Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Пространственное расстояние является ключевым параметром при оценке повреждения гипоксией/реоксигенацией в кокультурной модели отдельных эндотелиальных и кардиомиоцитарных клеточных слоев, впервые предполагая, что оптимизация пространственной среды кокультуры необходима для обеспечения благоприятной модели in vitro для тестирования роли эндотелиальных клеток в защите кардиомиоцитов.

Аннотация

Ишемическая болезнь сердца является основной причиной смерти и инвалидности во всем мире. Реперфузия вызывает дополнительные травмы, помимо ишемии. Эндотелиальные клетки (ЭК) могут защищать кардиомиоциты (КМ) от реперфузионного повреждения посредством клеточных взаимодействий. Кокультуры могут помочь исследовать роль клеточно-клеточных взаимодействий. Смешанная кокультура является простейшим подходом, но ограничена, поскольку изолированные методы лечения и последующие анализы отдельных типов клеток невозможны. Чтобы выяснить, могут ли ЭК дозозависимо ослаблять повреждение клеток СМ и может ли эта защита быть дополнительно оптимизирована путем изменения расстояния контакта между двумя клеточными линиями, мы использовали эндотелиальные клетки первичной коронарной артерии мыши и кардиомиоциты взрослой мыши для тестирования трех типов вставок клеточной культуры, которые варьировались в их межклеточном слое на расстоянии 0,5, 1,0 мм и 2,0 мм соответственно. При только КМ клеточное повреждение, оцениваемое высвобождением лактатдегидрогеназы (ЛДГ), значительно увеличивалось во время гипоксии и далее при реоксигенации, когда расстояние составляло 2,0 мм по сравнению с 0,5 и 1,0 мм. Когда ЭК и КМ находились в почти прямом контакте (0,5 мм), наблюдалось лишь легкое ослабление повреждения реоксигенации КМ после гипоксии. Это затухание было значительно увеличено, когда пространственное расстояние составляло 1,0 мм. С расстоянием 2,0 мм ЕС ослабляли повреждение СМ как во время гипоксии, так и гипоксии / реоксигенации, что указывает на то, что для эк необходимы достаточные культурные дистанцирования для перекрестных помех с КМ, так что секретируемые сигнальные молекулы могут циркулировать и полностью стимулировать защитные пути. Наши результаты впервые показывают, что оптимизация пространственной среды кокультуры ЕС / СМ необходима для обеспечения благоприятной модели in vitro для тестирования роли ЭК в CM-защите от моделируемой ишемии / реперфузионного повреждения. Цель настоящего доклада состоит в том, чтобы предоставить исследователям поэтапный подход к использованию этой важной модели в своих интересах.

Введение

Ишемическая болезнь сердца является основной причиной смерти и инвалидности во всем мире 1,2. Тем не менее, процесс лечения реперфузии сам по себе может вызвать гибель кардиомиоцитов, известную как травма ишемии / реперфузии миокарда (ИК), для которой до сих пор нет эффективного средства3. Было предложено, чтобы эндотелиальные клетки (ЭК) защищали кардиомиоциты (КМ) посредством секреции паракринных сигналов, а также межклеточных взаимодействий4.

Модели клеточных кокультур широко использовались для исследования роли аутокринных и/или па....

протокол

1. Экспериментальная подготовка/покрытие

  1. Обслуживайте CM и EC в соответствии с инструкциями производителя.
    1. Оттаивайте обе клеточные линии, когда они поступают от поставщиков. Пластина в колбах Т25 после промывки свежей средой. Рекомендуется приобретать каждую среду для культивирования клеток у тех же поставщиков, у которых были приобретены клетки. На следующий день освежите клетки средой и используйте при слиянии.
    2. Поддерживают инкубатор клеточной культуры при температуре 37 °C с 21% O2, 5% CO2, 74%N2 и сохраняют его увлажненным.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эндотелиальные клетки первичной коронарной арте....

Результаты

Все три типа вставок (A, B, C), используемые в этом эксперименте, имеют одинаковый размер пор 0,4 мкм. Единственным различием между ними является высота вставки до основания, которая позволяет расстояниям между двумя совместно культивируемыми слоями клеток составлять 0,5, 1,0 и 2,0 мм соответст?.......

Обсуждение

Критические шаги в протоколе
Модели клеточной кокультуры были использованы для изучения клеточных механизмов кардиопротекции. Таким образом, способ создания двух отдельных слоев со значимым расстоянием между ними имеет решающее значение для разработки подходящей модели ?.......

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана, в частности, Службой исследований и разработок биомедицинской лаборатории Министерства по делам ветеранов США (I01 BX003482) и институциональными фондами M.L.R.

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Adult Mouse Cardiomyocytes (CMs)Celprogen Inc11041-14Isolated from adult C57BL/6J mouse cardiac tissue
Automated Cell Counter Countess IIInvitrogenA27977Cell counting for calculating cell numbers
Bio-Safety CabinetNuaireNU425400Cell culture sterile hood
Cell Culture Freezing MediumCell Biologics Inc6916Used for cell freezing for long term cell line storage
Cell Culture IncubatorNuaireNu-5500To provide normal cell living condition (21%O2, 5%CO2, 74%N2, 37°C, humidified)
Cell Culture Incubator Gas TankA-L Compressed GasesUN1013Gas needed for cell culture incubator 
Cell Culture Inserts A (0.5 mm)Corning Inc353095Used for EC-CM co-culture
Cell Culture Inserts B (1.0 mm)Millicell MilliporePIHP01250Used for EC-CM co-culture
Cell Culture Inserts C (2.0 mm)Greiner Bio-One662640Used for EC-CM co-culture
CentrifugeAnstel Enterprises Inc4235For cell culture plating and passaging
CMs Cell Culture Flasks T25Celprogen IncE11041-14Used for CMs regular culture, coated by manufacturer
CMs Cell Culture Medium CompleteCelprogen IncM11041-14SCMs culture complete medium
CMs Cell Culture Medium Complete Phenol freeCelprogen IncM11041-14PNCMs culture medium without phenol red used during LDH measurement
CMs Cell Culture Plates 96 wellCelprogen IncE11041-14-96wellUsed for experiments of LDH measurement, coated by manufacturer
CMs Hypoxia Cell Culture MediumCelprogen IncM11041-14GFPNCMs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)
Countess cell counting chamber slidesInvitrogenC10283Counting slides used for cell counter
Cyquant LDH Cytotoxicity KitThermo Scientific C20301LDH measurement kit
ECs Cell Culture Flasks T25Fisher Scientific FB012935Used for ECs regular culture
ECs Cell Culture Medium CompleteCell Biologics IncM1168ECs culture complete medium
ECs Cell Culture Medium Complete Phenol freeCell Biologics IncM1168PFECs culture medium without phenol red used during LDH measurement
ECs Cell Culture Plates 96 wellFisher Scientific (Costar)3370Used for experiments of LDH measurement
ECs Culture Gelatin-Based Coating SolutionCell Biologics Inc6950Used for coating flasks and plates for ECs
ECs Hypoxia Cell Culture MediumCell Biologics IncGPF1168ECs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)
Fetal Bovine Serum (FBS)Fisher ScientificMT35011CVFBS-HI USDA-approved for cell culture and maintenance
Hypoxia ChamberStemCell Technologies27310To create a hypoxic condition with 0.01%O2 environment
Hypoxia Chamber Flow MeterStemCell Technologies27311To connect with hypoxic gas tank for a consistent gas flow speed
Hypoxic Gas Tank (0.01%O2 Cylinder)A-L Compressed GasesUN1956Used to flush hypoxic medium and chamber (0.01%O2/5%CO2/94.99N2)
Microscope NikonTMSTo observe cell condition
Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells (ECs)Cell Biologics IncC57-6093Isolated from coronary artery of C57BL/6 mice
NUNC 15ML CONICL TubesFisher Scientific12565269For cell culture process, experiments, solution preparation etc.
NUNC 50ML CONICL TubesFisher Scientific12565271For cell culture process, experiments, solution preparation etc.
Phosphate Buffered Saline (PBS)Sigma-AldrichD8662Used for cell washing during culture or experiments
Plate ReaderBioTek Instrument11120533Colorimetric or fluorometric plate reading
Reaction 96 Well Palte (clear no lid)Fisher Scientific12565226Used for LDH measurement plate reading
Trypsin/EDTA for CMsCelprogen IncT1509-0141 x sterile filtered and tissue culture tested
Trypsin/EDTA for ECsCell Biologics Inc6914/06190.25%, cell cuture-tested

Ссылки

  1. Hausenloy, D. J., et al. Ischaemic conditioning and targeting reperfusion injury: a 30 year voyage of discovery. Basic Research in Cardiology. 111 (6), 70 (2016).
  2. Hausenloy, D. J., Yellon, D. M. ....

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

176

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены