Разработка модели клеточной кокультуры для имитации ишемии сердца/реперфузии in vitro

Резюме

Пространственное расстояние является ключевым параметром при оценке повреждения гипоксией/реоксигенацией в кокультурной модели отдельных эндотелиальных и кардиомиоцитарных клеточных слоев, впервые предполагая, что оптимизация пространственной среды кокультуры необходима для обеспечения благоприятной модели in vitro для тестирования роли эндотелиальных клеток в защите кардиомиоцитов.

Аннотация

Ишемическая болезнь сердца является основной причиной смерти и инвалидности во всем мире. Реперфузия вызывает дополнительные травмы, помимо ишемии. Эндотелиальные клетки (ЭК) могут защищать кардиомиоциты (КМ) от реперфузионного повреждения посредством клеточных взаимодействий. Кокультуры могут помочь исследовать роль клеточно-клеточных взаимодействий. Смешанная кокультура является простейшим подходом, но ограничена, поскольку изолированные методы лечения и последующие анализы отдельных типов клеток невозможны. Чтобы выяснить, могут ли ЭК дозозависимо ослаблять повреждение клеток СМ и может ли эта защита быть дополнительно оптимизирована путем изменения расстояния контакта между двумя клеточными линиями, мы использовали эндотелиальные клетки первичной коронарной артерии мыши и кардиомиоциты взрослой мыши для тестирования трех типов вставок клеточной культуры, которые варьировались в их межклеточном слое на расстоянии 0,5, 1,0 мм и 2,0 мм соответственно. При только КМ клеточное повреждение, оцениваемое высвобождением лактатдегидрогеназы (ЛДГ), значительно увеличивалось во время гипоксии и далее при реоксигенации, когда расстояние составляло 2,0 мм по сравнению с 0,5 и 1,0 мм. Когда ЭК и КМ находились в почти прямом контакте (0,5 мм), наблюдалось лишь легкое ослабление повреждения реоксигенации КМ после гипоксии. Это затухание было значительно увеличено, когда пространственное расстояние составляло 1,0 мм. С расстоянием 2,0 мм ЕС ослабляли повреждение СМ как во время гипоксии, так и гипоксии / реоксигенации, что указывает на то, что для эк необходимы достаточные культурные дистанцирования для перекрестных помех с КМ, так что секретируемые сигнальные молекулы могут циркулировать и полностью стимулировать защитные пути. Наши результаты впервые показывают, что оптимизация пространственной среды кокультуры ЕС / СМ необходима для обеспечения благоприятной модели in vitro для тестирования роли ЭК в CM-защите от моделируемой ишемии / реперфузионного повреждения. Цель настоящего доклада состоит в том, чтобы предоставить исследователям поэтапный подход к использованию этой важной модели в своих интересах.

Введение

Ишемическая болезнь сердца является основной причиной смерти и инвалидности во всем мире ^1,2. Тем не менее, процесс лечения реперфузии сам по себе может вызвать гибель кардиомиоцитов, известную как травма ишемии / реперфузии миокарда (ИК), для которой до сих пор нет эффективного средства³. Было предложено, чтобы эндотелиальные клетки (ЭК) защищали кардиомиоциты (КМ) посредством секреции паракринных сигналов, а также межклеточных взаимодействий⁴.

Модели клеточных кокультур широко использовались для исследования роли аутокринных и/или паракринных клеточно-клеточных взаимодействий в функции и дифференцировке клеток. Среди кокультурных моделей смешанная кокультура является самой простой, где два разных типа клеток находятся в прямом контакте в пределах одного культурального отсека при желаемом соотношении клеток⁵. Тем не менее, раздельное лечение между типами клеток и последующий анализ одного типа клеток неосуществимы, учитывая смешанную популяцию.

Предыдущие исследования показали, что гипоксические и ишемические инсульты вызывают значительное повреждение целостности клеточной мембраны, измеряемое высвобождением лактатдегидрогеназы (ЛДГ). Эта травма усугубляется при реоксигенации, имитируя реперфузионную травму ^6,7,8. Целью текущего протокола была проверка гипотез о том, что присутствие EC может дозозависимо ослаблять утечку CM клеточной мембраны, вызванную гипоксией и реоксигенацией (HR), и что защитный эффект EC может быть оптимизирован путем изменения расстояния контакта между двумя клеточными линиями. Таким образом, мы использовали три типа вставок клеточной культуры: эндотелиальные клетки первичной коронарной артерии мыши и кардиомиоциты взрослых мышей. Вставки под брендом Corning, Merck Millipore и Greiner Bio-One позволили нам создать три различных условия перекрестных помех клеточной культуры с расстояниями между клеточными линиями 0,5, 1,0 и 2,0 мм соответственно. В каждом случае на каждую вставку было нанесено 100 000 ЭК.

Кроме того, чтобы определить, способствует ли плотность ЭК в кокультуре ослаблению повреждения ЧСС в этой модели, мы изучили зависимость доза-реакция между концентрацией ЕС и высвобождением НРС КМ. ЭК были покрыты на 25 000, 50 000 и 100 000 на вставку, соответственно, во вставке 2,0 мм.

В этом отчете представлен поэтапный подход для исследователей, чтобы использовать эту важную модель в своих интересах.

протокол

1. Экспериментальная подготовка/покрытие

1. Обслуживайте CM и EC в соответствии с инструкциями производителя.
   1. Оттаивайте обе клеточные линии, когда они поступают от поставщиков. Пластина в колбах Т25 после промывки свежей средой. Рекомендуется приобретать каждую среду для культивирования клеток у тех же поставщиков, у которых были приобретены клетки. На следующий день освежите клетки средой и используйте при слиянии.
   2. Поддерживают инкубатор клеточной культуры при температуре 37 °C с 21% O₂, 5% CO₂, 74%_N2 и сохраняют его увлажненным.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эндотелиальные клетки первичной коронарной артерии мыши, используемые в этом протоколе, выделены из коронарных артерий мышей C57BL/6, а кардиомиоциты взрослых мышей выделены из сердца взрослых мышей C57BL/6J и получены в коммерческих целях (см. Таблицу материалов).
2. Плиты СМ в стерильных условиях на дно 24-луночных плит (нижний слой). Через 24 ч пластинчатые ЭК во вставку (или верхнюю часть) кокультурного колодца. Через 24 часа после нанесения покрытия EC поместите вставки EC на основания пластин CM, начиная период совместного культивирования. Дайте клеткам совместно культивировать в течение не менее 12-24 ч перед использованием. Эти шаги подробно описаны ниже.
   1. Оцените слияние клеточных линий СМ под световым микроскопом. Когда клетки окажутся на 90%-100% сливающимися в культуральных колбах, приступают к экспериментальному покрытию.
   2. Удалите среду из колб, содержащих сливающиеся клеточные культуры, и попробуйте 3-5 мл трипсина/этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) для колб Т25. Аккуратно перемешайте колбу, высиживают при 37 °C в течение 2-5 мин, а затем оценивают прогресс ферментатики под световым микроскопом. Как только клетки начнут округляться, используйте скребок для клеток, чтобы отделить клетки от поверхности.
   3. После отслоения инактивируют раствор трипсина, добавляя раствор трипсина/клетки в пробирку объемом 50 мл, содержащую 10 мл среды для колб T25. Центрифугируют клеточную суспензию при 120 х г в течение 2 мин с получением мягкой клеточной гранулы. Удалите супернатант и повторно суспендируйте гранулу в 5 мл среды.
   4. Чтобы выполнить подсчет клеток и подтвердить жизнеспособность клеток, смешайте аликвоту 10 мкл повторно суспендированных клеток и 10 мкл трипанового синего красителя. Подсчитайте живые клетки с помощью счетчика ячеек. Разбавьте клетки свежими обычными средами для достижения желаемой плотности посева. Объемы рассчитываются в зависимости от желаемой плотности семян и клеточной концентрации исходных растворов. Все гальванические покрытия должны выполняться в стерильных условиях.
   5. Пластинчатые КМ при плотности высева 300 000 на скважину на дно 24-луночной пластины, предварительно покрытой внеклеточным матриксом. Поддерживайте ячейки при 37 °C с 21% O_{2 и} 5% CO₂ в течение ночи.
   6. Через 24 ч пластинчатые ЭК во вставки с оптимальной плотностью покрытия 100 000 на вставку (площадь культивирования составляет 33,6^мм2), (рисунок 1). После 24 ч покрытия ЕС поместите вставки ЕС внутрь скважин СМ, инициируя совместное культивирование. Дайте клеткам совместно культивировать в течение 12-24 ч перед проведением экспериментов.
   7. Убедитесь, что к моменту проведения экспериментов как КМ, так и ЭК достигли 80-90% слияния.

2. Гипоксия/реоксигенация для имитации ишемии/реперфузионного повреждения In Vitro

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги должны быть выполнены, как описано, не останавливайтесь между ними.

1. Подготовьте гипоксическую среду, налив ~25 мл среды в коническую трубку объемом 50 мл. Запечатайте верхнюю часть силиконовой мембраной и используйте стерилизованную пипетку, чтобы пробить отверстие. Создайте еще одно отверстие, на этот раз оставив пипетку погруженной примерно на 2/3 в среду.
2. Промывайте среду гипоксическим газом (0,0125% O₂, 5% CO₂, 94,99%_N2) в течение 5 мин при расходе 30 л/мин. Это минимизирует O₂ , растворенный в среде, когда начинается гипоксия (шаг 2.5).
3. Отбросьте среду 24-луночных пластин или культуральных вкладышей, содержащих прикрепленные клетки, и очень осторожно промыть 100 мкл/лунку 10% фосфатного буферизованного физиологического раствора (PBS). После этого добавьте 500 мкл свежеприготовленной гипоксической среды в каждую лунку пластин или вкладышей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Гипоксия в среде прерывается как можно короче во время этой стадии, прежде чем истинная гипоксия для клеток и сред начнется на этапе 2.5.
   1. В нормоксической контрольной группе заменить исходные среды свежими нормальными средами, содержащими глюкозу и сыворотку.
4. Увлажните камеру гипоксии, поместив чашку Петри, наполненную стерильной водой, в камеру. Затем поместите пластины, содержащие гипоксические группы, в камеру.
5. Промывайте камеру гипоксии гипоксическим газом (0,0125% O₂, 5% CO₂, 94,99%_N2) в течение 5 мин при расходе 30 л/мин. Поместите камеру в инкубатор при температуре 37 °C на 24 ч.
6. После гипоксии культивируют КМ и ЭК в нормальных условиях. Для этого отбросьте старую среду пластин/вкладышей, замените ее нормальной средой (содержащей глюкозу и сыворотку; 500 мкл каждой лунки/вставки) и храните ее в инкубаторе в нормальных условиях культивирования (21% O₂, 5% CO₂, 74%_N2, 37 °C) в течение 2 ч для имитации реперфузии.
7. Чтобы контролировать любые эффекты замещения среды, изменяйте среду нормоксических клеток одновременно с изменением гипоксической среды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2 представлен схематический обзор этого протокола.

3. Оценка конечных точек

1. Перенесите среду клеточного культуры с 24-луночной пластины в 96-луночную пластину. Используют 200 мкл среды из каждой скважины 24-луночной плиты и равномерно распределяют на четыре скважины 96-луночной плиты соответственно. Используйте по одной пластине для нормоксии против гипоксии против ЧСС.
2. Определить степень клеточного повреждения, например, путем измерения абсорбции ЛДГ с использованием набора для анализа цитотоксичности в соответствии с инструкциями производителя. Выполните анализ в 96-луночной пластине в соответствии с инструкциями в протоколе анализа.

4. Статистика

1. Отображение параметрических данных в виде среднего/стандартного отклонения и непараметрических данных в виде прямоугольных графиков с медианным/межквартильным диапазоном. Следует проводить адекватные параметрические и непараметрические множественные сравнительные тесты с приемлемыми пост-специальными тестами для снижения вероятности ошибки типа 1. Значимость обычно устанавливается на уровне альфа 0,05 (двуххвостый).
2. Для всех экспериментов, проведенных в текущем исследовании, выполните, по крайней мере, три хорошо воспроизведенных в течение одного эксперимента. Было от трех до шести повторений каждого эксперимента, используемого для статистического анализа.

Результаты

Все три типа вставок (A, B, C), используемые в этом эксперименте, имеют одинаковый размер пор 0,4 мкм. Единственным различием между ними является высота вставки до основания, которая позволяет расстояниям между двумя совместно культивируемыми слоями клеток составлять 0,5, 1,0 и 2,0 мм соответст?...

Обсуждение

Критические шаги в протоколе
Модели клеточной кокультуры были использованы для изучения клеточных механизмов кардиопротекции. Таким образом, способ создания двух отдельных слоев со значимым расстоянием между ними имеет решающее значение для разработки подходящей модели ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adult Mouse Cardiomyocytes (CMs)	Celprogen Inc	11041-14	Isolated from adult C57BL/6J mouse cardiac tissue
Automated Cell Counter Countess II	Invitrogen	A27977	Cell counting for calculating cell numbers
Bio-Safety Cabinet	Nuaire	NU425400	Cell culture sterile hood
Cell Culture Freezing Medium	Cell Biologics Inc	6916	Used for cell freezing for long term cell line storage
Cell Culture Incubator	Nuaire	Nu-5500	To provide normal cell living condition (21%O2, 5%CO2, 74%N2, 37°C, humidified)
Cell Culture Incubator Gas Tank	A-L Compressed Gases	UN1013	Gas needed for cell culture incubator
Cell Culture Inserts A (0.5 mm)	Corning Inc	353095	Used for EC-CM co-culture
Cell Culture Inserts B (1.0 mm)	Millicell Millipore	PIHP01250	Used for EC-CM co-culture
Cell Culture Inserts C (2.0 mm)	Greiner Bio-One	662640	Used for EC-CM co-culture
Centrifuge	Anstel Enterprises Inc	4235	For cell culture plating and passaging
CMs Cell Culture Flasks T25	Celprogen Inc	E11041-14	Used for CMs regular culture, coated by manufacturer
CMs Cell Culture Medium Complete	Celprogen Inc	M11041-14S	CMs culture complete medium
CMs Cell Culture Medium Complete Phenol free	Celprogen Inc	M11041-14PN	CMs culture medium without phenol red used during LDH measurement
CMs Cell Culture Plates 96 well	Celprogen Inc	E11041-14-96well	Used for experiments of LDH measurement, coated by manufacturer
CMs Hypoxia Cell Culture Medium	Celprogen Inc	M11041-14GFPN	CMs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)
Countess cell counting chamber slides	Invitrogen	C10283	Counting slides used for cell counter
Cyquant LDH Cytotoxicity Kit	Thermo Scientific	C20301	LDH measurement kit
ECs Cell Culture Flasks T25	Fisher Scientific	FB012935	Used for ECs regular culture
ECs Cell Culture Medium Complete	Cell Biologics Inc	M1168	ECs culture complete medium
ECs Cell Culture Medium Complete Phenol free	Cell Biologics Inc	M1168PF	ECs culture medium without phenol red used during LDH measurement
ECs Cell Culture Plates 96 well	Fisher Scientific (Costar)	3370	Used for experiments of LDH measurement
ECs Culture Gelatin-Based Coating Solution	Cell Biologics Inc	6950	Used for coating flasks and plates for ECs
ECs Hypoxia Cell Culture Medium	Cell Biologics Inc	GPF1168	ECs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fisher Scientific	MT35011CV	FBS-HI USDA-approved for cell culture and maintenance
Hypoxia Chamber	StemCell Technologies	27310	To create a hypoxic condition with 0.01%O2 environment
Hypoxia Chamber Flow Meter	StemCell Technologies	27311	To connect with hypoxic gas tank for a consistent gas flow speed
Hypoxic Gas Tank (0.01%O2 Cylinder)	A-L Compressed Gases	UN1956	Used to flush hypoxic medium and chamber (0.01%O2/5%CO2/94.99N2)
Microscope	Nikon	TMS	To observe cell condition
Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells (ECs)	Cell Biologics Inc	C57-6093	Isolated from coronary artery of C57BL/6 mice
NUNC 15ML CONICL Tubes	Fisher Scientific	12565269	For cell culture process, experiments, solution preparation etc.
NUNC 50ML CONICL Tubes	Fisher Scientific	12565271	For cell culture process, experiments, solution preparation etc.
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8662	Used for cell washing during culture or experiments
Plate Reader	BioTek Instrument	11120533	Colorimetric or fluorometric plate reading
Reaction 96 Well Palte (clear no lid)	Fisher Scientific	12565226	Used for LDH measurement plate reading
Trypsin/EDTA for CMs	Celprogen Inc	T1509-014	1 x sterile filtered and tissue culture tested
Trypsin/EDTA for ECs	Cell Biologics Inc	6914/0619	0.25%, cell cuture-tested