Transição de fase optogenética do TDP-43 em neurônios motores espinhais de larvas de zebrafish

Resumo

Descrevemos um protocolo para induzir a transição de fase da proteína de ligação de DNA TAR 43 (TDP-43) por luz nos neurônios motores espinhais usando zebrafish como modelo.

Resumo

A agregação anormal de proteínas e a vulnerabilidade neuronal seletiva são duas marcas principais de doenças neurodegenerativas. As relações causais entre essas características podem ser interrogadas controlando a transição de fase de uma proteína associada à doença em um tipo celular vulnerável, embora essa abordagem experimental tenha sido limitada até agora. Aqui, descrevemos um protocolo para induzir a transição de fase da proteína de ligação de RNA/DNA TDP-43 em neurônios motores espinhais de larvas de zebrafish para modelagem da agregação citoplasmática de TDP-43 ocorrendo em neurônios motores degenerados na esclerose lateral amiotrófica (ELA). Descrevemos um método genético baseado em cromossomo artificial bacteriano (BAC) para fornecer uma variante optogenética TDP-43 seletivamente aos neurônios motores espinhais de zebrafish. A alta translucência das larvas de zebrafish permite a transição de fase do TDP-43 optogenético nos neurônios motores espinhais por uma simples iluminação externa usando um diodo emissor de luz (LED) contra peixes desenfreados. Também apresentamos um fluxo básico de imagens ao vivo dos neurônios motores espinhais do zebrafish e análise de imagem com software Fiji/ImageJ livremente disponível para caracterizar respostas do TDP-43 optogenético à iluminação da luz. Este protocolo permite a caracterização da transição de fase TDP-43 e formação agregada em um ambiente celular vulnerável à ALS, o que deve facilitar a investigação de suas consequências celulares e comportamentais.

Introdução

Os grânulos de ribonucleoproteína (RNP) controlam uma miríade de atividades celulares no núcleo e citoplasma, montando partições sem membrana através da separação de fase líquido-líquido (LLPS), fenômeno no qual um fluido homogêneo se mistura em duas fases líquidas ^distintas1,2. Os LLPS desregulados de proteínas de ligação de RNA que normalmente funcionam como componentes de grânulo RNP promovem a transição de fase anormal, levando à agregação de proteínas. Esse processo foi implicado em doenças neurodesenvolvimentantes e neurodegenerativas3,4,5. A avaliação precisa de uma relação causal entre LLPS aberrantes de proteínas ligantes de RNA e patogênese de doenças é crucial para determinar se e como o LLPS pode ser explorado como um alvo terapêutico eficaz. LLPS de proteínas de ligação de RNA é relativamente fácil de estudar in vitro e em modelos unicelulares, mas é difícil em organismos multicelulares, especialmente em vertebrados. Um requisito crítico para analisar tais LLPS em células individuais dentro de um ambiente tecidual é expressar uma sonda para a imagem e manipulação de LLPS em um tipo de interesse celular vulnerável à doença.

A esclerose lateral amiotrófica (ELA) é uma doença neurológica fatal na qual os neurônios motores do cérebro e da medula espinhal são perdidos seletivamente e progressivamente devido à degeneração. Até o momento, mutações em mais de 25 genes foram associadas à forma herediável (ou familiar) da ELA, que representa 5%-10% do total de casos de ELA, e alguns desses genes causadores de ELA codificam proteínas de ligação de RNA constituídas por RNPs, como hnRNPA1, TDP-43 e ^FUS6,7. Além disso, a forma esporádica da ELA, que responde por 90%-95% do total de casos de ELA, é caracterizada pela agregação citoplasmática do TDP-43 depositado em neurônios motores degenerados. Uma das principais características dessas proteínas ligadas à RNA associadas à ALS são suas regiões intrinsecamente desordenadas (IDRs) ou domínios de baixa complexidade que carecem de estruturas tridimensionais ordenadas e mediam interações proteína-proteína fracas com muitas proteínas diferentes que impulsionam ^LLPS7,8. O fato de que mutações causadoras de ELA ocorrem frequentemente nos IDRs levou à ideia de que LLPS aberrantes e transição de fase dessas proteínas relacionadas à ELA podem estar por trás da patogênese ^{da ALS9,10}.

Recentemente, o método optoDroplet, uma técnica optogenética baseada em Cryptochrome 2 que permite a modulação de interações proteína-proteína por luz, foi desenvolvido para induzir a transição de fase de proteínas com ^IDRs11. Como esta técnica foi estendida com sucesso ao TDP-43, começou a descobrir os mecanismos subjacentes à transição de fase patológica do TDP-43 e sua citotoxicidade associada12,13,14,15. Neste protocolo, descrevemos um método genético para fornecer um TDP-43 optogenético para tipos de células vulneráveis à ALS, ou seja, neurônios motores espinhais em zebrafish usando o BAC para o gene mnr2b/mnx2b codificando uma proteína homeodomina para especificação de neurônio ^motor16,17. A alta translucência das larvas de zebrafish permite uma estimulação leve simples e não invasiva do TDP-43 optogenético que desencadeia sua transição de fase nos neurônios motores espinhais. Também apresentamos um fluxo de trabalho básico para a imagem ao vivo dos neurônios motores espinhais do zebrafish e análise de imagem usando o software Fiji/ImageJ livremente disponível para caracterizar as respostas do TDP-43 optogenético à estimulação da luz. Esses métodos permitem uma investigação da transição de fase do TDP-43 em um ambiente celular vulnerável à ALS e devem ajudar a explorar suas consequências patológicas em níveis celulares e comportamentais.

Protocolo

Todo o trabalho de pesca foi realizado de acordo com o Guia de Cuidado e Uso de Animais De Laboratório do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (identificação de aprovação nº 24-2) do Instituto Nacional de Genética (Japão), que possui uma Garantia de Bem-Estar Animal no arquivo (número de garantia A5561-01) no Escritório de Bem-Estar Animal Laboratorial dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH, EUA).

1. Construção de BACs para expressão de gene TDP-43 optogenético do promotor mnr2b

1. Preparação bac
   1. Compre um clone bac de zebrafish contendo o lócus zebrafish mnr2b (CH211-172N16, BACPAC Genomics). Purifique o DNA BAC de uma cultura LB de 5 mL durante a noite de DH10B Escherichia coli (E. coli) abrigando CH211-172N16 como descrito em Warming et ^al.18.
   2. Transforme as células CH211-172N16 em SW102 E. coli por eletroporação, como descrito em Warming et ^al.18.
      NOTA: A purificação do DNA BAC do E. coli no mesmo dia da eletroporação geralmente dá uma maior taxa de sucesso de transformação ^bac18. Caso contrário, o DNA BAC purificado é mantido a -20 °C até o uso.
   3. Introduza o iTol2-amp para transgênese BAC mediada por Tol2 ^transposon19 na espinha dorsal de CH211-172N16 por eletroporação, como descrito em Asakawa et ^al.20.
      1. Faça um estoque de glicerol do E. clones de célula coli carregando CH211-172N16 com a integração do iTol2-amp (CH211-172N16-iTol2A) depois de confirmar a integração homologous recombinação mediada pela reação em cadeia de polimerase (PCR) (Ex Taq) usando o par de primer Tol2-L-out (5'-AAA GTA TCT GGC TAG AAT CTT ACT TGA-3') e pTARBAC-13371r (5'-TAG CGG CCG CAA ATT TAT TA-3') e as seguintes condições: um passo de desnaturação a 98 °C por 1 min, seguido por 25 ciclos de desnaturação a 95 °C para 10 s, primer annealing a 55 °C para 15 s, e extensão de primer a 72 °C por 1 min, amplificando um produto PCR de 354 pares de base (bp).
2. mnr2b-hs:opTDP-43h construção
   1. Construa um plasmídeo carregando o de expressão para o TDP-43/TARDBP (TDP-43h) humano que é marcado com mRFP1 e CRY2olig no N- e C-termini, respectivamente (doravante, opTDP-43h)¹⁴.
      NOTA: O fragmento opTDP-43h deve ser flanqueado com a sequência de promotor de genes hsp70l de zebrafish hsp70l (650 bp) e a sequência de sinal de poliadenylation (polyA), seguido por um gene de resistência à kanamicina (hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan)¹⁴.
   2. Amplie o hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan com primers que anneal hsp70l e Kan e contenha sequências de 45 bps do upstream e downstream dos codons iniciadores do gene mnr2b por PCR (GXL DNA Polymerase) usando o par de primer mnr2b-hspGFF-Forward (5'-tat cag cgc aat tac ctg caa cta taa aca caa caa aag tgt tgc tgc aGA ATT CAC TGG AGG CTT CCA GAA C-3') e Km-r (5'-ggt tct tct tct aaa agg gcg tcg atcc ctg aag ttc ttt gac ttt tcc atC AAT TCA GAA GAA CTC GTC AAG AA-3') com as seguintes condições: um passo de desnaturação a 98 °C por 1 min, seguido por 30 ciclos de denaturação a 95 °C para 10 s, primer annealing a 55 °C para 15 s, e extensão primer a 68 °C para 30 s, amplificando um produto PCR de ~5,7 bp.
   3. Separe os produtos PCR por eletroforese de gel agarose (100 V) e purifique a banda de DNA hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan com uma coluna de DNA. Ajuste a concentração do hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan purificado para 50 ng/μL no buffer Tris-EDTA (TE) contendo 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) e 1 mM EDTA.
   4. Introduza o hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan em CH211-172N16-iTol2A por eletroporação conforme descrito em Warming et ^al.18 e selecione transformadores resistentes à ampicilina e kanamycina em placas de ágar LB. CH211-172N16-iTol2A carregando o hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan é designado como mnr2b-hs:opTDP-43h.
   5. Purifique mnr2b-hs:opTDP-43h usando um kit de purificação BAC e dissolva-o a 250 ng/μL em TE após extração fenol/clorofórmio.
3. mnr2b-hs:Construção EGFP-TDP-43z
   1. Construa outro plasmídeo carregando o tardbp tipo zebrafish que é marcado com proteína fluorescente verde aprimorada (EGFP) em seu N-terminus (EGFP-TDP-43z) em vez de opTDP-4 3h mas é idêntico ao convígimento hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan (hsp70l-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan)¹⁴. Use EGFP-TDP-43z como um controle interno para a estimulação de luz de opTDP-43h.
   2. Construa o CH211-172N16-iTol2A abrigando o hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan no lócus mnr2b, conforme descrito em 1.2.1-1.2.5. CH211-172N16-iTol2A carregando o hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan é designado como mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z.

2. Transgênese bac mediada por transposon de Tol2 em zebrafish

1. Prepare a solução de injeção contendo 40 mM KCl, vermelho fenol (10% v/v), 25 ng/μL do mnr2b-hs:opTDP-43h DNA e 25 ng/μL Tol2 transposase ^mRNA19.
2. Injete 1 nL da solução de injeção (uma gotícula com diâmetro de aproximadamente 123 μm calibrado em óleo mineral) no citosol de embriões de zebrafish tipo selvagem no estágio de uma célula. Trie o peixe injetado para a formação de agregados positivos de proteína fluorescente vermelha (RFP) em vários tecidos embrionários, incluindo neurônios motores espinhais, sob um estereópio de fluorescência em 2-3 dias após a fertilização (dpf). Elevar o peixe RFP positivo para a idade adulta.
3. Injete o DNA mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z conforme descrito em 2.1 e 2.2. Elevar o peixe positivo do EGFP para a idade adulta.
4. Depois de alguns meses, coloque peixes injetados sexualmente e peixes selvagens em pares em gaiolas de acasalamento padrão 2 L para obter descendentes de F1. Tela F1 peixe a 3 dpf para RFP (opTDP-43h) ou Fluorescência EGFP (EGFP-TDP-43z) na coluna motora espinhal usando um microscópio de epifluorescência equipado com uma lente objetiva Plan-Neofluar 5x/0.15. Normalmente, um peixe fundador é identificado entre 10 e 20 peixes injetados (a taxa de transmissão de germes é de 5%-10%).
5. Isole e compare múltiplos Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] e Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] inserções de diferentes peixes fundadores, como a intensidade, mas não o padrão, de expressão opTDP-43h ou EGFP-TDP-43z pode variar entre peixes fundadores devido aos efeitos de posição cromossômica.
6. Cross Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] e Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] linhas de peixe para obter descendentes contendo Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] peixe transgênico duplo em uma razão mendeliana.
7. Levante o peixe em um prato plástico contendo 30 mL de tampão E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM _CaCl2, 0,33 mM MgSO4, ^10-5% Methylene Blue) e adicionar 0,003% (w/v) N-phenylthiourea a 8-10 h pós-fertilização (hpf) para inibir melanogênese.
8. Cubra o prato de plástico com papel alumínio após 30 cvf.

3. Preparação de LED para iluminação de luz azul

1. Ligue um painel LED usando o aplicativo associado instalado em um tablet/telefone. Coloque a sonda de um espectrômetro em um poço vazio de um prato de 6 poços e ajuste a luz LED para o comprimento de onda atingindo ~456 nm através da aplicação. Coloque o sensor óptico de um medidor óptico no poço vazio e ajuste a potência da luz LED (~0,61 mW/^cm2). A configuração da luz LED pode ser salva e pode ser recuperada no aplicativo.
2. Introduza a configuração do painel prato/LED à incubadora a 28 °C. Termine esta etapa antes que a imagem do peixe comece em 48 hpf.

4. Imagem de larvas de zebrafish expressando TDP-43 optogenética

1. Selecione Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] peixe transgênico duplo pelo menos antes de 47 hpf, com base na fluorescência RFP (opTDP-43h) ou EGFP (EGFP-TDP-43z) na coluna motora espinhal usando a configuração do microscópio de epifluorescência descrito acima.
2. Deschorionato o Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] peixe transgênico duplo.
3. Pré-aqueça 1% de baixa temperatura de fusão agarose contendo 250 μg/mL de etil 3-aminobenzoato de metanosulfonato a 42 °C.
4. Anestesiar brevemente Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43] peixe transgênico duplo a 48 hpf no buffer E3 contendo a mesma concentração de Tricane.
5. Coloque uma gota da temperatura de fusão pré-aquecido de 1% baixa agarose no prato de base de vidro à temperatura ambiente. O diâmetro da gota de agarose em forma de cúpula no prato de vidro é de 8-10 mm.
6. Usando uma pipeta Pasteur, adicione o peixe anestesiado à baixa temperatura de fusão no prato da base de vidro e, em seguida, misture por pipetação algumas vezes. Minimize a quantidade do tampão E3 adicionado à agarose junto com o peixe.
7. Mantenha o peixe de lado usando uma agulha de seringa durante a solidificação da agarose (tipicamente ~1 min) para garantir que a medula espinhal esteja em uma posição horizontal apropriada. Após a solidificação, coloque algumas gotas de tampão E3 no peixe montado em agarose em forma de cúpula.
8. Adquira seções z confocal serial da medula espinhal através da varredura com um microscópio confocal equipado com uma lente objetiva de imersão de água de 20x com a abertura numérica 1.00, usando uma velocidade de varredura de 4,0 μs por pixel (12 bits por pixel), um tamanho de passo de 1,0 μm por fatia para o objetivo, e uma combinação de excitação/emissão de ondas: Canal 1) 473/510 nm para EGFP e Canal 2) 559/583 nm para mRFP1.
   NOTA: A cloaca no lado ventral do peixe está incluída nas regiões de interesse (ROI) como referência, o que ajuda a identificar e comparar os segmentos espinhais (níveis 16-17) nos pontos de tempo.
9. Remova o peixe da agarose, rachando cuidadosamente a agarose com uma agulha de seringa assim que a imagem estiver completa. Mantenha a quantidade de tempo que o peixe está embutido na agarose o mais curto possível, embora a incorporação de agarose por <30 min não afete a viabilidade do peixe.

5. Estimulação leve de peixe opTDP-43h expressando por iluminação de campo de uma luz diodo emissor de luz azul (LED)

1. Adicione 7,5 mL de tampão E3 ao poço e coloque o tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] peixe transgênico duplo no poço. Coloque o prato de seis poços no painel LED mantendo o prato e o painel LED 5 mm separados com um espaçador (por exemplo, com cinco copos de slides empilhados).
2. Ligue a luz LED azul. Mantenha alguns dos peixes Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] peixe transgênico duplo em um prato separado de seis poços coberto com folha de alumínio quando peixes de controle nãoilluminados são necessários (ou seja, em condições escuras)¹⁴.
3. Após a iluminação (por exemplo, por 24h a 72 cvf na Figura 3), imagine a medula espinhal do peixe iluminado repetindo os passos 4.3 - 4.9.

6. Visualização da realocação citoplasmática do TDP-43 optogenético nos neurônios motores espinhais

1. Abra o arquivo de imagem em ImageJ/^Fiji21 (Versão: 2.1.0/1.53c), um programa de processamento de imagem Java de código aberto desenvolvido pela NIH Image, que pode ser baixado a partir de https://imagej.net/Fiji/Downloads.
2. Use a barra de rolagem Z para mover-se através dos planos focais. Crie uma projeção de intensidade máxima de várias fatias clicando em | de imagem Pilhas | | do projeto Z Intensidade máxima e configuração Inicie a fatia e Pare a fatia que cubra os hemisegmentos da coluna motora espinhal.
3. Divida a imagem multicanal em duas imagens de um único canal clicando em Imagem | | de cor Canais divididos.
4. Melhore o sinal EGFP-TDP-43z para garantir que o EGFP-TDP-43z citoplasmámico seja visível claramente clicando em | Ajuste | Brilho/Contraste e ajuste mínimo
5. Abra o gerenciador de ROI clicando em Analisar | Ferramentas | Gerente do ROI. Encontre as células identificáveis em ambas as imagens a 48 hpf e 72 hpf, com base nas posições relativas dos corpos celulares. Defina os ROIs delineando os contornos dos corpos celulares de neurônios motores espinhal únicos visualizados pelo sinal EGFP-TDP-43z usando seleções freehand e, em seguida, clicando em Adicionar[t] no gerenciador de ROI.
6. Defina um eixo principal da soma, desenhando uma linha reta usando Reta e clicando em Analisar | Perfil de enredo para imagens EGFP-TDP-43z (C1) e opTDP-43h (C2) a 48 e 72 cvf.
7. Normalize o Perfil de Parcela dividindo os valores pelo maior valor para cada sinal EGFP-TDP-43z e opTDP-43h. Plote os valores normalizados com coordenadas x-y, onde x e y representam o eixo principal das intensidades soma e relativa fluorescentes, respectivamente, utilizando gráfico XY em um software estatístico.

7. Comparação ratiométrica entre os sinais opTDP-43h e EGFP-TDP-43z usando imageJ/fiji

1. Abra o arquivo de imagem em ImageJ/Fiji e defina ROIs para células mnr2b-positivas usando uma imagem de projeção de intensidade máxima de EGFP-TDP-43z como em 6.1-6.5. Adicione um ROI fora da medula espinhal ventral (por exemplo, notochord) para representar o sinal de fundo (ROI de fundo).
2. Para cada imagem EGFP-TDP-43z e opTDP-43, crie uma projeção de várias fatias clicando em Imagem | Pilhas | | do projeto Z Soma Fatias e definir Iniciar fatia e Parar fatia que cubra a coluna do motor hemispinal.
3. Abra o gerenciador de ROI criado com a imagem de projeção de intensidade máxima. Exibir os ROIs na imagem Sum Slices selecionando a janela de imagem para EGFP-TDP-43z e, em seguida, clicando em Mostrar Tudo no gerenciador de ROI. Clique em Medir no gerenciador de ROI para obter valores médios para cada ROI.
4. Adquirir valores médios para opTDP-43h seguindo o mesmo procedimento previsto em 7.3.
5. Para cada ROI, depois de subtrair a média para o ROI de fundo, divida a média subtraída para opTDP-43h pela média subtraída para EGFP-TDP-43z para obter o valor ratiométrico. Os valores ratiométricos podem ser comparados entre diferentes pontos de tempo e apresentados usando gráfico de coluna no software Prism.

Resultados

Imagem ao vivo de proteínas TDP-43 optogenéticas e não optogenéticas nos neurônios motores espinhais mnr2b+ de larvas de zebrafish
Para induzir a transição de fase TDP-43 nos neurônios motores espinhais em zebrafish, um TDP-43h humano que é marcado com mRFP1 e ^CRY2olig22 no N-e C-termini, respectivamente, foi construído e designado como opTDP-43h14 (Figura 1A). O fragment...

Discussão

A expressão mediada por mnr2b-BAC de opTDP-43h e EGFP-TDP-43z em zebrafish fornece uma oportunidade única para imagens ao vivo da transição de fase TDP-43 nos neurônios motores espinhais. A transparência óptica dos tecidos corporais das larvas de zebrafish permite a simples e não invasiva estimulação optogenética de opTDP-43h. Comparações entre neurônios motores espinhais únicos ao longo do tempo demonstraram que a oligomerização dependente da luz do opTDP-43h causa seu agrupamento citoplasmical...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Confocal microscope	Olympus	FV1200
Epifluorescence microscope	ZEISS	Axioimager Z1
Fluorescence stereomicroscope	Leica	MZ16FA
Glass base dish	IWAKI	3910-035
Incubator	MEE	CN-25C
LED panel	Nanoleaf Limited	Nanoleaf AURORA smarter kit
Mupid-2plus	TAKARA	AD110
NucleoBond BAC100	MACHEREY-NAGEL	740579
NuSieve GTG Agarose	LONZA	50181
Objective lens	Olympus	XLUMPlanFL N 20×/1.00
Objective lens	ZEISS	Plan-Neofluar 5x/0.15
Optical power meter	HIOKI	3664
Optical sensor	HIOKI	9742-10
Phenol red solution 0.5%	Merck	P0290-100ML
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase	TAKARA	R050A
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
Six-well dish	FALCON	353046
Spectrometer probe BLUE-Wave	StellerNet Inc.	VIS-50
Syringe needle	TERUMO	NN-2725R
TaKaRa Ex Taq	TAKARA	RR001A
Tricane	Sigma-Aldrich	A5040
Zebrafish BAC clone CH211-172N16	BACPAC Genomics	CH211-172N16