얼룩말 물고기 애벌레의 척추 모터 뉴런에서 TDP-43의 광유전학 적 단계 전환

요약

우리는 제브라피시를 모델로 사용하여 척추 운동 뉴런의 빛에 의한 TAR DNA 결합 단백질(43)의 위상 전이를 유도하는 프로토콜을 설명합니다.

초록

비정상적인 단백질 집계 및 선택적 뉴런 취약성은 신경 퇴행성 질환의 두 가지 주요 특징입니다. 이러한 특징 들 사이의 인과 관계는 취약한 세포 유형에서 질병 관련 단백질의 위상 전이를 제어함으로써 심문 될 수 있지만, 이러한 실험적 접근방식은 지금까지 제한되었습니다. 여기서, 근위축성 측삭 경화증(ALS)에서 퇴행성 모터 뉴런에서 발생하는 TDP-43의 세포질 응집 모델링을 위한 제브라피시 애벌레의 척추 운동 뉴런에서 RNA/DNA 결합 단백질 TDP-43의 위상 전이를 유도하는 프로토콜을 설명합니다. 우리는 제브라피시의 척추 운동 뉴런에 선택적으로 광유전학 TDP-43 변종을 전달하는 세균성 인공 염색체 (BAC)기지를 둔 유전 방법을 기술합니다. 제브라피시 애벌레의 높은 투명도는 억제되지 않은 물고기에 대한 발광 다이오드(LED)를 사용하여 간단한 외부 조명에 의해 척추 운동 뉴런에서 광유전학 TDP-43의 위상 전환을 허용합니다. 우리는 또한 광 조명에 광유전학 TDP-43의 반응을 특성화하기 위해 자유롭게 사용할 수있는 피지 / ImageJ 소프트웨어와 함께 제브라피쉬 척추 운동 뉴런및 이미지 분석의 라이브 이미징의 기본 워크플로우를 제시한다. 이 프로토콜은 ALS 취약 세포 환경에서 TDP-43 위상 전환 및 집계 형성의 특성화를 가능하게 하며, 이는 세포 및 행동 결과에 대한 조사를 용이하게 해야 합니다.

서문

리보뉴클레오단백질(RNP) 과립은 균질유체가 2개의 뚜렷한 액체 상^1,2로 분해되는 현상인 액체 액체 상 분리(LLPS)를 통해 멤브레인 이없는 분할을 조립하여 핵 및 세포질에서 무수한 세포 활동을 제어합니다. RNP 과립 성분으로 일반적으로 작동하는 RNA 결합 단백질의 소화 불량 LLPS는 단백질 응집으로 이끌어 내는 이상한 상 전이를 촉진합니다. 이 과정은 신경 발달 및 신경 퇴행성 질환에 연루되었습니다^3,4,5. RNA 결합 단백질과 질병 병인의 비정상적인 LLPS 사이의 인과 관계의 정확한 평가는 LLPS가 효과적인 치료 대상으로 악용 될 수있는 여부와 방법을 결정하기위해 중요합니다. RNA 결합 단백질의 LLPS는 시험관 내 및 단세포 모형에서 공부하기 쉽지만 다세포 유기체, 특히 척추동물에서는 어렵습니다. 조직 환경 내의 개별 세포에서 이러한 LLPS를 분석하기 위한 중요한 요구 사항은 질병에 취약한 세포 유형의 LLPS의 이미징 및 조작을 위한 프로브를 안정적으로 표현하는 것입니다.

근위축성 측삭 경화증 (ALS)은 뇌와 척수의 운동 뉴런이 변성으로 인해 선택적으로 점진적으로 손실되는 궁극적으로 치명적인 신경 장애입니다. 현재까지 25개 이상의 유전자에 있는 돌연변이는 총 ALS 케이스의 5%-10%를 차지하는 유전성(또는 가족적인) 형태의 ALS와 연관되어 있으며, 이들 ALS 유발 유전자 중 일부는 hnRNPA1, TDP-43 및 ^FUS6,7과 같은 RNP로 구성된 RNA 결합 단백질을 인코딩합니다. 더욱이, 총 ALS 케이스의 90%-95%를 차지하는 ALS의 산발적인 양식은 퇴행성 운동 뉴런에 증착된 TDP-43의 세포질 집계를 특징으로 합니다. 이러한 ALS 관련 RNA 결합 단백질의 주요 특징은 본질적으로 무질서한 영역(IDRs) 또는 주문된 3차원 구조가 부족한 저복잡성 영역이며 ^LLPS7,8을 구동하는 많은 다른 단백질과 약한 단백질 단백질 상호 작용을 중재합니다. ALS 일으키는 돌연변이가 IDRs에서 수시로 생기는 다는 사실은 이 ALS 관련 단백질의 비정상적인 LLPS 및 위상 전이가 ALS 병인^9,10의 기초가 될 수 있다는 생각으로 이끌어 냈습니다.

최근에는 광에 의한 단백질-단백질 상호작용을 조절할 수 있는 Cryptochrome 2기반 광유전학기인 OptoDroplet 방법이 ^IDRs11을 이용한 단백질의 위상 전이를 유도하기 위해 개발되었다. 이 기술은 TDP-43로 성공적으로 확장되었기 때문에 TDP-43의 병리학적 위상 전환과 그 관련 세포 독성^12,13,14,15의 기전을 밝히기 시작^했습니다. 이 프로토콜에서, 우리는 ALS 취약 세포 모형, 즉, mnr2b/mnx2b 유전자를 위한 BAC를 사용하여 제브라피시의 척추 운동 뉴런에 광유전학 TDP-43을 전달하는 유전 적 방법을 간략하게 설명합니다^16,17. 제브라피시 애벌레의 높은 투명도는 척추 운동 뉴런의 위상 전환을 유발하는 광유전학 TDP-43의 간단하고 비침습적인 빛 자극을 허용합니다. 우리는 또한 광 자극에 대한 광유전학 TDP-43의 반응을 특성화하기 위해 자유롭게 사용할 수있는 피지 / ImageJ 소프트웨어를 사용하여 제브라피쉬 척추 운동 뉴런및 이미지 분석의 라이브 이미징을위한 기본 워크플로우를 제시합니다. 이러한 방법은 ALS 취약 한 세포 환경에서 TDP-43 단계 전이의 조사를 허용 하 고 세포 및 행동 수준에서 그것의 병적인 결과 탐구 하는 데 도움이 되어야 한다.

프로토콜

모든 어류 작업은 국립보건원 동물복지실(NIH, NIH)의 동물복지실(보증번호 A5561-01)을 제출하는 국립유전학원(일본)의 실험실 동물 관리 및 사용 가이드(일본 24-2)에 따라 진행되었습니다. 미국).

1. mnr2b 프로모터로부터 광유전학 TDP-43 유전자의 발현을 위한 BAC의 건설

1. BAC 준비
   1. 제브라피쉬 mnr2b 궤적(CH211-172N16, BACPAC 유전체학)을 함유한 제브라피쉬 BAC 클론을 구입한다. 온난화 외 ¹⁸에 기술된 바와 같이 CH211-172N16을 항구하는 DH10B 대장균(E. coli)의 5mL 하룻밤 LB 배양으로부터 BAC DNA를 정화한다.
   2. 온난화 외 ¹⁸에 설명된 바와 같이, 전기화에 의해 CH211-172N16을 전기기화로 변환한다.
      참고: 전기기화 당일 대장균 으로부터 BAC DNA의 정제는 일반적으로 BAC ^transform18의 높은 성공률을 제공합니다. 그렇지 않으면, 정제된 BAC DNA는 사용전까지 -20°C로 유지된다.
   3. 아사카와 등에서 설명한 바와 같이, 전기포공에 의한 CH211-172N16의 중^추에 Tol2-amp-amp 카세트를 도입^한다.
      1. E의 글리세롤 스톡을 만드십시오. 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의한 상동성 재조합-통합을 확인한 후 iTol2-amp 카세트 통합(CH211-172N16-iTol2A)을 탑재한 콜라 세포 클론(Ex Taq) 프라이머 쌍 Tol2-L-out (5'-AAA GTA TCT GGC TAG AAT CTT ACT TGA-3') 및 pTARBAC-13371r (5'-TAG CGG CCG CAA ATT TAT TA-3') 및 다음과 같은 조건을 사용하여: 1분 동안 98°C에서 의 하부절 단계, 10초 동안 95°C에서 25사이클의 내성, 15s에 대해 55°C의 프라이머 어닐링, 프라이머 연장은 72°C에서 1분 동안 72°C, 354개의 베이스 쌍(bp)의 PCR 생성을 증폭시켰다.
2. mnr2b-hs:opTDP-43h 건설
   1. N-및 C-테르미니에서 mRFP1 및 CRY2olig로 태그되는 인간 야생형 TDP-43/TARDBP (TDP-43h)에 대한 발현 카세트를 운반하는 플라스미드를 각각(이하 opTDP-43h)¹⁴에 구성한다.
      참고: opTDP-43h 단편은 제브라피쉬 hsp70l 유전자 프로모터 서열(650bp) 및 폴리아데닐립(polyA) 신호 서열과 측면으로, 카나마이신 저항 유전자(hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan)¹⁴와 함께 한다.
   2. hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan 카세트를 프롤러 hsp70l 및 칸을 음질하고 PCR(GXL DNA 폴리머라제)에 의한 mnr2b 유전자의 인니티에이터 코돈의 상류 및 하류의 45bp 서열을 함유하고 있습니다. b-hspGFF-Forward (5'tat cag cag caa ctg caa ctc taa aca caa caa aag tgt tgc aGA ATT CAC TGG AG CTT CCA GAA C-3') 및 Km-r (5'ggt tct tca gct aaa agg tcg tcg atcc atc cc ctg aag ttc ttt gac ttt tcc atC AAT TCA GAA GAA CTC GTC AAG AAG AA-3') 다음과 같은 조건: 98°C에서 1 분 동안 의 내포화 단계, 10에 대한 95 °C에서 30 사이클, 55 °C에서 55 ° C, 프라이머 앤날링 15 ° C ~5.7 bp의 PCR 제품을 증폭.
   3. PCR 제품을 아가로즈 젤 전기포고(100 V)로 분리하고 HSp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan DNA 대역을 DNA 컬럼으로 정화한다. 10mM Tris-HCl(pH 8.0) 및 1mM EDTA를 포함하는 트리스-EDTA 버퍼(TE)에서 정제된 hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan 카세트의 농도를 50 ng/μL로 조정한다.
   4. hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan 카세트를 CH211-172N16-iTol2A로 온난화 외.¹⁸에 설명한 바와 같이 전기포이션에 의해 도입하고 LB agar 플레이트에서 암피실린 및 가나마이신 내성 변혁제를 선택한다. HSp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan 카세트를 운반하는 CH211-172N16-iTol2A는 mnr2b-hs:opTDP-43h로 지정됩니다.
   5. bac 정화 키트를 사용하여 mnr2b-hs:opTDP-43h를 정화하고 페놀/클로로폼 추출 후 TE에서 250 ng/μL에서 용해합니다.
3. mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z 건설
   1. opTDP 대신 N-종산 (EGFP-TDP-43z)에서 향상된 녹색 형광 단백질 (EGFP)으로 태그된 제브라피시 야생 형 타드bp를 운반하는 또 다른 플라스미드를 구성하십시오. 43h하지만 그렇지 않으면 hsp70l-opTDP-43h-폴리아-칸 분과 동일합니다(hsp70l-EGFP-TDP-43z-폴리아-칸)¹⁴. EGFP-TDP-43z를 opTDP-43h의 광 자극을 위한 내부 제어로 사용합니다.
   2. 1.2.1-1.2.5에 기재된 바와 같이 mnr2b 궤적에서 hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan 카세트를 수용하는 CH211-172N16-iTol2A를 구성한다. HSp70lp-EGFP-TDP-43z-폴리아-칸 카세트를 운반하는 CH211-172N16-iTol2A는 mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z로 지정된다.

2. 제브라피시의 Tol2 트랜스포슨 매개 BAC 트랜스게네스

1. 40mM KCl, 페놀 레드(10% v/v), mnr2b-hs:opTDP-43h DNA의 25 ng/μL, 25 ng/μ Tol2 트랜스포사스 ^mRNA19를 포함하는 사출 용액을 준비한다.
2. 1세포 단계에서 야생형 제브라피시 배아의 사이토솔에 1nL의 주입 용액(약 123 μm의 직경이 있는 액적)을 1세포 단계에서 야생형 제브라피시 배아의 사이토솔에 주입한다. 2-3일 후 수정(dpf)에서 형광 스테레오현미경으로 척추 운동 뉴런을 포함한 다양한 배아 조직에서 적색 형광 단백질(RFP)-양성 응집체의 형성을 위해 주입된 물고기를 선별한다. RFP 양성 어류를 성인기에 올립니다.
3. 2.1 및 2.2에 기술된 바와 같이 mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z DNA를 주입한다. 성인기에 EGFP 양성 물고기를 올립니다.
4. 몇 달 후, F1 자손을 얻기 위해 표준 2 L 짝짓기 케이지에 쌍에 성적으로 성숙한 주입 물고기와 야생 형 물고기를 넣어. 플랑드르-네오플루아르 5x/0.15 목표 렌즈를 장착한 피형성 현미경을 사용하여 척추 모터 컬럼의 RFP(opTDP-43h) 또는 EGFP(EGFP-TDP-43z) 형광에 대한 3dpf의 스크린 F1 물고기. 전형적으로, 한 명의 창업자 물고기는 10-20 주입된 물고기에서 확인됩니다(생식선 전송률은 5%-10%)입니다.
5. 여러 Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h]와 Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] 다른 창업자 물고기의 삽입물을 다른 창업자 물고기의 삽입을 다른 창업자 물고기의 강도를 분리하고 비교하되, opTDP-43h 또는 EGFP-TDP-43z 발현의 패턴은 어조로 인해 설립자 물고기마다 다를 수 있습니다.
6. 크로스 Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] 및 Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] 물고기 라인 Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:43h] Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:43h] Tg[mnr2b-hs:43h] Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:43h] Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:43h] Tg[mnr2b
7. E3 버퍼 30mL(5mM NaCl)가 들어 있는 플라스틱 접시에 생선을 올립니다. 0.17 mM KCl2, 0.33 mM _CaCl2, 0.33 mM _MgSO4, ^10-5% 메틸렌 블루) 및 멜라제닌증을 억제하기 위해 8-10 h포스트 수정(hpf)에서 N-phenylthiourea에서 0.003% (w/v) N-phenylthiourea를 추가합니다.
8. 30hpf 후 알루미늄 호일로 플라스틱 접시를 덮습니다.

3. 청색광 조명LED 준비

1. 태블릿/휴대폰에 설치된 관련 응용 프로그램을 사용하여 LED 패널을 켭니다. 분광기의 프로브를 6웰 접시의 빈 우물에 넣고 응용 프로그램을 통해 ~ 456 nm에서 피크파장에 LED 빛을 조정합니다. 광학 전력 계의 광학 센서를 빈 우물에 놓고 LED 라이트(~0.61mW/^cm2)의 전력을 조정합니다. LED 조명 설정을 저장할 수 있으며 응용 프로그램에서 검색할 수 있습니다.
2. 28°C에서 인큐베이터에 접시/LED 패널 설정을 소개합니다. 물고기의 화상 진찰이 48 hpf에서 시작하기 전에이 단계를 완료하십시오.

4. 광유전학 TDP-43을 표현하는 제브라피시 애벌레의 이미징

1. Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] 적어도 47hpf 전에 이중 형질형 물고기를 선택하십시오. 전술한 상술한 피피플루오렌스 현미경 설정을 이용하여 척추모터컬럼내의 RFP(opTDP-43h) 또는 EGFP(EGFP-TDP-43z) 형광에 기초하여.
2. Tg [mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] 이중 형질체 물고기.
3. 에틸 3-아미노벤조이트 메탄술포네이트 소금의 250 μg/mL을 함유한 1% 낮은 용융 온도 아가로즈를 42°C에서 예열한다.
4. 짧게 마취 Tg [mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg [mnr2b-hs:EGFP-TDP-43] E3 버퍼에서 48 hpf에서 이중 형질식 물고기트리케인의 동일한 농도를 함유한다.
5. 예열된 1% 낮은 녹는 온도아가로즈를 실온에서 유리 베이스 접시에 떨어뜨립니다. 유리 접시에 돔 모양의 아가로즈 드롭의 직경은 8-10mm입니다.
6. 파스퇴르 파이펫을 사용하여 마취된 생선을 유리 베이스 접시에 녹는 낮은 온도에 추가한 다음 몇 번 파이펫팅하여 섞습니다. 물고기와 함께 아가로즈에 추가된 E3 버퍼의 양을 최소화합니다.
7. 척수가 적절한 수평 위치에 있는지 확인하기 위해 아가로즈 (일반적으로 ~ 1 분)의 고화 시 주사기 바늘을 사용하여 측면에 물고기를 유지합니다. 고화 후, 돔 모양의 아가로즈 장착 물고기에 E3 버퍼 몇 방울을 넣습니다.
8. 수분 조리개 1.00을 장착한 공초점 현미경으로 스캔하여 척수의 직렬 공초점 z 단면을 획득하고, 픽셀당 4.0 μs(픽셀당 12비트), 목표용 슬라이스당 1.0 μm의 스텝 크기, 배설/배기가스 의 조합 채널 1) EGFP 및 채널 2용 473/510 nm) mRFP1용 559/583 nm.
   참고: 물고기의 복부 측에 있는 클로카는 관심 영역(ROI)에 참고 자료로 포함되며, 이는 시간 지점에서 척추 세그먼트(레벨 16-17)를 식별하고 비교하는 데 도움이 됩니다.
9. 이미징이 완료되자마자 주사기 바늘로 아가로즈를 조심스럽게 부수어 아가로즈에서 물고기를 제거하십시오. 아가로즈가 <30분 동안 포함되는 것은 물고기의 생존가능성에 영향을 미치지 않지만, 물고기가 아가로즈에 내장되는 시간을 가능한 한 짧게 유지한다.

5. 푸른 발광 다이오드 (LED) 빛의 필드 조명에 의해 opTDP-43h 표현 물고기의 빛 자극

1. 7.5mL의 E3 버퍼를 우물에 넣고 이미지된 Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] 이중 트랜스제닉 어류를 웰에 넣습니다. 접시와 LED 패널을 스페이서와 5mm 간격으로 유지하여 LED 패널에 6웰 접시를 놓습니다(예: 5개의 슬라이드 안경이 쌓여 있음).
2. 파란색 LED 표시등을 켭니다. Tg [mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg [mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] 이중 형질식 생선을 알루미늄 호일로 덮인 별도의 6웰 접시에 보관하십시오(즉, 어두운 ^{조건에서).}
3. 조명 후(예: 도 3에서 72hpf에서 24시간 동안) 4.3-4.9단계를 반복하여 조명된 물고기의 척수를 이미지화한다.

6. 척추 운동 뉴런에서 광유전학 TDP-43의 세포질 재배치 의 시각화

1. 이미지 파일을 이미지 파일 인 ImageJ/^Fiji21 (버전: 2.1.0/1.53c)에서 열어 NIH 이미지에서 개발한 오픈 소스 Java 이미지 프로세싱 프로그램으로 https://imagej.net/Fiji/Downloads 다운로드할 수 있습니다.
2. Z 스크롤 모음을 사용하여 초점 평면을 통과합니다. 이미지 | 클릭하여 여러 조각의 최대 강도 투영을 만듭니다 . 스택 | Z 프로젝트 | 최대 강도 및 설정 시작 슬라이스 및 척추 모터 컬럼의 중간 세그먼트를 커버 슬라이스를 중지합니다.
3. 이미지 | 클릭하여 멀티채널 이미지를 두 개의 단일 채널 이미지로 분할 합니다. 색상 | 분할 채널.
4. EGFP-TDP-43z 신호를 향상시켜 이미지를 클릭하여 세포질 EGFP-TDP-43z가 명확하게 표시되도록 | | 조정 밝기/대비 및 최소 조정
5. 분석 | 클릭하여 ROI 관리자를 엽니 다. 도구 | ROI 매니저. 세포 체의 상대적 위치를 기준으로 48 hpf 및 72 hpf의 두 이미지에서 식별 가능한 세포를 찾습니다. Freehand 선택을 사용하여 EGFP-TDP-43z 신호에 의해 시각화된 단일 척추 운동 뉴런의 세포 몸의 윤곽을 요약한 다음 ROI 관리자에서 [t] 추가를 클릭하여 ROI를 설정합니다.
6. 직선을 사용하여 직선을 그리고 | 분석을 클릭하여 소마의 주요 축을 설정합니다. EGFP-TDP-43z(C1) 및 opTDP-43h(C2) 이미지에 대한 플롯 프로파일은 48 및 72hpf에서.
7. 각 EGFP-TDP-43z 및 opTDP-43h 신호에 대해 값을 가장 큰 값으로 나누어 플롯 프로파일을 정규화합니다. x와 y가 통계 소프트웨어에서 XY 그래프를 사용하여 각각 소마 및 상대 형광 강도의 주요 축을 나타내는 x-y 좌표로 정규화된 값을 플롯합니다.

7. ImageJ/Fiji를 이용한 opTDP-43h 및 EGFP-TDP-43z 신호 간의 비율 비교

1. ImageJ/Fiji에서 이미지 파일을 열고 6.1-6.5에서와 같이 EGFP-TDP-43z의 최대 강도 프로젝션 이미지를 사용하여 단일 mnr2b 양성 셀에 대한 ROI를 설정합니다. 배경 신호(배경 ROI)를 나타내기 위해 복부 척수(예: 노토코드) 외부에 ROI를 추가합니다.
2. 각 EGFP-TDP-43z 및 opTDP-43 이미지에 대해 이미지를 클릭하여 여러 슬라이스의 투영을 | 스택 | Z 프로젝트 | 중간 슬라이스를 합산 하고 중간 척추 모터 컬럼을 덮는 슬라이스 를 시작하고 중지합니다.
3. 최대 강도 프로젝션 이미지로 만든 ROI 관리자를 엽니다. EGFP-TDP-43z의 이미지 창을 선택한 다음 ROI 관리자에서 모두 표시 를 클릭하여 합계 슬라이스 이미지에 ROI를 표시합니다. ROI 관리자의 측정 값을 클릭하여 각 ROI에 대한 평균 값을 얻습니다.
4. 7.3에서 제공되는 동일한 절차에 따라 opTDP-43h의 평균 값을 획득합니다.
5. 각 ROI에 대해, 배경 ROI에 대한 평균을 빼낸 후, EGFP-TDP-43z에 대한 빼기 평균으로 opTDP-43h에 대한 빼기 된 평균을 분할하여 비율 값을 얻습니다. 비율 측정 값은 서로 다른 시간 점 간에 비교하고 프리즘 소프트웨어의 열 그래프를 사용하여 표시할 수 있습니다.

결과

제브라피시 애벌레의 척추 운동 뉴런에 있는 광유전학 및 비 광유전학 TDP-43 단백질의 살아있는 화상 진찰
제브라피시의 척추 운동 뉴런에서 TDP-43 상 전이를 유도하기 위해, N-및 C-테르미니에서 mRFP1 및 CRY2olig22로 태그되는 인간 TDP-43h는 각각 opTDP-43h14(도 1A)로 구성및 지정되었다. opTDP-43h 유전...

토론

mnr2b-BAC-매개 발현은 제브라피시의 opTDP-43h 및 EGFP-TDP-43z의 발현을 척추 운동 뉴런에서 TDP-43 위상 전이의 라이브 이미징을 위한 독특한 기회를 제공한다. 제브라피시 애벌레의 신체 조직의 광학적 투명성은 opTDP-43h의 간단하고 비침습적 광유전학적 자극을 허용합니다. 시간이 지남에 따라 단일 척추 운동 뉴런 사이의 비교는 opTDP-43h의 빛 의존 올리고머화가 ALS 병리학을 연상시키는 세포질 클?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Confocal microscope	Olympus	FV1200
Epifluorescence microscope	ZEISS	Axioimager Z1
Fluorescence stereomicroscope	Leica	MZ16FA
Glass base dish	IWAKI	3910-035
Incubator	MEE	CN-25C
LED panel	Nanoleaf Limited	Nanoleaf AURORA smarter kit
Mupid-2plus	TAKARA	AD110
NucleoBond BAC100	MACHEREY-NAGEL	740579
NuSieve GTG Agarose	LONZA	50181
Objective lens	Olympus	XLUMPlanFL N 20×/1.00
Objective lens	ZEISS	Plan-Neofluar 5x/0.15
Optical power meter	HIOKI	3664
Optical sensor	HIOKI	9742-10
Phenol red solution 0.5%	Merck	P0290-100ML
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase	TAKARA	R050A
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
Six-well dish	FALCON	353046
Spectrometer probe BLUE-Wave	StellerNet Inc.	VIS-50
Syringe needle	TERUMO	NN-2725R
TaKaRa Ex Taq	TAKARA	RR001A
Tricane	Sigma-Aldrich	A5040
Zebrafish BAC clone CH211-172N16	BACPAC Genomics	CH211-172N16