Optogenetischer Phasenübergang von TDP-43 in spinalen Motoneuronen von Zebrafischlarven

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Protokoll zur Induktion des Phasenübergangs des TAR-DNA-bindenden Proteins 43 (TDP-43) durch Licht in den spinalen Motoneuronen am Beispiel des Zebrafisches.

Zusammenfassung

Abnormale Proteinaggregation und selektive neuronale Vulnerabilität sind zwei Hauptmerkmale neurodegenerativer Erkrankungen. Kausale Zusammenhänge zwischen diesen Merkmalen können durch die Kontrolle des Phasenübergangs eines krankheitsassoziierten Proteins in einem anfälligen Zelltyp abgefragt werden, obwohl dieser experimentelle Ansatz bisher begrenzt war. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Induktion des Phasenübergangs des RNA/DNA-bindenden Proteins TDP-43 in spinalen Motoneuronen von Zebrafischlarven zur Modellierung der zytoplasmatischen Aggregation von TDP-43, die in degenerierenden Motoneuronen bei amyotropher Lateralsklerose (ALS) auftritt. Wir beschreiben eine auf einem bakteriellen künstlichen Chromosom (BAC) basierende genetische Methode, um eine optogenetische TDP-43-Variante selektiv an spinale Motoneuronen von Zebrafischen abzugeben. Die hohe Transluzenz von Zebrafischlarven ermöglicht den Phasenübergang des optogenetischen TDP-43 in den spinalen Motoneuronen durch eine einfache äußere Beleuchtung mittels einer Leuchtdiode (LED) gegen hemmungslose Fische. Wir präsentieren auch einen grundlegenden Workflow der Live-Bildgebung der Zebrafisch-Spinalmotorneuronen und der Bildanalyse mit frei verfügbarer Fiji / ImageJ-Software, um die Reaktionen des optogenetischen TDP-43 auf die Lichtbeleuchtung zu charakterisieren. Dieses Protokoll ermöglicht die Charakterisierung des TDP-43-Phasenübergangs und der Aggregatbildung in einer ALS-gefährdeten zellulären Umgebung, was eine Untersuchung seiner zellulären und Verhaltensfolgen erleichtern sollte.

Einleitung

Ribonukleoprotein (RNP)-Granula steuern eine Vielzahl von zellulären Aktivitäten im Zellkern und Zytoplasma, indem sie membranlose Trennwände über Flüssig-Flüssig-Phasentrennung (LLPS) zusammensetzen, ein Phänomen, bei dem eine homogene Flüssigkeit in zwei verschiedene flüssige Phasen ^zerlegt1,2. Das dysregulierte LLPS von RNA-bindenden Proteinen, die normalerweise als RNP-Granulatkomponenten fungieren, fördert einen abnormalen Phasenübergang, der zur Proteinaggregation führt. Dieser Prozess wurde mit neurologischen Entwicklungs- und neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung ^ge....

Protokoll

Alle Fischarbeiten wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren des Institutional Animal Care and Use Committee (Zulassungskennnummer 24-2) des National Institute of Genetics (Japan) durchgeführt, das eine Tierschutzgarantie (Assurance-Nummer A5561-01) beim Office of Laboratory Animal Welfare der National Institutes of Health (NIH, USA).

1. Aufbau von BACs zur Expression des optogenetischen TDP-43-Gens aus dem mnr2b-Promotor

1. BAC Vorbereitung
   1. Kaufen Sie einen Zebrafisch-BAC-Klon, der den Zebrafisch-mnr2b-Locus enthält (CH211-172N16, BACPAC Geno....

Ergebnisse

Live-Bildgebung von optogenetischen und nicht-optogenetischen TDP-43-Proteinen in den mnr2b+ spinalen Motoneuronen von Zebrafischlarven
Um den TDP-43-Phasenübergang in den spinalen Motoneuronen im Zebrafisch zu induzieren, wurde ein menschliches TDP-43h, das mit mRFP1 bzw. ^CRY2olig22 an den N- bzw. C-Termini markiert ist, konstruiert und als opTDP-43h14 bezeichnet (Abbildung 1A). D.......

Diskussion

Die mnr2b-BAC-vermittelte Expression von opTDP-43h und EGFP-TDP-43z im Zebrafisch bietet eine einzigartige Möglichkeit für die Live-Bildgebung des TDP-43-Phasenübergangs in den spinalen Motoneuronen. Die optische Transparenz des Körpergewebes von Zebrafischlarven ermöglicht die einfache und nichtinvasive optogenetische Stimulation von opTDP-43h. Vergleiche zwischen einzelnen spinalen Motoneuronen im Laufe der Zeit zeigten, dass die lichtabhängige Oligomerisierung von opTDP-43h seine zytoplasmatische Cluste.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Confocal microscope	Olympus	FV1200
Epifluorescence microscope	ZEISS	Axioimager Z1
Fluorescence stereomicroscope	Leica	MZ16FA
Glass base dish	IWAKI	3910-035
Incubator	MEE	CN-25C
LED panel	Nanoleaf Limited	Nanoleaf AURORA smarter kit
Mupid-2plus	TAKARA	AD110
NucleoBond BAC100	MACHEREY-NAGEL	740579
NuSieve GTG Agarose	LONZA	50181
Objective lens	Olympus	XLUMPlanFL N 20×/1.00
Objective lens	ZEISS	Plan-Neofluar 5x/0.15
Optical power meter	HIOKI	3664
Optical sensor	HIOKI	9742-10
Phenol red solution 0.5%	Merck	P0290-100ML
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase	TAKARA	R050A
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
Six-well dish	FALCON	353046
Spectrometer probe BLUE-Wave	StellerNet Inc.	VIS-50
Syringe needle	TERUMO	NN-2725R
TaKaRa Ex Taq	TAKARA	RR001A
Tricane	Sigma-Aldrich	A5040
Zebrafish BAC clone CH211-172N16	BACPAC Genomics	CH211-172N16