Optogenetischer Phasenübergang von TDP-43 in spinalen Motoneuronen von Zebrafischlarven

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Protokoll zur Induktion des Phasenübergangs des TAR-DNA-bindenden Proteins 43 (TDP-43) durch Licht in den spinalen Motoneuronen am Beispiel des Zebrafisches.

Zusammenfassung

Abnormale Proteinaggregation und selektive neuronale Vulnerabilität sind zwei Hauptmerkmale neurodegenerativer Erkrankungen. Kausale Zusammenhänge zwischen diesen Merkmalen können durch die Kontrolle des Phasenübergangs eines krankheitsassoziierten Proteins in einem anfälligen Zelltyp abgefragt werden, obwohl dieser experimentelle Ansatz bisher begrenzt war. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Induktion des Phasenübergangs des RNA/DNA-bindenden Proteins TDP-43 in spinalen Motoneuronen von Zebrafischlarven zur Modellierung der zytoplasmatischen Aggregation von TDP-43, die in degenerierenden Motoneuronen bei amyotropher Lateralsklerose (ALS) auftritt. Wir beschreiben eine auf einem bakteriellen künstlichen Chromosom (BAC) basierende genetische Methode, um eine optogenetische TDP-43-Variante selektiv an spinale Motoneuronen von Zebrafischen abzugeben. Die hohe Transluzenz von Zebrafischlarven ermöglicht den Phasenübergang des optogenetischen TDP-43 in den spinalen Motoneuronen durch eine einfache äußere Beleuchtung mittels einer Leuchtdiode (LED) gegen hemmungslose Fische. Wir präsentieren auch einen grundlegenden Workflow der Live-Bildgebung der Zebrafisch-Spinalmotorneuronen und der Bildanalyse mit frei verfügbarer Fiji / ImageJ-Software, um die Reaktionen des optogenetischen TDP-43 auf die Lichtbeleuchtung zu charakterisieren. Dieses Protokoll ermöglicht die Charakterisierung des TDP-43-Phasenübergangs und der Aggregatbildung in einer ALS-gefährdeten zellulären Umgebung, was eine Untersuchung seiner zellulären und Verhaltensfolgen erleichtern sollte.

Einleitung

Ribonukleoprotein (RNP)-Granula steuern eine Vielzahl von zellulären Aktivitäten im Zellkern und Zytoplasma, indem sie membranlose Trennwände über Flüssig-Flüssig-Phasentrennung (LLPS) zusammensetzen, ein Phänomen, bei dem eine homogene Flüssigkeit in zwei verschiedene flüssige Phasen ^zerlegt1,2. Das dysregulierte LLPS von RNA-bindenden Proteinen, die normalerweise als RNP-Granulatkomponenten fungieren, fördert einen abnormalen Phasenübergang, der zur Proteinaggregation führt. Dieser Prozess wurde mit neurologischen Entwicklungs- und neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung ^{gebracht3,4,5}. Die genaue Bewertung eines kausalen Zusammenhangs zwischen aberrantem LLPS von RNA-bindenden Proteinen und der Krankheitspathogenese ist entscheidend dafür, ob und wie LLPS als wirksames therapeutisches Ziel genutzt werden kann. LLPS von RNA-bindenden Proteinen ist relativ einfach in vitro und in einzelligen Modellen zu untersuchen, ist aber in mehrzelligen Organismen, insbesondere bei Wirbeltieren, schwierig. Eine kritische Voraussetzung für die Analyse eines solchen LLPS in einzelnen Zellen innerhalb einer Gewebeumgebung besteht darin, eine Sonde für die Bildgebung und Manipulation von LLPS in einem krankheitsgefährdeten Zelltyp von Interesse stabil auszudrücken.

Die Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist eine letztlich tödliche neurologische Erkrankung, bei der Motoneuronen des Gehirns und des Rückenmarks durch Degeneration selektiv und progressiv verloren gehen. Bis heute wurden Mutationen in mehr als 25 Genen mit der vererbbaren (oder familiären) Form von ALS in Verbindung gebracht, die 5% -10% der gesamten ALS-Fälle ausmacht, und einige dieser ALS-verursachenden Gene kodieren RNA-bindende Proteine, die aus RNPs bestehen, wie hnRNPA1, TDP-43 und ^FUS6,7. Darüber hinaus ist die sporadische Form von ALS, die 90% -95% der gesamten ALS-Fälle ausmacht, durch die zytoplasmatische Aggregation von TDP-43 gekennzeichnet, die in degenerierenden Motoneuronen abgelagert wird. Ein Hauptmerkmal dieser ALS-assoziierten RNA-bindenden Proteine sind ihre intrinsisch ungeordneten Regionen (IDRs) oder Domänen mit geringer Komplexität, denen geordnete dreidimensionale Strukturen fehlen und die schwache Protein-Protein-Interaktionen mit vielen verschiedenen Proteinen vermitteln, die LLPS ^antreiben7,8. Die Tatsache, dass ALS-verursachende Mutationen häufig in den IDRs auftreten, hat zu der Idee geführt, dass aberrantes LLPS und Phasenübergang dieser ALS-verwandten Proteine der ALS-Pathogenese zugrunde liegen ^könnten9,10.

Vor kurzem wurde die optoDroplet-Methode, eine Cryptochrome 2-basierte optogenetische Technik, die die Modulation von Protein-Protein-Interaktionen durch Licht ermöglicht, entwickelt, um den Phasenübergang von Proteinen mit ^IDRs11 zu induzieren. Da diese Technik erfolgreich auf TDP-43 ausgeweitet wurde, hat sie begonnen, die Mechanismen aufzudecken, die dem pathologischen Phasenübergang von TDP-43 und der damit verbundenen Zytotoxizität zugrunde liegen12,13,14,15. In diesem Protokoll skizzieren wir eine genetische Methode zur Abgabe eines optogenetischen TDP-43 an ALS-gefährdete Zelltypen, nämlich spinale Motoneuronen im Zebrafisch unter Verwendung des BAC für das mnr2b/mnx2b-Gen, das für ein homöodomänes Protein für die Motoneuronspezifikation ^kodiert16,17. Die hohe Transluzenz von Zebrafischlarven ermöglicht eine einfache, nichtinvasive Lichtstimulation des optogenetischen TDP-43, die seinen Phasenübergang in den spinalen Motoneuronen auslöst. Wir präsentieren auch einen grundlegenden Workflow für die Live-Bildgebung der Zebrafisch-Spinalmotorneuronen und die Bildanalyse mit der frei verfügbaren Fiji/ImageJ-Software, um die Reaktionen des optogenetischen TDP-43 auf die Lichtstimulation zu charakterisieren. Diese Methoden ermöglichen eine Untersuchung des TDP-43-Phasenübergangs in einer ALS-gefährdeten zellulären Umgebung und sollten dazu beitragen, seine pathologischen Folgen auf zellulärer und Verhaltensebene zu untersuchen.

Protokoll

Alle Fischarbeiten wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren des Institutional Animal Care and Use Committee (Zulassungskennnummer 24-2) des National Institute of Genetics (Japan) durchgeführt, das eine Tierschutzgarantie (Assurance-Nummer A5561-01) beim Office of Laboratory Animal Welfare der National Institutes of Health (NIH, USA).

1. Aufbau von BACs zur Expression des optogenetischen TDP-43-Gens aus dem mnr2b-Promotor

1. BAC Vorbereitung
   1. Kaufen Sie einen Zebrafisch-BAC-Klon, der den Zebrafisch-mnr2b-Locus enthält (CH211-172N16, BACPAC Genomics). Reinigen Sie die BAC-DNA aus einer 5-ml-LB-Kultur von DH10B Escherichia coli (E. coli) mit CH211-172N16 über Nacht, wie in Warming et al.18 beschrieben.
   2. Umwandlung von CH211-172N16 in SW102 E. coli-Zellen durch Elektroporation, wie in Warming et ^al.18 beschrieben.
      HINWEIS: Die Aufreinigung der BAC-DNA aus den E. coli am selben Tag der Elektroporation führt in der Regel zu einer höheren Erfolgsrate der BAC-Transformation18. Andernfalls wird die gereinigte BAC-DNA bis zur Verwendung bei -20 °C gehalten.
   3. Einführung der iTol2-Ampere-Kassette für die Tol2-Transposon-vermittelte BAC-Transgenese19 in das Rückgrat von CH211-172N16 durch Elektroporation, wie in Asakawa et ^al.20 beschrieben.
      1. Herstellung eines Glycerinbestands der E. coli-Zellklone , die CH211-172N16 tragen, mit der iTol2-Ampere-Kassettenintegration (CH211-172N16-iTol2A), nachdem die homologe rekombinationsvermittelte Integration durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) (Ex Taq) unter Verwendung des Primerpaares Tol2-L-out (5'-AAA GTA TCT GGC TAG AAT CTT ACT TGA-3') und pTARBAC-13371r (5'-TAG CGG CCG CAA ATT TAT TA-3') und der folgenden Bedingungen bestätigt wurde: ein Denaturierungsschritt bei 98 °C für 1 min, gefolgt von 25 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 10 s, Primerglühen bei 55 °C für 15 s und Primerverlängerung bei 72 °C für 1 min, wobei ein PCR-Produkt von 354 Basenpaaren (bp) verstärkt wird.
2. mnr2b-hs:opTDP-43h Konstruktion
   1. Konstruieren Sie ein Plasmid, das die Expressionskassette für den menschlichen Wildtyp TDP-43/TARDBP (TDP-43h) trägt, der mit mRFP1 und CRY2olig an den N- bzw. C-Termini (im Folgenden opTDP-43h)¹⁴ markiert ist.
      HINWEIS: Das opTDP-43h-Fragment sollte mit der Zebrafisch-HSP70l-Genpromotorsequenz (650 bp) und der Polyadenylierungs-Signalsequenz (PolyA) flankiert werden, gefolgt von einem Kanamycin-Resistenzgen (hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan)¹⁴.
   2. Amplifizieren Sie die hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan-Kassette mit Primern, die hsp70l und Kan glühen und 45 bp-Sequenzen der upstream und downstream der Initiator-Codons des mnr2b-Gens enthalten, durch PCR (GXL DNA Polymerase) unter Verwendung des Primerpaares mnr2b-hspGFF-Forward (5'-tat cag cgc aat tac ctg caa ctc taa aca caa aag tgt tgc aGA ATT CAC TGG AGG CTT CCA GAA C-3') und Km-r (5'-ggt tct tca gct aaa agg gcg tcg atc ctg aag ttc ttt gac ttt tcc atC AAT TCA GAA GAA CTC GTC AAG AA-3') mit folgenden Bedingungen: ein Denaturierungsschritt bei 98 °C für 1 min, gefolgt von 30 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 10 s, Primerglühen bei 55 °C für 15 s und Primerverlängerung bei 68 °C für 30 s, Amplifikation eines PCR-Produkts von ~5,7 bp.
   3. Trennen Sie die PCR-Produkte durch Agarosegelelektrophorese (100 V) und reinigen Sie die hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan DNA-Bande mit einer DNA-Säule. Stellen Sie die Konzentration der gereinigten hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan-Kassette auf 50 ng/μL im Tris-EDTA-Puffer (TE) ein, der 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 1 mM EDTA enthält.
   4. Führen Sie die hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan-Kassette durch Elektroporation wie in Warming et al.18 beschrieben in CH211-172N16-iTol2A ein und wählen Sie Ampicillin- und Kanamycin-resistente Transformationsmittel auf LB-Agarplatten aus. CH211-172N16-iTol2A mit der hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan-Kassette wird als mnr2b-hs:opTDP-43h bezeichnet.
   5. Reinigen Sie mnr2b-hs:opTDP-43h mit einem BAC-Reinigungskit und lösen Sie es nach der Phenol/Chloroform-Extraktion bei 250 ng/μL in TE auf.
3. mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z Konstruktion
   1. Konstruieren Sie ein weiteres Plasmid, das den Zebrafisch-Wildtyp-Tardbp trägt, der mit einem verbesserten grün fluoreszierenden Protein (EGFP) an seinem N-Terminus (EGFP-TDP-43z) anstelle von opTDP-43h markiert ist, aber ansonsten mit dem hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan-Konstrukt (hsp70l-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan)¹⁴ identisch ist. Verwenden Sie EGFP-TDP-43z als interne Kontrolle für die Lichtstimulation von opTDP-43h.
   2. Konstruieren Sie CH211-172N16-iTol2A, das die hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan-Kassette im mnr2b-Locus beherbergt, wie in 1.2.1-1.2.5 beschrieben. CH211-172N16-iTol2A, das die hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan-Kassette trägt, wird als mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z bezeichnet.

2. Tol2-Transposon-vermittelte BAC-Transgenese bei Zebrafischen

1. Die Injektionslösung enthält 40 mM KCl, Phenolrot (10 % v/v), 25 ng/μL der mnr2b-hs:opTDP-43h DNA und 25 ng/μL Tol2 Transposase ^mRNA19.
2. 1 nL der Injektionslösung (ein in Mineralöl kalibriertes Tröpfchen mit einem Durchmesser von ca. 123 μm) wird im Einzellstadium in das Zytosol von Wildtyp-Zebrafischembryonen injiziert. Screenen Sie den injizierten Fisch auf die Bildung von rot fluoreszierenden Protein (RFP) -positiven Aggregaten in verschiedenen embryonalen Geweben, einschließlich spinaler Motoneuronen, unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop 2-3 Tage nach der Befruchtung (dpf). Heben Sie den RFP-positiven Fisch bis zum Erwachsenenalter an.
3. Injizieren Sie die mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z DNA wie in 2.1 und 2.2 beschrieben. EGFP-positive Fische bis ins Erwachsenenalter aufziehen.
4. Nach einigen Monaten geschlechtsgereifte injizierte Fische und Wildtypfische paarweise in Standard-2-L-Paarungskäfige legen, um F1-Nachkommen zu erhalten. Screen F1 Fisch bei 3 dpf für RFP (opTDP-43h) oder EGFP (EGFP-TDP-43z) Fluoreszenz in der wirbelsäulenmotorischen Säule mit einem Epifluoreszenzmikroskop mit einer Plan-Neofluar 5x/0,15 Objektivlinse. Typischerweise wird ein Gründerfisch aus 10-20 injizierten Fischen identifiziert (die Keimbahnübertragungsrate beträgt 5% -10%).
5. Isolieren und vergleichen Sie mehrere Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] und Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] Einsätze von verschiedenen Gründerfischen, da die Intensität, aber nicht das Muster, der opTDP-43h- oder EGFP-TDP-43z-Expression zwischen den Gründerfischen aufgrund von Chromosomenpositionseffekten variieren kann.
6. Kreuzen Sie Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] und Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] Fischlinien, um Nachkommen zu erhalten, die Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] doppelt transgenen Fisch in einem Mendelschen Verhältnis enthalten.
7. Den Fisch in einer Plastikschale mit 30 ml E3-Puffer (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM _CaCl2, 0,33 mM _MgSO4, 10-5% Methylenblau) aufziehen und ^8-10 h nach der Befruchtung (hpf) 0,003% (w/v) N-Phenylthiourea hinzufügen, um die Melanogenese zu hemmen.
8. Die Kunststoffschale nach 30 hpf mit Alufolie abdecken.

3. Vorbereitung der LED für die Blaulichtbeleuchtung

1. Schalten Sie ein LED-Panel ein, indem Sie die zugehörige Anwendung verwenden, die auf einem Tablet/Smartphone installiert ist. Setzen Sie die Sonde eines Spektrometers in einen leeren Brunnen einer 6-Well-Schüssel und stellen Sie das LED-Licht durch die Anwendung auf die Wellenlänge von ~ 456 nm ein. Platzieren Sie den optischen Sensor eines optischen Leistungsmessers im leeren Brunnen und stellen Sie die Leistung des LED-Lichts (~0,61 mW/^cm2) ein. Die LED-Lichteinstellung kann gespeichert werden und ist in der Anwendung abrufbar.
2. Führen Sie die Schalen-/LED-Panel-Einstellung bei 28 °C in den Inkubator ein. Beenden Sie diesen Schritt, bevor die Bildgebung von Fischen bei 48 hpf beginnt.

4. Bildgebung von Zebrafischlarven, die optogenetische TDP-43 exprimieren

1. Wählen Sie Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] doppeltransgene Fische mindestens vor 47 hpf, basierend auf RFP (opTDP-43h) oder EGFP (EGFP-TDP-43z) Fluoreszenz in der wirbelsäulenmotorischen Säule mit dem oben beschriebenen Epifluoreszenzmikroskop-Setup.
2. Dekreionieren Sie den doppelt transgenen Fisch Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z].
3. 1% Agarose mit niedriger Schmelztemperatur mit 250 μg/ml Ethyl-3-aminobenzoat-Methansulfonatsalz bei 42 °C vorheizen.
4. Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43] doppelt transgenen Fisch bei 48 hpf in E3-Puffer, der die gleiche Konzentration an Trican enthält, kurz betäuben.
5. Geben Sie einen Tropfen der vorgewärmten 1% niedrigen Schmelztemperatur Agarose bei Raumtemperatur auf die Glasbodenschale. Der Durchmesser des kuppelförmigen Agarosetropfens auf der Glasschale beträgt 8-10 mm.
6. Mit einer Pasteurpipette den betäubten Fisch zu der Agarose mit niedriger Schmelztemperatur auf der Glasbodenschale geben und dann einige Male durch Pipettieren mischen. Minimieren Sie die Menge des E3-Puffers, der der Agarose zusammen mit dem Fisch hinzugefügt wird.
7. Halten Sie den Fisch auf der Seite, indem Sie während der Erstarrung von Agarose (typischerweise ~ 1 min) eine Spritzennadel verwenden, um sicherzustellen, dass sich das Rückenmark in einer geeigneten horizontalen Position befindet. Nach der Erstarrung ein paar Tropfen E3-Puffer auf den kuppelförmigen Agarose-montierten Fisch geben.
8. Erfassen Sie serielle konfokale Z-Schnitte des Rückenmarks durch Scannen mit einem konfokalen Mikroskop, das mit einer 20-fachen Wasserimmersionsobjektivlinse mit der numerischen Apertur 1,00 ausgestattet ist, mit einer Scangeschwindigkeit von 4,0 μs pro Pixel (12 Bit pro Pixel), einer Schrittgröße von 1,0 μm pro Schicht für das Objektiv und einer Kombination aus Anregungs-/Emissionswellenlängen: Kanal 1) 473/510 nm für EGFP und Kanal 2) 559/583 nm für mRFP1.
   HINWEIS: Die Kloake auf der ventralen Seite des Fisches ist in den Regionen von Interesse (ROI) als Referenz enthalten, was hilft, die Wirbelsäulensegmente (Ebenen 16-17) über die Zeitpunkte hinweg zu identifizieren und zu vergleichen.
9. Entfernen Sie den Fisch aus der Agarose, indem Sie die Agarose vorsichtig mit einer Spritzennadel knacken, sobald die Bildgebung abgeschlossen ist. Halten Sie die Zeit, in der der Fisch in die Agarose eingebettet ist, so kurz wie möglich, obwohl die Agaroseeinbettung für <30 min die Lebensfähigkeit des Fisches nicht beeinträchtigt.

5. Lichtstimulation von opTDP-43h-exprimierenden Fischen durch Feldbeleuchtung einer blauen Leuchtdiode (LED)

1. Fügen Sie 7,5 ml E3-Puffer in das Bohrloch hinzu und platzieren Sie den abgebildeten Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] doppeltransgenen Fisch in den Brunnen. Platzieren Sie die Sechs-Well-Schüssel auf dem LED-Panel, indem Sie die Schüssel und das LED-Panel mit einem Abstandshalter 5 mm voneinander entfernt halten (z. B. mit fünf gestapelten Diagläsern).
2. Schalten Sie das blaue LED-Licht ein. Bewahren Sie einige der doppelt transgenen Fische Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] in einer separaten Sechs-Well-Schüssel auf, die mit Aluminiumfolie bedeckt ist, wenn unilluminierte Kontrollfische erforderlich sind (d. h. bei dunklen Bedingungen)¹⁴.
3. Stellen Sie nach der Beleuchtung (z. B. für 24 h bei 72 hpf in Abbildung 3) das Rückenmark des beleuchteten Fisches dar, indem Sie die Schritte 4.3 - 4.9 wiederholen.

6. Visualisierung der zytoplasmatischen Verlagerung von optogenetischem TDP-43 in den spinalen Motoneuronen

1. Öffnen Sie die Bilddatei in ImageJ/^Fiji21 (Version: 2.1.0/1.53c), einem von NIH Image entwickelten Open-Source-Java-Bildverarbeitungsprogramm, das von https://imagej.net/Fiji/Downloads heruntergeladen werden kann.
2. Verwenden Sie die Z-Bildlaufleiste, um sich durch die Fokusebenen zu bewegen. Erstellen Sie eine Maximale Intensitätsprojektion mehrerer Slices, indem Sie auf Bild | Stapel | Z-Projekt-| Max Intensity und Einstellung Start Slice und Stop Slice, die die Hemisegmente der spinalmotorischen Säule abdecken.
3. Teilen Sie das Mehrkanalbild in zwei Einkanalbilder auf, indem Sie auf Bild | | Geteilte Kanäle.
4. Verbessern Sie das EGFP-TDP-43z-Signal, um sicherzustellen, dass das zytoplasmatische EGFP-TDP-43z deutlich sichtbar ist, indem Sie auf Bild | | anpassen Helligkeit/Kontrast und Anpassung Minimum
5. Öffnen Sie den ROI-Manager, indem Sie auf | analysieren klicken Werkzeuge | ROI-Manager. Finden Sie die Zellen, die in beiden Bildern bei 48 hpf und 72 hpf identifizierbar sind, basierend auf den relativen Positionen der Zellkörper. Legen Sie die ROIs fest, indem Sie die Konturen der Zellkörper einzelner spinaler Motoneuronen skizzieren, die durch das EGFP-TDP-43z-Signal mithilfe der Freihandauswahl visualisiert werden, und dann im ROI-Manager auf Hinzufügen[t] klicken.
6. Legen Sie eine Hauptachse des Somas fest, indem Sie mit Gerade eine gerade Linie zeichnen und auf Analysieren (Analyze | Plotprofil für EGFP-TDP-43z (C1) und opTDP-43h (C2) Bilder bei 48 und 72 hpf.
7. Normalisieren Sie das Plotprofil, indem Sie die Werte durch den größten Wert für jedes EGFP-TDP-43z- und opTDP-43h-Signal dividieren. Zeichnen Sie die normalisierten Werte mit x-y-Koordinaten, wobei x und y die Hauptachse des Somas bzw. die relativen Fluoreszenzintensitäten darstellen, mit XY-Diagramm in einer statistischen Software.

7. Ratiometrischer Vergleich zwischen opTDP-43h- und EGFP-TDP-43z-Signalen mit ImageJ/Fiji

1. Öffnen Sie die Bilddatei in ImageJ/Fiji und legen Sie ROIs für einzelne mnr2b-positive Zellen fest, indem Sie ein Projektionsbild mit maximaler Intensität von EGFP-TDP-43z wie in 6.1-6.5 verwenden. Fügen Sie einen ROI außerhalb des ventralen Rückenmarks hinzu (z. B. Notochord), um das Hintergrundsignal (Hintergrund-ROI) darzustellen.
2. Erstellen Sie für jedes EGFP-TDP-43z- und opTDP-43-Bild eine Projektion mehrerer Slices, indem Sie auf Bild | Stapel | Z-Projekt-| Addieren Sie Slices und legen Sie Start Slice und Stop Slice fest, die die hemispinale Motorsäule abdecken.
3. Öffnen Sie den ROI-Manager, der mit dem Projektionsbild der maximalen Intensität erstellt wurde. Zeigen Sie die ROIs auf dem Image Sum Slices an, indem Sie das Image-Fenster für EGFP-TDP-43z auswählen und dann im ROI-Manager auf Alle anzeigen klicken. Klicken Sie im ROI-Manager auf Messen , um Mittelwerte für jeden ROI zu erhalten.
4. Erfassen Sie die Mittelwerte für opTDP-43h nach dem gleichen Verfahren wie in 7.3.
5. Dividieren Sie für jeden ROI nach Abzug des Mittelwerts für den Hintergrund-ROI den subtrahierten Mittelwert für opTDP-43h durch den subtrahierten Mittelwert für EGFP-TDP-43z, um den ratiometrischen Wert zu erhalten. Die ratiometrischen Werte können zwischen verschiedenen Zeitpunkten verglichen und mithilfe des Säulendiagramms in der Prism-Software dargestellt werden.

Ergebnisse

Live-Bildgebung von optogenetischen und nicht-optogenetischen TDP-43-Proteinen in den mnr2b+ spinalen Motoneuronen von Zebrafischlarven
Um den TDP-43-Phasenübergang in den spinalen Motoneuronen im Zebrafisch zu induzieren, wurde ein menschliches TDP-43h, das mit mRFP1 bzw. ^CRY2olig22 an den N- bzw. C-Termini markiert ist, konstruiert und als opTDP-43h14 bezeichnet (Abbildung 1A). D...

Diskussion

Die mnr2b-BAC-vermittelte Expression von opTDP-43h und EGFP-TDP-43z im Zebrafisch bietet eine einzigartige Möglichkeit für die Live-Bildgebung des TDP-43-Phasenübergangs in den spinalen Motoneuronen. Die optische Transparenz des Körpergewebes von Zebrafischlarven ermöglicht die einfache und nichtinvasive optogenetische Stimulation von opTDP-43h. Vergleiche zwischen einzelnen spinalen Motoneuronen im Laufe der Zeit zeigten, dass die lichtabhängige Oligomerisierung von opTDP-43h seine zytoplasmatische Cluste...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Confocal microscope	Olympus	FV1200
Epifluorescence microscope	ZEISS	Axioimager Z1
Fluorescence stereomicroscope	Leica	MZ16FA
Glass base dish	IWAKI	3910-035
Incubator	MEE	CN-25C
LED panel	Nanoleaf Limited	Nanoleaf AURORA smarter kit
Mupid-2plus	TAKARA	AD110
NucleoBond BAC100	MACHEREY-NAGEL	740579
NuSieve GTG Agarose	LONZA	50181
Objective lens	Olympus	XLUMPlanFL N 20×/1.00
Objective lens	ZEISS	Plan-Neofluar 5x/0.15
Optical power meter	HIOKI	3664
Optical sensor	HIOKI	9742-10
Phenol red solution 0.5%	Merck	P0290-100ML
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase	TAKARA	R050A
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
Six-well dish	FALCON	353046
Spectrometer probe BLUE-Wave	StellerNet Inc.	VIS-50
Syringe needle	TERUMO	NN-2725R
TaKaRa Ex Taq	TAKARA	RR001A
Tricane	Sigma-Aldrich	A5040
Zebrafish BAC clone CH211-172N16	BACPAC Genomics	CH211-172N16