире 1,2. Тем не менее, процесс лечения реперфузии сам по себе может вызвать гибель кардиомиоцитов, известную как травма ишемии / реперфузии миокарда (ИК), для которой до сих пор нет эффективного средства3. Было предложено, чтобы эндотелиальные клетки (ЭК) защищали кардиомиоциты (КМ) посредством секреции паракринных сигналов, а также межклеточных взаимодействий4.
Модели клеточных кокультур широко использовались для исследования роли аутокринных и/или па....
1. Экспериментальная подготовка/покрытие
Все три типа вставок (A, B, C), используемые в этом эксперименте, имеют одинаковый размер пор 0,4 мкм. Единственным различием между ними является высота вставки до основания, которая позволяет расстояниям между двумя совместно культивируемыми слоями клеток составлять 0,5, 1,0 и 2,0 мм соответст?.......
Критические шаги в протоколе
Модели клеточной кокультуры были использованы для изучения клеточных механизмов кардиопротекции. Таким образом, способ создания двух отдельных слоев со значимым расстоянием между ними имеет решающее значение для разработки подходящей модели ?.......
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Эта работа была поддержана, в частности, Службой исследований и разработок биомедицинской лаборатории Министерства по делам ветеранов США (I01 BX003482) и институциональными фондами M.L.R.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Adult Mouse Cardiomyocytes (CMs) | Celprogen Inc | 11041-14 | Isolated from adult C57BL/6J mouse cardiac tissue |
Automated Cell Counter Countess II | Invitrogen | A27977 | Cell counting for calculating cell numbers |
Bio-Safety Cabinet | Nuaire | NU425400 | Cell culture sterile hood |
Cell Culture Freezing Medium | Cell Biologics Inc | 6916 | Used for cell freezing for long term cell line storage |
Cell Culture Incubator | Nuaire | Nu-5500 | To provide normal cell living condition (21%O2, 5%CO2, 74%N2, 37°C, humidified) |
Cell Culture Incubator Gas Tank | A-L Compressed Gases | UN1013 | Gas needed for cell culture incubator |
Cell Culture Inserts A (0.5 mm) | Corning Inc | 353095 | Used for EC-CM co-culture |
Cell Culture Inserts B (1.0 mm) | Millicell Millipore | PIHP01250 | Used for EC-CM co-culture |
Cell Culture Inserts C (2.0 mm) | Greiner Bio-One | 662640 | Used for EC-CM co-culture |
Centrifuge | Anstel Enterprises Inc | 4235 | For cell culture plating and passaging |
CMs Cell Culture Flasks T25 | Celprogen Inc | E11041-14 | Used for CMs regular culture, coated by manufacturer |
CMs Cell Culture Medium Complete | Celprogen Inc | M11041-14S | CMs culture complete medium |
CMs Cell Culture Medium Complete Phenol free | Celprogen Inc | M11041-14PN | CMs culture medium without phenol red used during LDH measurement |
CMs Cell Culture Plates 96 well | Celprogen Inc | E11041-14-96well | Used for experiments of LDH measurement, coated by manufacturer |
CMs Hypoxia Cell Culture Medium | Celprogen Inc | M11041-14GFPN | CMs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free) |
Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | Counting slides used for cell counter |
Cyquant LDH Cytotoxicity Kit | Thermo Scientific | C20301 | LDH measurement kit |
ECs Cell Culture Flasks T25 | Fisher Scientific | FB012935 | Used for ECs regular culture |
ECs Cell Culture Medium Complete | Cell Biologics Inc | M1168 | ECs culture complete medium |
ECs Cell Culture Medium Complete Phenol free | Cell Biologics Inc | M1168PF | ECs culture medium without phenol red used during LDH measurement |
ECs Cell Culture Plates 96 well | Fisher Scientific (Costar) | 3370 | Used for experiments of LDH measurement |
ECs Culture Gelatin-Based Coating Solution | Cell Biologics Inc | 6950 | Used for coating flasks and plates for ECs |
ECs Hypoxia Cell Culture Medium | Cell Biologics Inc | GPF1168 | ECs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free) |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | MT35011CV | FBS-HI USDA-approved for cell culture and maintenance |
Hypoxia Chamber | StemCell Technologies | 27310 | To create a hypoxic condition with 0.01%O2 environment |
Hypoxia Chamber Flow Meter | StemCell Technologies | 27311 | To connect with hypoxic gas tank for a consistent gas flow speed |
Hypoxic Gas Tank (0.01%O2 Cylinder) | A-L Compressed Gases | UN1956 | Used to flush hypoxic medium and chamber (0.01%O2/5%CO2/94.99N2) |
Microscope | Nikon | TMS | To observe cell condition |
Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells (ECs) | Cell Biologics Inc | C57-6093 | Isolated from coronary artery of C57BL/6 mice |
NUNC 15ML CONICL Tubes | Fisher Scientific | 12565269 | For cell culture process, experiments, solution preparation etc. |
NUNC 50ML CONICL Tubes | Fisher Scientific | 12565271 | For cell culture process, experiments, solution preparation etc. |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | Used for cell washing during culture or experiments |
Plate Reader | BioTek Instrument | 11120533 | Colorimetric or fluorometric plate reading |
Reaction 96 Well Palte (clear no lid) | Fisher Scientific | 12565226 | Used for LDH measurement plate reading |
Trypsin/EDTA for CMs | Celprogen Inc | T1509-014 | 1 x sterile filtered and tissue culture tested |
Trypsin/EDTA for ECs | Cell Biologics Inc | 6914/0619 | 0.25%, cell cuture-tested |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеСмотреть дополнительные статьи
This article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены