JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نحن نصف بروتوكولا للحث على الانتقال المرحلي للبروتين الرابط للحمض النووي TAR 43 (TDP-43) عن طريق الضوء في الخلايا العصبية الحركية الشوكية باستخدام سمك الحمار الوحشي كنموذج.

Abstract

تجميع البروتين غير طبيعي وضعف الخلايا العصبية الانتقائية هما السمتان الرئيسيتان للأمراض العصبية التنكسية. ويمكن استجواب العلاقات السببية بين هذه الميزات من خلال التحكم في مرحلة انتقال البروتين المرتبط بالمرض في نوع الخلية الضعيفة، على الرغم من أن هذا النهج التجريبي كان محدودا حتى الآن. هنا، ونحن نصف بروتوكول للحث على مرحلة الانتقال من الحمض النووي الريبي / الحمض النووي ملزمة البروتين TDP-43 في الخلايا العصبية الحركية الشوكية من يرقات حمار وحشي لنمذجة تجميع السيتوبلازمية من TDP-43 التي تحدث في الخلايا العصبية الحركية المنحطة في التصلب الجانبي الضموري (ALS). نحن نصف طريقة وراثية بكتيرية للكروموسوم الاصطناعي (BAC) لتقديم متغير TDP-43 البصري بشكل انتقائي إلى الخلايا العصبية الحركية الشوكية لسمك الحمار الوحشي. تسمح الشفافية العالية ليرقات حمار وحشي بالانتقال المرحلي ل TDP-43 البصري في الخلايا العصبية الحركية الشوكية عن طريق إضاءة خارجية بسيطة باستخدام ثنائي الباعث للضوء (LED) ضد الأسماك غير المقيدة. كما نقدم سير عمل أساسي للتصوير الحي للخلايا العصبية الحركية الشوكية حمار وحشي وتحليل الصور مع برامج فيجي / ImageJ المتاحة بحرية لتوصيف استجابات TDP-43 optogenetic للضوء. يمكن هذا البروتوكول من توصيف مرحلة انتقال TDP-43 والتكوين الكلي في بيئة خلوية ضعيفة من ALS ، مما يسهل التحقيق في عواقبه الخلوية والسلوكية.

Introduction

تتحكم حبيبات ريبونوكليوبروتين (RNP) في عدد لا يحصى من الأنشطة الخلوية في النواة والسيتوبلازم من خلال تجميع أقسام خالية من الأغشية عبر فصل المرحلة السائلة السائلة (LLPS) ، وهي ظاهرة يتحول فيها السائل المتجانس إلى مرحلتين سائلتين متميزتين1،2. وLPS dysregulated من البروتينات الحمض النووي الريبي ملزمة التي تعمل عادة كمكونات حبيبات RNP تعزيز مرحلة الانتقال غير طبيعي، مما يؤدي إلى تجميع البروتين. وقد تورطت هذه العملية في الأمراض العصبية النمائية والعصبية3,4,5. التقييم الدقيق للعلاقة السببية بين LLPS الشاذة من البروتينات الرابطة الحمض النووي الريبي ومسببات الأمراض أمر بالغ الأهمية لتحديد ما إذا كان وكيفية يمكن استغلال LLPS كهدف علاجي فعال. من السهل نسبيا دراسة البروتين الملزم الحمض النووي الريبي في المختبر وفي النماذج أحادية الخلية ولكنه صعب في الكائنات متعددة الخلايا ، خاصة في الفقاريات. شرط حاسم لتحليل مثل هذه LLPS في الخلايا الفردية داخل بيئة الأنسجة هو التعبير بشكل ثابت عن مسبار لتصوير والتلاعب LLPS في نوع من الخلايا المعرضة للمرض من الفائدة.

التصلب الجانبي الضموري (ALS) هو اضطراب عصبي قاتل في نهاية المطاف حيث يتم فقدان الخلايا العصبية الحركية في الدماغ والحبل الشوكي بشكل انتقائي وتدريجي بسبب الانحطاط. حتى الآن، ارتبطت الطفرات في أكثر من 25 جينا بالشكل الوراثي (أو العائلي) من ALS، والذي يمثل 5٪ -10٪ من إجمالي حالات ALS، وبعض هذه الجينات المسببة ل ALS تقوم بترميز البروتينات الملزمة للجيش الملكي النيبالي التي تتكون من الحمض النووي الريبي، مثل hnRNPA1 و TDP-43 و FUS6,7. وعلاوة على ذلك، يتميز الشكل المتقطع من ALS، الذي يمثل 90٪ -95٪ من إجمالي حالات ALS، بتجميع السيتوبلازمي من TDP-43 المودعة في الخلايا العصبية الحركية المنحطة. ومن الخصائص الرئيسية لهذه البروتينات المرتبطة ب ALS الرابطة الحمض النووي الريبي هي مناطقها المضطربة في جوهرها (IDRs) أو المجالات منخفضة التعقيد التي تفتقر إلى هياكل ثلاثية الأبعاد أمر والتوسط في التفاعلات البروتين البروتين ضعيفة مع العديد من البروتينات المختلفة التي تدفع LLPS7،8. حقيقة أن الطفرات المسببة لل ALS غالبا ما تحدث في IDRs أدى إلى فكرة أن LLPS الشاذة والانتقال المرحلي لهذه البروتينات المرتبطة ب ALS قد تكمن وراء المرض المرض9،10.

في الآونة الأخيرة ، تم تطوير طريقة optoDroplet ، وهي تقنية أوبتيوجينيتية تعتمد على Cryptochrome 2 تسمح بتعديل التفاعلات البروتينية البروتينية عن طريق الضوء ، للحث على الانتقال التدريجي للبروتينات مع IDRs11. وبما أن هذه التقنية قد تم تمديدها بنجاح إلى TDP-43 ، فقد بدأت في الكشف عن الآليات الكامنة وراء المرحلة الانتقالية المرضية من TDP-43 وما يرتبط بها من السمية الخلوية12،13،14،15. في هذا البروتوكول، نحدد طريقة وراثية لتقديم TDP-43 البصرية لأنواع الخلايا المعرضة للخطر ALS، وهي الخلايا العصبية الحركية الشوكية في حمار وحشي باستخدام BAC لجين mnr2b/mnx2b ترميز بروتين هودومين لمواصفات الخلايا العصبية الحركية16،17. تسمح الشفافية العالية ليرقات حمار وحشي بتحفيز الضوء البسيط وغير الباضع ل TDP-43 optogenetic الذي يؤدي إلى انتقال المرحلة في الخلايا العصبية الحركية الشوكية. كما نقدم سير عمل أساسي للتصوير الحي للخلايا العصبية الحركية الشوكية حمار وحشي وتحليل الصور باستخدام برنامج فيجي / ImageJ المتاح بحرية لتوصيف استجابات TDP-43 البصرية لتحفيز الضوء. تسمح هذه الطرق بإجراء تحقيق في مرحلة انتقال TDP-43 في بيئة خلوية ضعيفة من ALS وينبغي أن تساعد في استكشاف عواقبها المرضية على المستويات الخلوية والسلوكية.

Protocol

تم تنفيذ جميع أعمال الأسماك وفقا لدليل رعاية واستخدام المختبر التابع للجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه (رقم الموافقة 24-2) للمعهد الوطني لعلم الوراثة (اليابان)، الذي لديه ضمان لرعاية الحيوان في الملف (رقم الضمان A5561-01) في مكتب الرعاية الحيوانية المختبرية للمعاهد الوطنية للصحة (NIH، الولايات المتحدة الأمريكية).

1. بناء BACs للتعبير عن الجين TDP-43 optogenetic من المروج mnr2b

  1. إعداد البكالوريا
    1. شراء استنساخ BAC حمار وحشي يحتوي على جراد mnr2b حمار وحشي (CH211-172N16، BACPAC الجينوم). تنقية الحمض النووي BAC من ثقافة LB 5 مل بين عشية وضحاها من DH10B Escherichia القولونية (E. القولونية) إيواء CH211-172N16 كما هو موضح في الاحترار وآخرون.18.
    2. تحويل CH211-172N16 إلى خلايا SW102 E. القولونية عن طريق الكهربوكهربائية، كما هو موضح في الاحترار وآخرون.18.
      ملاحظة: تنقية الحمض النووي BAC من الإشريكية القولونية في نفس اليوم من الكهرومporation عادة ما يعطي معدل نجاح أعلى من تحويل BAC18. خلاف ذلك، يتم الاحتفاظ الحمض النووي BAC المنقى في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    3. أدخل كاسيت iTol2-amp لTol2 transposon بوساطة BAC transgenesis19 في العمود الفقري لCH211-172N16 عن طريق الكهرومporation، كما هو موضح في أساكاوا وآخرون.20.
      1. جعل مخزون الجلسرين من E. استنساخ خلايا القولونية التي تحمل CH211-172N16 مع تكامل كاسيت iTol2-amp (CH211-172N16-iTol2A) بعد تأكيد التكامل المتجانس بوساطة إعادة التركيب عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) (Ex Taq) باستخدام الزوج التمهيدي Tol2-L-out (5'-AAA GTA TCT GGC TAG AAT CTT ACT TGA-3') وpTARBAC-13371r (5'-TAG CGG CCG CAA ATT TAT TA-3') والشروط التالية: خطوة التشبع عند 98 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، تليها 25 دورة من التشبع عند 95 درجة مئوية لمدة 10 ثانية، وتمليع التمهيدي عند 55 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، وتمديد التمهيدي عند 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، مما يضخم منتج PCR من 354 زوجا أساسيا (bp).
  2. mnr2b-hs:opTDP-43h البناء
    1. بناء البلازميد تحمل كاسيت التعبير عن الإنسان البرية نوع TDP-43/TARDBP (TDP-43h) التي يتم وضع علامة مع mRFP1 و CRY2olig في N- و C-termini، على التوالي (فيما بعد، opTDP-43h)14.
      ملاحظة: يجب أن يحيط جزء opTDP-43h بتسلسل مروج الجينات hsp70l لسمك الحمار الوحشي (650 نقطة أساس) وتسلسل إشارة تعدد الأضلاع (polyA) ، يليه جين مقاومة كاناميسين (hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan)14.
    2. تضخيم hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan كاسيت مع التمهيديات التي hsp70l آنال وكان وتحتوي على 45 تسلسل bp من المنبع والمصب من codons البادئ من الجين mnr2b بواسطة PCR (GXL DNA Polymerase) باستخدام الزوج التمهيدي mnr2 ب-hspGFF-إلى الأمام (5'tat cag cgc aat tac ctg caa ctc taa aca caa aag tgt tgc aGA ATT TGG AGG CTT CCA GAA C-3') وKm-r (5'ggt tct tca gct aaa agg gcg tcg atc ctg aag ttc ttt gac ttt tcc atC AAT TCA GAA GAA CTC GTC AAG AA-3') مع الشروط التالية: خطوة التشبع عند 98 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، تليها 30 دورة من التشبع عند 95 درجة مئوية لمدة 10 ق، وتمليع التمهيدي عند 55 درجة مئوية لمدة 15 s، وتمديد التمهيدي عند 68 درجة مئوية لمدة 30 s، تضخيم منتج PCR من ~ 5.7 نقطة أساس.
    3. فصل منتجات PCR بواسطة أغاروز هلام electrophoresis (100 V) وتنقية hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan الفرقة الحمض النووي مع عمود الحمض النووي. ضبط تركيز منقى hsp70lp-opTDP-43h-polyA-كان كاسيت إلى 50 نانوغرام/ميكرولتر في مخزن Tris-EDTA المؤقت (TE) يحتوي على 10 mM تريس-HCl (درجة الحموضة 8.0) و 1 م EDTA.
    4. أدخل hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan كاسيت إلى CH211-172N16-iTol2A عن طريق الكهرومporation كما هو موضح في Warming et al.18 وحدد المحولات المقاومة للأمبيسيلين والكاناميسين على لوحات LB agar. CH211-172N16-iTol2A يحمل hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan كاسيت تم تعيينه على أنه mnr2b-hs:opTDP-43h.
    5. تنقية mnr2b-hs:opTDP-43h باستخدام مجموعة تنقية BAC وحله في 250 نانوغرام / ميكرولتر في TE بعد استخراج الفينول / الكلوروفورم.
  3. mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z البناء
    1. بناء بلازميد آخر يحمل الطردب البري من نوع حمار وحشي الموسومة ببروتين فلوري أخضر معزز (EGFP) في محطتها N (EGFP-TDP-43z) بدلا من opTDP-43h ولكن على خلاف ذلك مطابقة لhsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan بناء (hsp70l-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan)14. استخدام EGFP-TDP-43z كرقابة داخلية لتحفيز الضوء من opTDP-43h.
    2. بناء CH211-172N16-iTol2A إيواء hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-كان كاسيت في الموضع mnr2b كما هو موضح في 1.2.1-1.2.5. CH211-172N16-iTol2A يحمل hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan كاسيت تم تعيينه على أنه mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z.

2. Tol2 transposon بوساطة BAC transgenesis في حمار وحشي

  1. إعداد محلول الحقن التي تحتوي على 40 MM KCl، فينول الأحمر (10٪ v/v)، 25 نانوغرام / ميكرولتر من mnr2b-hs:opTDP-43h الحمض النووي، و 25 نانوغرام / μL Tol2 transposase mRNA19.
  2. حقن 1 nL من محلول الحقن (قطرة قطرها حوالي 123 ميكرومتر معايرة في الزيت المعدني) في السيتوسول من نوع البرية أجنة حمار وحشي في مرحلة خلية واحدة. فحص الأسماك المحقونة لتشكيل البروتين الفلوري الأحمر (RFP) - المجاميع الإيجابية في مختلف الأنسجة الجنينية ، بما في ذلك الخلايا العصبية الحركية الشوكية ، تحت منظار مجسم مفلور في 2-3 أيام بعد الإخصاب (dpf). رفع الأسماك الإيجابية ل RFP إلى مرحلة البلوغ.
  3. حقن mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z الحمض النووي كما هو موضح في 2.1 و 2.2. رفع الأسماك الإيجابية EGFP إلى مرحلة البلوغ.
  4. بعد بضعة أشهر، وضع الأسماك المحقونة نضجت جنسيا والأسماك البرية من نوع في أزواج في أقفاص التزاوج القياسية 2 L للحصول على ذرية F1. شاشة F1 الأسماك في 3 dpf لRFP (opTDP-43h) أو EGFP (EGFP-TDP-43z) مضان في العمود الفقري للسيارات باستخدام المجهر epifluorescence مجهزة عدسة الهدف خطة نيوفلور 5x/0.15. وعادة ما يتم تحديد سمكة مؤسسة واحدة من 10−20 سمكة عن طريق الحقن (معدل انتقال الجرثومة هو 5٪-10٪).
  5. عزل ومقارنة متعددة TG [mnr2b-hs:opTDP-43h] وTg [mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] إدراج من الأسماك مؤسس مختلفة، وكثافة، ولكن ليس نمط، من opTDP-43h أو التعبير EGFP-TDP-43z قد تختلف بين الأسماك مؤسس بسبب آثار الموقف الكروموسومية.
  6. عبر Tg [mnr2b-hs:opTDP-43h] وTg [mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] خطوط الأسماك للحصول على ذرية تحتوي على TG [mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg [mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] أسماك مزدوجة المعدلة وراثيا في نسبة مندلية.
  7. رفع الأسماك في طبق من البلاستيك يحتوي على 30 مل من العازلة E3 (5 م م NaCl، 0.17 M M KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 10-5٪ الميثيلين الأزرق) وإضافة 0.003٪ (ث /v) N-phenylthiourea في 8-10 ساعة بعد الإخصاب (hpf) لمنع تكوين الميلانوجينيسيس.
  8. تغطية الطبق البلاستيكي مع رقائق الألومنيوم بعد 30 حصان.

3. إعداد الصمام للإضاءة الضوء الأزرق

  1. قم بتشغيل لوحة LED باستخدام التطبيق المقترن المثبت على جهاز لوحي/هاتف. وضع التحقيق من مطياف في بئر فارغة من طبق 6 بئر وضبط ضوء LED إلى الطول الموجي ذروتها في ~ 456 نانومتر من خلال التطبيق. ضع المستشعر البصري لمتر الطاقة البصرية في البئر الفارغ واضبط قوة ضوء LED (~0.61 mW/cm2). يمكن حفظ إعداد ضوء LED وهو قابل للاسترداد في التطبيق.
  2. أدخل إعداد لوحة الطبق/الصمام إلى الحاضنة عند 28 درجة مئوية. الانتهاء من هذه الخطوة قبل التصوير من الأسماك يبدأ في 48 حصان.

4. تصوير يرقات حمار وحشي تعبر عن TDP-43 optogenetic

  1. حدد Tg [mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg [mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] الأسماك المعدلة وراثيا على الأقل قبل 47 حصان، استنادا إلى RFP (opTDP-43h) أو EGFP (EGFP-TDP-43z) مضان في العمود الفقري للسيارات باستخدام المجهر epifluorescence انشاء المذكورة أعلاه.
  2. Dechorionate Tg [mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg [mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] الأسماك المعدلة وراثيا المزدوجة.
  3. سخني 1٪ درجة حرارة ذوبان منخفضة agarose تحتوي على 250 ميكروغرام / مل من الإيثيل 3-أمينوبنزوات ميثان سلفونات الملح في 42 درجة مئوية.
  4. تخدير لفترة وجيزة Tg [mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg [mnr2b-hs:EGFP-TDP-43] الأسماك المعدلة وراثيا المزدوجة في 48 حصان في المخزن المؤقت E3 التي تحتوي على نفس تركيز تريكان.
  5. وضع قطرة من درجة حرارة ذوبان منخفضة 1٪ agarose على طبق قاعدة الزجاج في درجة حرارة الغرفة. قطر قطر قطرة الآجروز على شكل قبة على الطبق الزجاجي هو 8-10 ملم.
  6. باستخدام ماصة باستور، إضافة الأسماك مخدر إلى agarose درجة حرارة ذوبان منخفضة على طبق قاعدة الزجاج، ومن ثم مزيج عن طريق الأنابيب عدة مرات. تقليل كمية المخزن المؤقت E3 المضافة إلى agarose جنبا إلى جنب مع الأسماك.
  7. الحفاظ على الأسماك على جانبها باستخدام إبرة حقنة أثناء التصلب من agarose (عادة ~ 1 دقيقة) لضمان أن الحبل الشوكي هو في وضع أفقي مناسب. بعد التجسيد ، ضع بضع قطرات من العازلة E3 على الأسماك المثبتة على شكل قبة agarose.
  8. الحصول على المقاطع z confocal المسلسل من الحبل الشوكي عن طريق المسح الضوئي مع المجهر confocal مجهزة عدسة هدف الغمر المياه 20x مع الفتحة العددية 1.00، وذلك باستخدام سرعة المسح الضوئي من 4.0 ميكرومتر لكل بكسل (12 بت لكل بكسل)، وحجم خطوة من 1.0 ميكرومتر لكل شريحة لهذا الهدف، ومزيج من الإثارة / الأطوال الموجية الانبعاثات: القناة 1) 473/510 نانومتر لEGFP والقناة 2) 559/583 نانومتر لmRFP1.
    ملاحظة: يتم تضمين الكلوكا على الجانب البطني من الأسماك في المناطق ذات الاهتمام (ROI) كمرجع، مما يساعد على تحديد ومقارنة شرائح العمود الفقري (المستويات 16-17) عبر النقاط الزمنية.
  9. إزالة الأسماك من agarose عن طريق تكسير بعناية agarose مع إبرة حقنة بمجرد اكتمال التصوير. الحفاظ على مقدار الوقت جزءا لا يتجزأ من الأسماك في agarose قصيرة قدر الإمكان، على الرغم من أن تضمين agarose لمدة <30 دقيقة لا يؤثر على صلاحية الأسماك.

5. التحفيز الخفيف للأسماك المعبرة عن opTDP-43h عن طريق الإضاءة الميدانية لضوء الصمام الثنائي الأزرق الباعث للضوء (LED)

  1. إضافة 7.5 مل من العازلة E3 إلى البئر ووضع الصورة TG [mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg [mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] الأسماك المعدلة وراثيا مزدوجة في البئر. ضع الطبق المكون من ستة آبار على لوحة LED من خلال الحفاظ على تميز الطبق ولوحة LED بمقدار 5 مم مع فاصل (على سبيل المثال ، مع خمسة أكواب شرائح مكدسة).
  2. قم بتشغيل ضوء LED الأزرق. الحفاظ على بعض من Tg [mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg [mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] الأسماك المعدلة وراثيا مزدوجة في طبق منفصل من ست آبار مغطاة رقائق الألومنيوم عندما تكون الأسماك التحكم غير المحلاة ضرورية (أي في ظروف مظلمة)14.
  3. بعد الإضاءة (على سبيل المثال، لمدة 24 ساعة عند 72 حصان في الشكل 3)، قم بتصوير الحبل الشوكي للسمكة المضيئة عن طريق تكرار الخطوات من 4.3 إلى 4.9.

6. التصور لنقل السيتوبلازمية من TDP-43 optogenetic في الخلايا العصبية الحركية الشوكية

  1. افتح ملف الصورة في ImageJ/Fiji21 (الإصدار: 2.1.0/1.53c)، وهو برنامج معالجة صور جافا مفتوح المصدر تم تطويره بواسطة NIH Image، والذي يمكن تنزيله من https://imagej.net/Fiji/Downloads.
  2. استخدم شريط التمرير Z للتنقل عبر المستويات البؤرية. إنشاء إسقاط كثافة أقصى من شرائح متعددة بالنقر فوق صورة | | المكدسات Z | المشروع أقصى كثافة ووضع شريحة ابدأ وشريحة التوقف التي تغطي hemisegments العمود الفقري المحرك.
  3. تقسيم الصورة متعددة القنوات إلى صورتين بقناة واحدة بالنقر فوق صورة | | اللون تقسيم القنوات.
  4. تعزيز إشارة EGFP-TDP-43z لضمان أن السيتوبلازمية EGFP-TDP-43z مرئية بوضوح عن طريق النقر على الصورة | ضبط | السطوع / التباين وضبط الحد الأدنى
  5. افتح مدير عائد الاستثمار بالنقر فوق تحليل | أدوات | مدير عائد الاستثمار. العثور على الخلايا التي يمكن التعرف عليها في كل من الصور في 48 حصان و 72 حصان، استنادا إلى المواقف النسبية لأجسام الخلية. تعيين ROIs من خلال تحديد ملامح الخلايا الهيئات من الخلايا العصبية الحركية الشوكية واحد تصورها إشارة EGFP-TDP-43z باستخدام التحديدات الحرة، ومن ثم النقر فوق إضافة [ر] في مدير عائد الاستثمار.
  6. تعيين محور رئيسي للسوما برسم خط مستقيم باستخدام مستقيم والنقر فوق تحليل | ملف تعريف المؤامرة ل EGFP-TDP-43z (C1) و opTDP-43h (C2) الصور في 48 و 72 حصان.
  7. تطبيع ملف تعريف الرسم عن طريق تقسيم القيم على القيمة الأكبر لكل إشارة EGFP-TDP-43z و opTDP-43h. رسم القيم العادية مع إحداثيات س ص، حيث x و y تمثل المحور الرئيسي للسمة وكثافة الفلورسنت النسبي، على التوالي، وذلك باستخدام الرسم البياني XY في برنامج إحصائي.

7. مقارنة النسبة بين opTDP-43h وEGFP-TDP-43z إشارات باستخدام ImageJ / فيجي

  1. افتح ملف الصورة في ImageJ/Fiji وحدد ROIs للخلايا الموجبة mnr2b المفردة باستخدام صورة إسقاط كثافة قصوى ل EGFP-TDP-43z كما هو الحال في 6.1-6.5. إضافة عائد استثمار خارج الحبل الشوكي البطني (على سبيل المثال، نوتوشورد) لتمثيل إشارة الخلفية (عائد الاستثمار الخلفي).
  2. لكل صورة EGFP-TDP-43z و opTDP-43، قم بإنشاء إسقاط لشرائح متعددة بالنقر فوق صورة | | المكدسات Z | المشروع مجموع شرائح وتعيين شريحة ابدأ وشريحة التوقف التي تغطي العمود الحركي hemispinal.
  3. افتح مدير عائد الاستثمار الذي تم إنشاؤه باستخدام صورة الإسقاط ذات الكثافة القصوى. عرض ROIs على صورة شرائح المجموع عن طريق تحديد إطار الصورة ل EGFP-TDP-43z ثم النقر فوق إظهار الكل في مدير عائد الاستثمار. انقر فوق قياس في إدارة عائد الاستثمار للحصول على متوسط القيم لكل عائد استثمار.
  4. الحصول على قيم المتوسط ل opTDP-43h باتباع نفس الإجراء المتوفر في 7.3.
  5. لكل عائد استثمار، بعد طرح المتوسط ل عائد الاستثمار الخلفي، قسم الوسط المطرح ل opTDP-43h على المتوسط المطرح ل EGFP-TDP-43z للحصول على القيمة النسبة. يمكن مقارنة قيم قياس النسب بين النقاط الزمنية المختلفة وعرضها باستخدام الرسم البياني للعمود في برنامج Prism.

النتائج

التصوير الحي للبروتينات TDP-43 البصرية وغير البصرية في الخلايا العصبية الحركية الشوكية mnr2b+ ليرقات حمار وحشي
للحث على الانتقال المرحلة TDP-43 في الخلايا العصبية الحركية الشوكية في حمار وحشي، تم بناء TDP-43h الإنسان التي يتم وضع علامة مع mRFP1 و CRY2olig22 ف?...

Discussion

التعبير mnr2b-BAC بوساطة opTDP-43h وEGFP-TDP-43z في حمار وحشي يوفر فرصة فريدة للتصوير الحي للانتقال المرحلة TDP-43 في الخلايا العصبية الحركية الشوكية. الشفافية البصرية لأنسجة الجسم من يرقات حمار وحشي يسمح لتحفيز optogenetic بسيطة وغير الباضعة من opTDP-43h. أظهرت المقارنات بين الخلايا العصبية الحركية الشوكية ?...

Disclosures

كا وKK هما مخترعا الملكية الفكرية الموصوفة في هذه المخطوطة وقد تم تقديم براءات اختراع مؤقتة من قبل المعهد الوطني لعلم الوراثة.

Acknowledgements

وقد تم دعم هذا العمل من قبل صندوق سيريكا (KA) وأرقام منحة KAKENHI JP19K06933 (KA) وJP20H05345 (KA).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Confocal microscopeOlympusFV1200
Epifluorescence microscopeZEISSAxioimager Z1
Fluorescence stereomicroscopeLeicaMZ16FA
Glass base dishIWAKI3910-035
IncubatorMEECN-25C
LED panelNanoleaf LimitedNanoleaf AURORA smarter kit
Mupid-2plusTAKARAAD110
NucleoBond BAC100MACHEREY-NAGEL740579
NuSieve GTG AgaroseLONZA50181
Objective lensOlympusXLUMPlanFL N 20×/1.00
Objective lensZEISSPlan-Neofluar 5x/0.15
Optical power meterHIOKI3664
Optical sensorHIOKI9742-10
Phenol red solution 0.5%MerckP0290-100ML
PrimeSTAR GXL DNA PolymeraseTAKARAR050A
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704
Six-well dishFALCON353046
Spectrometer probe BLUE-WaveStellerNet Inc.VIS-50
Syringe needleTERUMONN-2725R
TaKaRa Ex TaqTAKARARR001A
TricaneSigma-AldrichA5040
Zebrafish BAC clone CH211-172N16BACPAC GenomicsCH211-172N16

References

  1. Brangwynne, C. P. Phase transitions and size scaling of membrane-less organelles. Journal of Cell Biology. 203 (6), 875-881 (2013).
  2. Hyman, A. A., Weber, C. A., Julicher, F. Liquid-liquid phase separation in biology. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 39-58 (2014).
  3. Lennox, A. L., et al. Pathogenic DDX3X mutations impair rna metabolism and neurogenesis during fetal cortical development. Neuron. 106 (3), 404-420 (2020).
  4. Nedelsky, N. B., Taylor, J. P. Bridging biophysics and neurology: aberrant phase transitions in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 15 (5), 272-286 (2019).
  5. Ramaswami, M., Taylor, J. P., Parker, R. Altered ribostasis: RNA-protein granules in degenerative disorders. Cell. 154 (4), 727-736 (2013).
  6. Nguyen, H. P., Van Broeckhoven, C., vander Zee, J. ALS genes in the genomic era and their implications for FTD. Trends in Genetics. 34 (6), 404-423 (2018).
  7. Pakravan, D., Orlando, G., Bercier, V., Van Den Bosch, L. Role and therapeutic potential of liquid-liquid phase separation in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Molecular Cell Biology. 13 (1), 15-28 (2021).
  8. Santamaria, N., Alhothali, M., Alfonso, M. H., Breydo, L., Uversky, V. N. Intrinsic disorder in proteins involved in amyotrophic lateral sclerosis. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (7), 1297-1318 (2017).
  9. Lagier-Tourenne, C., Cleveland, D. W. Rethinking ALS: the FUS about TDP-43. Cell. 136 (6), 1001-1004 (2009).
  10. Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. Multi-phaseted problems of TDP-43 in selective neuronal vulnerability in ALS. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (10), 4453-4465 (2021).
  11. Shin, Y., et al. Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optodroplets. Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).
  12. Zhang, P., et al. Chronic optogenetic induction of stress granules is cytotoxic and reveals the evolution of ALS-FTD pathology. Elife. 8, 39578 (2019).
  13. Mann, J. R., et al. RNA Binding Antagonizes Neurotoxic Phase Transitions of TDP-43. Neuron. 102 (2), 321-338 (2019).
  14. Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. Optogenetic modulation of TDP-43 oligomerization accelerates ALS-related pathologies in the spinal motor neurons. Nature Communications. 11 (1), 1004 (2020).
  15. Otte, C. G., et al. Optogenetic TDP-43 nucleation induces persistent insoluble species and progressive motor dysfunction in vivo. Neurobiology of Disease. 146, 105078 (2020).
  16. Wendik, B., Maier, E., Meyer, D. Zebrafish mnx genes in endocrine and exocrine pancreas formation. Developmental Biology. 268 (2), 372-383 (2004).
  17. Seredick, S. D., Van Ryswyk, L., Hutchinson, S. A., Eisen, J. S. Zebrafish Mnx proteins specify one motoneuron subtype and suppress acquisition of interneuron characteristics. Neural Development. 7, 35 (2012).
  18. Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Research. 33 (4), 36 (2005).
  19. Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nature Protocols. 6 (12), 1998-2021 (2011).
  20. Asakawa, K., Abe, G., Kawakami, K. Cellular dissection of the spinal cord motor column by BAC transgenesis and gene trapping in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, 100 (2013).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Taslimi, A., et al. An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function. Nature Communications. 5, 4925 (2014).
  23. Asakawa, K., Kawakami, K. Protocadherin-mediated cell repulsion controls the central topography and efferent projections of the abducens nucleus. Cell Reports. 24 (6), 1562-1572 (2018).
  24. Redchuk, T. A., et al. Optogenetic regulation of endogenous proteins. Nature Communications. 11 (1), 605 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

180 ALS optoDroplet Cryptochrome 2 TDP 43 mnr2b BAC transgenesis

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved