JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы описываем протокол для индуцирования фазового перехода TAR-ДНК-связывающего белка 43 (TDP-43) светом в спинальных двигательных нейронах, используя рыбок данио в качестве модели.

Аннотация

Аномальная агрегация белка и селективная уязвимость нейронов являются двумя основными признаками нейродегенеративных заболеваний. Причинно-следственные связи между этими признаками могут быть изучены путем контроля фазового перехода белка, связанного с заболеванием, в уязвимом типе клеток, хотя этот экспериментальный подход до сих пор был ограничен. Здесь мы описываем протокол индуцирования фазового перехода РНК/ДНК-связывающего белка TDP-43 в спинальных двигательных нейронах личинок рыбок данио для моделирования цитоплазматической агрегации TDP-43, происходящей в дегенерирующих двигательных нейронах при боковом амиотрофическом склерозе (БАС). Мы описываем генетический метод на основе бактериальной искусственной хромосомы (BAC) для выборочной доставки оптогенетического варианта TDP-43 к спинальным двигательным нейронам рыбок данио. Высокая прозрачность личинок рыбок данио позволяет осуществлять фазовый переход оптогенетического TDP-43 в спинномозговых двигательных нейронах простым внешним освещением с использованием светодиода (LED) против несдержанных рыб. Мы также представляем базовый рабочий процесс визуализации спинальных двигательных нейронов рыбок данио и анализа изображений с помощью свободно доступного программного обеспечения Fiji / ImageJ для характеристики реакций оптогенетического TDP-43 на световое освещение. Этот протокол позволяет характеризовать фазовый переход TDP-43 и образование агрегатов в уязвимой к БАС клеточной среде, что должно облегчить исследование его клеточных и поведенческих последствий.

Введение

Гранулы рибонуклеопротеина (RNP) контролируют множество клеточных активностей в ядре и цитоплазме, собирая безмембранные перегородки посредством разделения жидкой и жидкой фазы (LLPS), явление, при котором однородная жидкость демиксирует в две различные жидкие фазы1,2. Дисрегулируемые LLPS РНК-связывающих белков, которые обычно функционируют как гранулярные компоненты RNP, способствуют аномальному фазовому переходу, что приводит к агрегации белка. Этот процесс был вовлечен в нейроразвитие и нейродегенеративные заболевания3,4,5. Точная оценка причинно-следственной связи между аберрантными LLPS РНК-связывающих белков и патогенезом заболевания имеет решающее значение для определения того, можно ли и как LLPS использовать в качестве эффективной терапевтической мишени. LLPS РНК-связывающих белков относительно легко изучать in vitro и в одноклеточных моделях, но трудно в многоклеточных организмах, особенно у позвоночных. Критическим требованием для анализа таких LLPS в отдельных клетках в тканевой среде является стабильная экспрессия зонда для визуализации и манипулирования LLPS в уязвимом к заболеванию типе клеток.

Боковой амиотрофический склероз (БАС) является в конечном счете смертельным неврологическим расстройством, при котором двигательные нейроны головного и спинного мозга избирательно и постепенно теряются из-за дегенерации. На сегодняшний день мутации в более чем 25 генах были связаны с наследственной (или семейной) формой БАС, на которую приходится 5%-10% от общего числа случаев БАС, и некоторые из этих генов, вызывающих БАС, кодируют РНК-связывающие белки, состоящие из РНК, такие как hnRNPA1, TDP-43 и FUS6,7. Более того, спорадическая форма БАС, на которую приходится 90%-95% от общего числа случаев БАС, характеризуется цитоплазматической агрегацией TDP-43, депонированного в дегенеративных двигательных нейронах. Основной характеристикой этих ALS-ассоциированных РНК-связывающих белков является их внутренне неупорядоченные области (IDR) или домены низкой сложности, которые не имеют упорядоченных трехмерных структур и опосредуют слабые белково-белковые взаимодействия со многими различными белками, которые управляют LLPS7,8. Тот факт, что бас-вызывающие мутации часто встречаются в IDR, привел к идее, что аберрантный LLPS и фазовый переход этих связанных с ALS белков могут лежать в основе патогенеза ALS9,10.

Недавно был разработан метод optoDroplet, оптогенетический метод на основе Cryptochrome 2, который позволяет модулировать белково-белковые взаимодействия светом, чтобы индуцировать фазовый переход белков с помощью IDR11. Поскольку этот метод был успешно распространен на TDP-43, он начал раскрывать механизмы, лежащие в основе патологического фазового перехода TDP-43 и связанной с ним цитотоксичности12,13,14,15. В этом протоколе мы описываем генетический метод доставки оптогенетического TDP-43 к ALS-уязвимым типам клеток, а именно спинальным моторным нейронам у рыбок данио с использованием BAC для гена mnr2b / mnx2b, кодирующего гомеодоменный белок для спецификации двигательных нейронов16,17. Высокая прозрачность личинок рыбок данио позволяет проводить простую, неинвазивную световую стимуляцию оптогенетического TDP-43, который запускает его фазовый переход в спинномозговых двигательных нейронах. Мы также представляем базовый рабочий процесс для визуализации спинальных двигательных нейронов рыбок данио и анализа изображений с использованием свободно доступного программного обеспечения Fiji / ImageJ для характеристики реакций оптогенетического TDP-43 на световую стимуляцию. Эти методы позволяют исследовать фазовый переход TDP-43 в уязвимой к БАС клеточной среде и должны помочь изучить его патологические последствия на клеточном и поведенческом уровнях.

протокол

Все работы с рыбой проводились в соответствии с Руководством по уходу за лабораторными животными и их использованию Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (идентификационный номер одобрения 24-2) Национального института генетики (Япония), которое имеет гарантию благополучия животных в файле (номер гарантии A5561-01) в Управлении благосостояния лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения (NIH, США).

1. Построение БАС для экспрессии оптогенетического гена TDP-43 из промотора mnr2b

  1. Подготовка БАК
    1. Приобретите клон BAC рыбки данио, содержащий локус рыбки данио mnr2b (CH211-172N16, BACPAC Genomics). Очистите ДНК BAC из 5 мл ночной культуры LB DH10B Escherichia coli (E. coli), содержащей CH211-172N16, как описано в Warming et al.18.
    2. Преобразование CH211-172N16 в ячейки SW102 E. coli путем электропорации, как описано в Warming et al.18.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Очистка ДНК BAC от E. coli в тот же день электропорации обычно дает более высокую успешность трансформации BAC18. В противном случае очищенная ДНК BAC сохраняется при -20 °C до использования.
    3. Представьте iTol2-амперную кассету для транспозонно-опосредованного Tol2 BAC трансгенеза19 в основу CH211-172N16 путем электропорации, как описано в Asakawa et al.20.
      1. Сделайте глицериновый запас клонов клеток E. coli , несущих CH211-172N16 с интеграцией кассеты iTol2-amp (CH211-172N16-iTol2A) после подтверждения гомологичной рекомбинационно-опосредованной интеграции полимеразной цепной реакцией (PCR) (Ex Taq) с использованием пары праймеров Tol2-L-out (5'-AAA GTA TCT GGC TAG AAT CTT ACT TGA-3') и pTARBAC-13371r (5'-TAG CGG CCG CAA ATT TAT TA-3') и следующих условий: стадия денатурации при 98 °C в течение 1 мин, за которой следуют 25 циклов денатурации при 95 °C в течение 10 с, отжиг грунтовки при 55 °C в течение 15 с и удлинение грунтовки при 72 °C в течение 1 мин, усиливая продукт ПЦР из 354 пар оснований (bp).
  2. mnr2b-hs:конструкция opTDP-43h
    1. Построить плазмиду, несущую кассету выражений для человеческого дикого типа TDP-43/TARDBP (TDP-43h), которая помечена mRFP1 и CRY2olig на N- и C-терминах соответственно (далее opTDP-43h)14.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фрагмент opTDP-43h должен быть окружен последовательностью промотора гена рыбки данио hsp70l (650 bp) и сигнальной последовательностью полиаденилирования (polyA), за которым следует ген устойчивости к канамицину (hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan)14.
    2. Амплифицируйте кассету hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan с помощью праймеров, которые отжигают hsp70l и Kan и содержат 45 последовательностей bp вверх и вниз по течению кодонов инициатора гена mnr2b методом ПЦР (GXL DNA Polymerase) с использованием пары праймеров mnr2b-hspGFF-Forward (5'-tat cag cgc aat tac ctg caa ctc taa aca caa caa aag tgt tgc aGA ATT CAC TGG AGG CTT CCA GAA C-3') и Km-r (5'-ggt tct tca gct aaa agg gcg tcg atc atc ctg aag ttc ttt gac ttt tcc atC AAT TCA GAA GAA CTC GTC AAG AA-3') со следующими условиями: шаг денатурации при 98 °C в течение 1 мин, за которым следуют 30 циклов денатурации при 95 °C в течение 10 с, отжиг грунтовки при 55 °C в течение 15 с и удлинение грунтовки при 68 °C в течение 30 с, амплифицирующий продукт ПЦР ~5,7 bp.
    3. Отделите продукты ПЦР электрофорезом агарозного геля (100 В) и очистите полосу ДНК hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan с помощью днк-колонки. Отрегулируйте концентрацию очищенной кассеты hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan до 50 нг/мкл в буфере Tris-EDTA (TE), содержащем 10 мМ Tris-HCl (pH 8,0) и 1 мМ ЭДТА.
    4. Введите кассету hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan в CH211-172N16-iTol2A путем электропорации, как описано в Warming et al.18, и выберите ампициллин- и канамицин-устойчивые трансформанты на пластинах агара LB. CH211-172N16-iTol2A, несущий кассету hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan, обозначается как mnr2b-hs:opTDP-43h.
    5. Очистите mnr2b-hs:opTDP-43h с помощью набора для очистки BAC и растворите его при 250 нг/мкл в TE после экстракции фенола/хлороформа.
  3. mnr2b-hs:Конструкция EGFP-TDP-43z
    1. Постройте другую плазмиду, несущую tardbp дикого типа рыбок данио, которая помечена улучшенным зеленым флуоресцентным белком (EGFP) на своем N-конце (EGFP-TDP-43z) вместо opTDP-43h, но в остальном идентична конструкции hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan (hsp70l-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan)14. Используют EGFP-TDP-43z в качестве внутреннего контроля для световой стимуляции opTDP-43h.
    2. Конструкция CH211-172N16-iTol2A с кассетой hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan в локусе mnr2b, как описано в 1.2.1-1.2.5. CH211-172N16-iTol2A, несущий кассету hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan, обозначается как mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z.

2. Транспозон-опосредованный TOL2 BAC трансгенез у рыбок данио

  1. Готовят инъекционный раствор, содержащий 40 мМ KCl, фенол красный (10% v/v), 25 нг/мкл mnr2b-hs:opTDP-43h ДНК и 25 нг/мкл Tol2 транспозазы мРНК19.
  2. Вводят 1 нл инъекционного раствора (каплю диаметром приблизительно 123 мкм, откалиброванную в минеральном масле) в цитозоль эмбрионов рыбок данио дикого типа на одноклеточной стадии. Скрининг введенной рыбы на образование красного флуоресцентного белка (RFP)-положительных агрегатов в различных эмбриональных тканях, включая спинальные двигательные нейроны, под флуоресцентным стереомикроскопом через 2-3 дня после оплодотворения (dpf). Поднимите RFP-положительную рыбу до зрелого возраста.
  3. Введите ДНК mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z, как описано в 2.1 и 2.2. Поднимите EGFP-положительную рыбу до зрелого возраста.
  4. Через несколько месяцев поместите половозрелых инъекционных рыб и рыб дикого типа парами в стандартные 2-литровые брачные клетки для получения потомства F1. Экран рыбы F1 при 3 dpf для флуоресценции RFP (opTDP-43h) или EGFP (EGFP-TDP-43z) в позвоночном моторном столбе с помощью эпифлуоресцентного микроскопа, оснащенного объективом Plan-Neofluar 5x/0.15. Как правило, одна рыба-основатель идентифицируется из 10−20 введенных рыб (скорость передачи зародышевой линии составляет 5%−10%).
  5. Изолируйте и сравните несколько Вставок Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] и Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] от разных рыб-основателей, поскольку интенсивность, но не паттерн экспрессии opTDP-43h или EGFP-TDP-43z может варьироваться между рыбами-основателями из-за эффектов хромосомного положения.
  6. Скрестите Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] и Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] для получения потомства, содержащего Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] двойную трансгенную рыбу в менделевском соотношении.
  7. Вырастите рыбу в пластиковую посуду, содержащую 30 мл буфера E3 (5 мМ NaCl, 0,17 мМ KCl, 0,33 мМ CaCl2, 0,33 мМ MgSO4, 10-5% Methylene Blue) и добавьте 0,003% (мас./об.) N-фенилтемочевины через 8-10 ч после оплодотворения (HPF) для ингибирования меланогенеза.
  8. Накройте пластиковую тарелку алюминиевой фольгой после 30 л.с.

3. Подготовка светодиода к освещению синим светом

  1. Включите светодиодную панель с помощью соответствующего приложения, установленного на планшете или телефоне. Поместите зонд спектрометра в пустой колодец из 6 лунок и отрегулируйте светодиодный свет до длины волны, достигающей максимума ~ 456 нм через приложение. Поместите оптический датчик измерителя оптической мощности в пустой колодец и отрегулируйте мощность светодиодного фонаря (~0,61 мВт/см2). Настройка светодиодного индикатора может быть сохранена и извлекается в приложении.
  2. Введите настройку тарелки / светодиодной панели в инкубатор при 28 °C. Завершите этот шаг до того, как изображение рыб начнется с 48 л.с.

4. Визуализация личинок рыбок данио, экспрессирующих оптогенетический TDP-43

  1. Выберите Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] двойную трансгенную рыбу, по крайней мере, до 47 л.с.ф., на основе флуоресценции RFP (opTDP-43h) или EGFP (EGFP-TDP-43z) в позвоночно-двигательном столбе с использованием эпифлуоресцентного микроскопа, описанного выше.
  2. Дехорионат Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] двойная трансгенная рыба.
  3. Разогреть 1% агарозу с низкой температурой плавления, содержащую 250 мкг/мл этил-3-аминобензоата метансульфонатной соли при 42 °C.
  4. Кратковременно обезболивают Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43] двойную трансгенную рыбу при 48 л.с.ф. в буфере E3, содержащем ту же концентрацию трикана.
  5. Нанесите каплю предварительно нагретой 1% агарозы низкой температуры плавления на стеклянную основу посуды при комнатной температуре. Диаметр куполообразной капли агарозы на стеклянной посуде составляет 8-10 мм.
  6. Используя пипетку Пастера, добавьте обезболенную рыбу к агарозе с низкой температурой плавления на стеклянной посуде, а затем перемешайте, пипеткой несколько раз. Сведите к минимуму количество буфера E3, добавляемого к агарозе вместе с рыбой.
  7. Поддерживайте рыбу на боку, используя шприцевую иглу во время затвердевания агарозы (обычно ~ 1 мин), чтобы убедиться, что спинной мозг находится в соответствующем горизонтальном положении. После затвердевания нанесите пару капель буфера Е3 на куполообразную агарозную рыбу.
  8. Получение последовательных конфокальных z-срезов спинного мозга путем сканирования с помощью конфокального микроскопа, оснащенного объективом с погружением в воду 20x с числовой диафрагмой 1,00, используя скорость сканирования 4,0 мкс на пиксель (12 бит на пиксель), размер шага 1,0 мкм на срез для объектива и комбинацию длин волн возбуждения/излучения: Канал 1) 473/510 нм для EGFP и канал 2) 559/583 нм для mRFP1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клоака на вентральной стороне рыбы включена в области интереса (ROI) в качестве эталона, что помогает идентифицировать и сравнить сегменты позвоночника (уровни 16-17) по временным точкам.
  9. Удалите рыбу из агарозы, осторожно расщеблив агарозу шприцевой иглой, как только визуализация будет завершена. Держите количество времени, в течение которого рыба внедряется в агарозу, как можно короче, хотя встраивание агарозы в течение <30 мин не влияет на жизнеспособность рыбы.

5. Световая стимуляция opTDP-43h-экспрессирующих рыб полевым освещением синего светодиодного (LED) света

  1. Добавьте 7,5 мл буфера E3 в скважину и поместите в скважину изображенную Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] двойную трансгенную рыбу. Поместите тарелку из шести лунок на светодиодную панель, удерживая тарелку и светодиодную панель на расстоянии 5 мм друг от друга с помощью распорки (например, с пятью сложенными стаканами).
  2. Включите синий светодиод. Храните часть Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] в отдельной шестилуночной посуде, покрытой алюминиевой фольгой, когда необходима неосвещенная контрольная рыба (т.е. в темных условиях)14.
  3. После освещения (например, в течение 24 ч при 72 л.с.ф . на рисунке 3) визуализируйте спинной мозг освещенной рыбы, повторив шаги 4.3 - 4.9.

6. Визуализация цитоплазматического перемещения оптогенетического TDP-43 в спинномозговых двигательных нейронах

  1. Откройте файл изображения в ImageJ/Fiji21 (версия: 2.1.0/1.53c), программе обработки изображений Java с открытым исходным кодом, разработанной NIH Image, которую можно загрузить с https://imagej.net/Fiji/Downloads.
  2. Используйте полосу прокрутки Z для перемещения по фокальным плоскостям. Создайте проекцию максимальной интенсивности нескольких фрагментов, щелкнув Изображение | Стеки | | проекта Z Максимальная интенсивность и установка Стартового среза и Стоп-среза, которые покрывают полушария позвоночного моторного столба.
  3. Разделите многоканальное изображение на два одноканальных изображения, щелкнув Изображение | Цвет | Разделенные каналы.
  4. Улучшите сигнал EGFP-TDP-43z, чтобы убедиться, что цитоплазматический EGFP-TDP-43z хорошо виден, щелкнув Изображение | Отрегулируйте | Яркость/Контрастность и минимальная регулировка
  5. Откройте менеджер окупаемости инвестиций, щелкнув Анализ | Инструменты | Менеджер roi. Найдите ячейки, которые идентифицируются на обоих изображениях при 48 л.с.ф. и 72 л.с.ф., на основе относительных положений тел клеток. Установите ROI, очертив контуры клеточных тел одиночных спинальных двигательных нейронов, визуализированных сигналом EGFP-TDP-43z с помощью выбора От руки, а затем щелкнув Add[t] в менеджере ROI.
  6. Установите большую ось сомы, нарисовав прямую линию с помощью прямой и щелкнув Анализировать | Профиль печати для изображений EGFP-TDP-43z (C1) и opTDP-43h (C2) при 48 и 72 л.с.
  7. Нормализуйте профиль графика, разделив значения на наибольшее значение для каждого сигнала EGFP-TDP-43z и opTDP-43h. Постройте нормализованные значения с координатами x-y, где x и y представляют большую ось сомы и относительную интенсивность флуоресцентной активности соответственно, используя график XY в статистическом программном обеспечении.

7. Ратиометрическое сравнение сигналов opTDP-43h и EGFP-TDP-43z с использованием ImageJ/Fiji

  1. Откройте файл изображения в ImageJ/Fiji и установите ROI для одиночных mnr2b-положительных ячеек, используя проекционное изображение максимальной интенсивности EGFP-TDP-43z, как в 6.1-6.5. Добавьте ROI за пределами вентрального спинного мозга (например, notochord), чтобы представить фоновый сигнал (фоновый ROI).
  2. Для каждого образа EGFP-TDP-43z и opTDP-43 создайте проекцию из нескольких фрагментов, щелкнув Изображение | Стеки | | проекта Z Суммируйте фрагменты и установите Начальный фрагмент и Стоп-фрагмент, которые покрывают гемиспинальный моторный столбец.
  3. Откройте менеджер ROI, созданный с максимальной интенсивностью проекционного изображения. Отобразите окупаемость инвестиций на изображении Sum Slices, выбрав окно изображения для EGFP-TDP-43z и нажав кнопку Показать все в диспетчере ROI. Щелкните Измерить в диспетчере ROI, чтобы получить средние значения для каждой окупаемости инвестиций.
  4. Получите средние значения для opTDP-43h в соответствии с той же процедурой, что и в 7.3.
  5. Для каждого ROI, после вычитания среднего для фонового ROI, разделите вычитаемое среднее для opTDP-43h на вычитаемое среднее для EGFP-TDP-43z для получения ратиометрического значения. Ратиометрические значения могут быть сопоставлены между различными точками времени и представлены с помощью графа столбцов в программном обеспечении Prism.

Результаты

Живая визуализация оптогенетических и неоптогенетических белков TDP-43 в спинномозговых двигательных нейронах личинок рыбок данио mnr2b+
Чтобы индуцировать фазовый переход TDP-43 в спинальных двигательных нейронах у рыбок данио, человеческий TDP-43h, помеченн?...

Обсуждение

Mnr2b-BAC-опосредованная экспрессия opTDP-43h и EGFP-TDP-43z у рыбок данио предоставляет уникальную возможность для живой визуализации фазового перехода TDP-43 в спинномозговых двигательных нейронах. Оптическая прозрачность тканей тела личинок рыбок данио позволяет проводить простую и неинваз?...

Раскрытие информации

KA и KK являются изобретателями интеллектуальной собственности, описанной в этой рукописи, и предварительные патенты были представлены Национальным институтом генетики.

Благодарности

Эта работа была поддержана SERIKA FUND (KA), KAKENHI Grant Numbers JP19K06933 (KA) и JP20H05345 (KA).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Confocal microscopeOlympusFV1200
Epifluorescence microscopeZEISSAxioimager Z1
Fluorescence stereomicroscopeLeicaMZ16FA
Glass base dishIWAKI3910-035
IncubatorMEECN-25C
LED panelNanoleaf LimitedNanoleaf AURORA smarter kit
Mupid-2plusTAKARAAD110
NucleoBond BAC100MACHEREY-NAGEL740579
NuSieve GTG AgaroseLONZA50181
Objective lensOlympusXLUMPlanFL N 20×/1.00
Objective lensZEISSPlan-Neofluar 5x/0.15
Optical power meterHIOKI3664
Optical sensorHIOKI9742-10
Phenol red solution 0.5%MerckP0290-100ML
PrimeSTAR GXL DNA PolymeraseTAKARAR050A
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704
Six-well dishFALCON353046
Spectrometer probe BLUE-WaveStellerNet Inc.VIS-50
Syringe needleTERUMONN-2725R
TaKaRa Ex TaqTAKARARR001A
TricaneSigma-AldrichA5040
Zebrafish BAC clone CH211-172N16BACPAC GenomicsCH211-172N16

Ссылки

  1. Brangwynne, C. P. Phase transitions and size scaling of membrane-less organelles. Journal of Cell Biology. 203 (6), 875-881 (2013).
  2. Hyman, A. A., Weber, C. A., Julicher, F. Liquid-liquid phase separation in biology. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 39-58 (2014).
  3. Lennox, A. L., et al. Pathogenic DDX3X mutations impair rna metabolism and neurogenesis during fetal cortical development. Neuron. 106 (3), 404-420 (2020).
  4. Nedelsky, N. B., Taylor, J. P. Bridging biophysics and neurology: aberrant phase transitions in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 15 (5), 272-286 (2019).
  5. Ramaswami, M., Taylor, J. P., Parker, R. Altered ribostasis: RNA-protein granules in degenerative disorders. Cell. 154 (4), 727-736 (2013).
  6. Nguyen, H. P., Van Broeckhoven, C., vander Zee, J. ALS genes in the genomic era and their implications for FTD. Trends in Genetics. 34 (6), 404-423 (2018).
  7. Pakravan, D., Orlando, G., Bercier, V., Van Den Bosch, L. Role and therapeutic potential of liquid-liquid phase separation in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Molecular Cell Biology. 13 (1), 15-28 (2021).
  8. Santamaria, N., Alhothali, M., Alfonso, M. H., Breydo, L., Uversky, V. N. Intrinsic disorder in proteins involved in amyotrophic lateral sclerosis. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (7), 1297-1318 (2017).
  9. Lagier-Tourenne, C., Cleveland, D. W. Rethinking ALS: the FUS about TDP-43. Cell. 136 (6), 1001-1004 (2009).
  10. Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. Multi-phaseted problems of TDP-43 in selective neuronal vulnerability in ALS. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (10), 4453-4465 (2021).
  11. Shin, Y., et al. Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optodroplets. Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).
  12. Zhang, P., et al. Chronic optogenetic induction of stress granules is cytotoxic and reveals the evolution of ALS-FTD pathology. Elife. 8, 39578 (2019).
  13. Mann, J. R., et al. RNA Binding Antagonizes Neurotoxic Phase Transitions of TDP-43. Neuron. 102 (2), 321-338 (2019).
  14. Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. Optogenetic modulation of TDP-43 oligomerization accelerates ALS-related pathologies in the spinal motor neurons. Nature Communications. 11 (1), 1004 (2020).
  15. Otte, C. G., et al. Optogenetic TDP-43 nucleation induces persistent insoluble species and progressive motor dysfunction in vivo. Neurobiology of Disease. 146, 105078 (2020).
  16. Wendik, B., Maier, E., Meyer, D. Zebrafish mnx genes in endocrine and exocrine pancreas formation. Developmental Biology. 268 (2), 372-383 (2004).
  17. Seredick, S. D., Van Ryswyk, L., Hutchinson, S. A., Eisen, J. S. Zebrafish Mnx proteins specify one motoneuron subtype and suppress acquisition of interneuron characteristics. Neural Development. 7, 35 (2012).
  18. Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Research. 33 (4), 36 (2005).
  19. Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nature Protocols. 6 (12), 1998-2021 (2011).
  20. Asakawa, K., Abe, G., Kawakami, K. Cellular dissection of the spinal cord motor column by BAC transgenesis and gene trapping in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, 100 (2013).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Taslimi, A., et al. An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function. Nature Communications. 5, 4925 (2014).
  23. Asakawa, K., Kawakami, K. Protocadherin-mediated cell repulsion controls the central topography and efferent projections of the abducens nucleus. Cell Reports. 24 (6), 1562-1572 (2018).
  24. Redchuk, T. A., et al. Optogenetic regulation of endogenous proteins. Nature Communications. 11 (1), 605 (2020).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

1802TDP 43mnr2bBAC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены