Transición de fase optogenética de TDP-43 en neuronas motoras espinales de larvas de pez cebra

Resumen

Describimos un protocolo para inducir la transición de fase de la proteína 43 de unión al ADN TAR (TDP-43) por la luz en las neuronas motoras espinales utilizando el pez cebra como modelo.

Resumen

La agregación anormal de proteínas y la vulnerabilidad neuronal selectiva son dos características principales de las enfermedades neurodegenerativas. Las relaciones causales entre estas características pueden interrogarse mediante el control de la transición de fase de una proteína asociada a la enfermedad en un tipo de célula vulnerable, aunque este enfoque experimental ha sido limitado hasta ahora. Aquí, describimos un protocolo para inducir la transición de fase de la proteína de unión al ARN / ADN TDP-43 en las neuronas motoras espinales de larvas de pez cebra para modelar la agregación citoplasmática de TDP-43 que ocurre en las neuronas motoras degeneradas en la esclerosis lateral amiotrófica (ELA). Describimos un método genético basado en el cromosoma artificial bacteriano (BAC) para administrar una variante optogenética de TDP-43 selectivamente a las neuronas motoras espinales del pez cebra. La alta translucidez de las larvas de pez cebra permite la transición de fase del TDP-43 optogenético en las neuronas motoras espinales mediante una simple iluminación externa utilizando un diodo emisor de luz (LED) contra peces sin restricciones. También presentamos un flujo de trabajo básico de imágenes en vivo de las neuronas motoras espinales del pez cebra y análisis de imágenes con el software Fiji / ImageJ disponible gratuitamente para caracterizar las respuestas del TDP-43 optogenético a la iluminación de la luz. Este protocolo permite la caracterización de la transición de fase de TDP-43 y la formación de agregados en un entorno celular vulnerable a la ELA, lo que debería facilitar la investigación de sus consecuencias celulares y de comportamiento.

Introducción

Los gránulos de ribonucleoproteína (RNP) controlan una miríada de actividades celulares en el núcleo y el citoplasma mediante el ensamblaje de particiones sin membrana a través de la separación de fase líquido-líquido (LLPS), un fenómeno en el que un fluido homogéneo se demezcla en dos fases líquidas ^distintas1,2. El LLPS desregulado de las proteínas de unión al ARN que normalmente funcionan como componentes de gránulos RNP promueve la transición de fase anormal, lo que lleva a la agregación de proteínas. Este proceso se ha implicado en enfermedades del neurodesarrollo y neurodegenerativas3,4,5. La evaluación precisa de una relación causal entre el LLPS aberrante de las proteínas de unión al ARN y la patogénesis de la enfermedad es crucial para determinar si y cómo el LLPS puede ser explotado como un objetivo terapéutico eficaz. El LLPS de proteínas de unión al ARN es relativamente fácil de estudiar in vitro y en modelos unicelulares, pero es difícil en organismos multicelulares, especialmente en vertebrados. Un requisito crítico para analizar dicho LLPS en células individuales dentro de un entorno tisular es expresar de manera estable una sonda para la obtención de imágenes y la manipulación de LLPS en un tipo de interés celular vulnerable a la enfermedad.

La esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es un trastorno neurológico finalmente mortal en el que las neuronas motoras del cerebro y la médula espinal se pierden selectiva y progresivamente debido a la degeneración. Hasta la fecha, las mutaciones en más de 25 genes se han asociado con la forma hereditaria (o familiar) de ELA, que representa el 5%-10% del total de casos de ELA, y algunos de estos genes causantes de ELA codifican proteínas de unión al ARN que consisten en RNP, como hnRNPA1, TDP-43 y ^FUS6,7. Además, la forma esporádica de ELA, que representa el 90%-95% del total de casos de ELA, se caracteriza por la agregación citoplasmática de TDP-43 depositada en neuronas motoras degeneradas. Una característica importante de estas proteínas de unión al ARN asociadas a la ELA son sus regiones intrínsecamente desordenadas (IDR) o dominios de baja complejidad que carecen de estructuras tridimensionales ordenadas y median interacciones proteína-proteína débiles con muchas proteínas diferentes que impulsan ^LLPS7,8. El hecho de que las mutaciones causantes de ELA ocurran a menudo en los IDR ha llevado a la idea de que el LLPS aberrante y la transición de fase de estas proteínas relacionadas con la ELA pueden ser la base de la patogénesis de la ^ELA9,10.

Recientemente, se desarrolló el método optoDroplet, una técnica optogenética basada en Cryptochrome 2 que permite la modulación de las interacciones proteína-proteína por la luz, para inducir la transición de fase de proteínas con ^IDRs11. A medida que esta técnica se ha extendido con éxito a TDP-43, se han comenzado a descubrir los mecanismos subyacentes a la transición de fase patológica de TDP-43 y su citotoxicidad asociada12,13,14,15. En este protocolo, esbozamos un método genético para administrar un TDP-43 optogenético a tipos de células vulnerables a la ELA, a saber, las neuronas motoras espinales en el pez cebra utilizando el BAC para el gen mnr2b / mnx2b que codifica una proteína homeodominio para la especificación de la neurona ^motora16,17. La alta translucidez de las larvas de pez cebra permite una estimulación lumínica simple y no invasiva del TDP-43 optogenético que desencadena su transición de fase en las neuronas motoras espinales. También presentamos un flujo de trabajo básico para la obtención de imágenes en vivo de las neuronas motoras espinales del pez cebra y el análisis de imágenes utilizando el software Fiji / ImageJ disponible gratuitamente para caracterizar las respuestas del TDP-43 optogenético a la estimulación de la luz. Estos métodos permiten una investigación de la transición de fase de TDP-43 en un entorno celular vulnerable a la ELA y deberían ayudar a explorar sus consecuencias patológicas a nivel celular y conductual.

Protocolo

Todo el trabajo con peces se llevó a cabo de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (número de identificación de aprobación 24-2) del Instituto Nacional de Genética (Japón), que tiene un Aseguramiento de Bienestar Animal en el archivo (número de garantía A5561-01) en la Oficina de Bienestar de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud (NIH, Estados Unidos).

1. Construcción de BAC para la expresión del gen optogenético TDP-43 a partir del promotor mnr2b

1. Preparación bac
   1. Compre un clon de BAC de pez cebra que contenga el locus mnr2b de pez cebra (CH211-172N16, BACPAC Genomics). Purificar el ADN BAC de un cultivo de LB de 5 ml durante la noche de DH10B Escherichia coli (E. coli) que alberga CH211-172N16 como se describe en Warming et ^al.18.
   2. Transformar CH211-172N16 en células SW102 E. coli por electroporación, como se describe en Warming et ^al.18.
      NOTA: La purificación del ADN BAC de la E. coli el mismo día de la electroporación suele dar una mayor tasa de éxito de transformación ^bac18. De lo contrario, el ADN BAC purificado se mantiene a -20 °C hasta su uso.
   3. Introducir el casete iTol2-amp para la transgénesis BAC mediada por transposón Tol219 en la columna vertebral de CH211-172N16 por electroporación, como se describe en Asakawa et ^al.20.
      1. Hacer un stock de glicerol de los clones de células de E. coli portadores de CH211-172N16 con la integración de cassette iTol2-amp (CH211-172N16-iTol2A) después de confirmar la integración homóloga mediada por recombinación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Ex Taq) utilizando el par de cebadores Tol2-L-out (5'-AAA GTA TCT GGC TAG AAT CTT ACT TGA-3') y pTARBAC-13371r (5'-TAG CGG CCG CAA ATT TAT TA-3') y las siguientes condiciones: un paso de desnaturalización a 98 °C durante 1 min, seguido de 25 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 10 s, recocido por imprimación a 55 °C durante 15 s y extensión del cebador a 72 °C durante 1 min, amplificando un producto de PCR de 354 pares de bases (pb).
2. mnr2b-hs:opTDP-43h construcción
   1. Construir un plásmido portador del casete de expresión para el TDP-43/TARDBP humano de tipo salvaje (TDP-43h) que esté marcado con mRFP1 y CRY2olig en el N- y C-termini, respectivamente (en adelante, opTDP-43h)¹⁴.
      NOTA: El fragmento opTDP-43h debe estar flanqueado con la secuencia de señales promotora del gen hsp70l del pez cebra (650 pb) y poliadenilación (poliA), seguida de un gen de resistencia a la kanamicina (hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan)¹⁴.
   2. Amplificar el casete hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan con cebadores que annean hsp70l y Kan y contener secuencias de 45 pb de los codones aguas arriba y aguas abajo de los codones iniciadores del gen mnr2b por PCR (GXL DNA Polymerase) utilizando el par de cebadores mnr2b-hspGFF-Forward (5'-tat cag cgc aat tac ctg caa ctc taa aca caa caa aag tgt tgc aGA ATT CAC TGG AGG CTT CCA GAA C-3') y Km-r (5'-ggt tct tct tct tct gct aaa agg gcg tcg atc ctg aag ttc ttt gac ttt tcc atC AAT TCA GAA GAA CTC GTC AAG AA-3') con las siguientes condiciones: un paso de desnaturalización a 98 °C durante 1 min, seguido de 30 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 10 s, recocido por imprimación a 55 °C durante 15 s y extensión de imprimación a 68 °C durante 30 s, amplificando un producto de PCR de ~5.7 bp.
   3. Separe los productos de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa (100 V) y purifique la banda de ADN hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan con una columna de ADN. Ajuste la concentración del casete purificado hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan a 50 ng/μL en tampón Tris-EDTA (TE) que contiene 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) y 1 mM EDTA.
   4. Introducir el cassette hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan en CH211-172N16-iTol2A por electroporación como se describe en Warming et ^al.18 y seleccionar transformadores resistentes a la ampicilina y la kanamicina en placas de agar LB. CH211-172N16-iTol2A que transporta el casete hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan se designa como mnr2b-hs:opTDP-43h.
   5. Purifique mnr2b-hs:opTDP-43h utilizando un kit de purificación BAC y disuelva a 250 ng/μL en TE después de la extracción de fenol/cloroformo.
3. mnr2b-hs: construcción EGFP-TDP-43z
   1. Construir otro plásmido portador del pez cebra de tipo salvaje tardbp que está marcado con proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) en su N-terminal (EGFP-TDP-43z) en lugar de opTDP-43h pero que por lo demás es idéntico al hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan constructo (hsp70l-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan)¹⁴. Utilice EGFP-TDP-43z como control interno para la estimulación lumínica de opTDP-43h.
   2. Construya CH211-172N16-iTol2A que alberga el casete hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan en el locus mnr2b como se describe en 1.2.1-1.2.5. CH211-172N16-iTol2A que lleva el casete hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan está designado como mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z.

2. Transgénesis BAC mediada por transposón Tol2 en pez cebra

1. Preparar la solución inyectable que contenga 40 mM KCl, rojo fenol (10% v/v), 25 ng/μL del ADN mnr2b-hs:opTDP-43h y 25 ng/μL Tol2 transposasa ^mRNA19.
2. Inyecte 1 nL de la solución inyectable (una gota con un diámetro de aproximadamente 123 μm calibrada en aceite mineral) en el citosol de embriones de pez cebra de tipo salvaje en la etapa de una célula. Examinar a los peces inyectados para detectar la formación de agregados positivos para proteínas fluorescentes rojas (RFP) en varios tejidos embrionarios, incluidas las neuronas motoras espinales, bajo un estereomicroscopio de fluorescencia a los 2-3 días después de la fertilización (dpf). Elevar los peces positivos para RFP a la edad adulta.
3. Inyecte el ADN mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z como se describe en 2.1 y 2.2. Elevar los peces EGFP positivos a la edad adulta.
4. Después de unos meses, coloque peces inyectados sexualmente maduros y peces de tipo silvestre en parejas en jaulas de apareamiento estándar de 2 L para obtener descendencia F1. Cribe peces F1 a 3 dpf para la fluorescencia RFP (opTDP-43h) o EGFP (EGFP-TDP-43z) en la columna vertebral motora utilizando un microscopio de epifluorescencia equipado con una lente de objetivo Plan-Neofluar 5x / 0.15. Por lo general, se identifica un pez fundador a partir de 10-20 peces inyectados (la tasa de transmisión de la línea germinal es del 5%-10%).
5. Aislar y comparar múltiples insertos Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] y Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] de diferentes peces fundadores, ya que la intensidad, pero no el patrón, de la expresión de opTDP-43h o EGFP-TDP-43z puede variar entre los peces fundadores debido a los efectos de posición cromosómica.
6. Cruce líneas de peces Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] y Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] para obtener crías que contengan Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] peces de doble transgenuro en proporción mendeliana.
7. Críe el pescado en un plato de plástico que contenga 30 mL de tampón E3 (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM _CaCl2, 0.33 mM MgSO4, ^10-5% Azul de Metileno) y agregue 0.003% (p/ v) N-feniltiorea a las 8-10 h después de la fertilización (hpf) para inhibir la melanogénesis.
8. Cubra el plato de plástico con papel de aluminio después de 30 hpf.

3. Preparación de LED para iluminación de luz azul

1. Encienda un panel LED utilizando la aplicación asociada instalada en una tableta / teléfono. Coloque la sonda de un espectrómetro en un pozo vacío de un plato de 6 pocillos y ajuste la luz LED a la longitud de onda que alcanza un máximo de ~ 456 nm a través de la aplicación. Coloque el sensor óptico de un medidor de potencia óptica en el pozo vacío y ajuste la potencia de la luz LED (~ 0.61 mW / ^cm2). La configuración de la luz LED se puede guardar y se puede recuperar en la aplicación.
2. Introduzca el ajuste del plato/panel LED en la incubadora a 28 °C. Termine este paso antes de que la imagen de los peces comience a 48 hpf.

4. Imágenes de larvas de pez cebra que expresan TDP-43 optogenético

1. Seleccione peces Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] de doble transgénico al menos antes de 47 hpf, según la fluorescencia RFP (opTDP-43h) o EGFP (EGFP-TDP-43z) en la columna motora espinal utilizando la configuración del microscopio de epifluorescencia descrita anteriormente.
2. Decorionar el pez Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] de doble transgénico.
3. Precalentar al 1% la agarosa a baja temperatura de fusión que contenga 250 μg/ml de sal de metanosulfonato de etilo 3-aminobenzoato a 42 °C.
4. Anestesiar brevemente Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43] peces de doble transgénico a 48 hpf en tampón E3 que contiene la misma concentración de tricano.
5. Coloque una gota de la agarosa precalentada a baja temperatura de fusión al 1% en el plato base de vidrio a temperatura ambiente. El diámetro de la gota de agarosa en forma de cúpula en el plato de vidrio es de 8-10 mm.
6. Usando una pipeta Pasteur, agregue el pescado anestesiado a la agarosa de baja temperatura de fusión en el plato base de vidrio, y luego mezcle pipeteando varias veces. Minimice la cantidad del tampón E3 agregado a la agarosa junto con los peces.
7. Mantenga el pez de lado usando una aguja de jeringa durante la solidificación de la agarosa (generalmente ~ 1 min) para asegurarse de que la médula espinal esté en una posición horizontal adecuada. Después de la solidificación, coloque un par de gotas de tampón E3 en el pez montado en agarosa en forma de cúpula.
8. Adquiera secciones z confocales en serie de la médula espinal mediante escaneo con un microscopio confocal equipado con una lente de objetivo de inmersión en agua 20x con la apertura numérica 1.00, utilizando una velocidad de escaneo de 4.0 μs por píxel (12 bits por píxel), un tamaño de paso de 1.0 μm por rebanada para el objetivo y una combinación de longitudes de onda de excitación / emisión: Canal 1) 473/510 nm para EGFP y Canal 2) 559/583 nm para mRFP1.
   NOTA: La cloaca en el lado ventral del pez se incluye en las regiones de interés (ROI) como referencia, lo que ayuda a identificar y comparar los segmentos espinales (niveles 16-17) a través de los puntos de tiempo.
9. Retire el pescado de la agarosa agrietando cuidadosamente la agarosa con una aguja de jeringa tan pronto como se complete la imagen. Mantenga la cantidad de tiempo que el pez está incrustado en la agarosa lo más corto posible, aunque la incrustación de agarosa durante <30 min no afecta la viabilidad del pez.

5. Estimulación lumínica de peces que expresan opTDP-43h mediante la iluminación de campo de una luz de diodo emisor de luz azul (LED)

1. Agregue 7.5 mL de tampón E3 al pozo y coloque el pez Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] doble transgénico en el pozo. Coloque el plato de seis pocillos en el panel LED manteniendo el plato y el panel LED separados 5 mm con un espaciador (por ejemplo, con cinco vasos deslizantes apilados).
2. Encienda la luz LED azul. Mantenga algunos de los peces Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] doble transgénico en un plato separado de seis pocillos cubierto con papel de aluminio cuando sea necesario un pescado de control no iluminado (es decir, en condiciones de oscuridad)¹⁴.
3. Después de la iluminación (por ejemplo, durante 24 h a 72 hpf en la Figura 3), obtenga una imagen de la médula espinal del pez iluminado repitiendo los pasos 4.3 - 4.9.

6. Visualización de la reubicación citoplasmática de TDP-43 optogenético en las neuronas motoras espinales

1. Abra el archivo de imagen en ImageJ/^Fiji21 (Versión: 2.1.0/1.53c), un programa de procesamiento de imágenes Java de código abierto desarrollado por NIH Image, que se puede descargar desde https://imagej.net/Fiji/Downloads.
2. Utilice la barra de desplazamiento Z para desplazarse por los planos focales. Cree una proyección de máxima intensidad de varios sectores haciendo clic en Imagen | Pilas | | del proyecto Z Intensidad máxima y ajuste Corte de inicio y Corte de parada que cubren los hemisegmentos de la columna vertebral motora.
3. Divida la imagen multicanal en dos imágenes de un solo canal haciendo clic en Imagen | | de color Canales divididos.
4. Mejore la señal EGFP-TDP-43z para garantizar que el EGFP-TDP-43z citoplasmático sea visible claramente haciendo clic en Imagen | Ajustar | Brillo/Contraste y ajuste mínimo
5. Abra el administrador de ROI haciendo clic en Analizar | Herramientas | Gestor de ROI. Encuentre las células que son identificables en ambas imágenes a 48 hpf y 72 hpf, según las posiciones relativas de los cuerpos celulares. Establezca el ROI delineando los contornos de los cuerpos celulares de las neuronas motoras espinales individuales visualizadas por la señal EGFP-TDP-43z utilizando selecciones a mano alzada y, a continuación, haga clic en Agregar[t] en el administrador de ROI.
6. Establezca un eje principal del soma dibujando una línea recta usando Recto y haciendo clic en Analizar | Perfil de trazado para imágenes EGFP-TDP-43z (C1) y opTDP-43h (C2) a 48 y 72 hpf.
7. Normalice el perfil de trazado dividiendo los valores por el valor máximo para cada señal EGFP-TDP-43z y opTDP-43h. Trazar los valores normalizados con coordenadas x-y, donde x e y representan el eje mayor del soma y las intensidades fluorescentes relativas, respectivamente, utilizando el gráfico XY en un software estadístico.

7. Comparación ratiométrica entre señales opTDP-43h y EGFP-TDP-43z utilizando ImageJ/Fiji

1. Abra el archivo de imagen en ImageJ/Fiji y establezca ROI para celdas mnr2b positivas individuales utilizando una imagen de proyección de máxima intensidad de EGFP-TDP-43z como en 6.1-6.5. Agregue un ROI fuera de la médula espinal ventral (por ejemplo, notocorda) para representar la señal de fondo (ROI de fondo).
2. Para cada imagen EGFP-TDP-43z y opTDP-43, cree una proyección de varios sectores haciendo clic en Imagen | Pilas | | del proyecto Z Suma sectores y establece Sectores de inicio y Sector de parada que cubren la columna del motor hemispinal.
3. Abra el gestor de ROI creado con la imagen de proyección de máxima intensidad. Para mostrar el ROI en la imagen Suma de sectores, seleccione la ventana de imagen de EGFP-TDP-43z y, a continuación, haga clic en Mostrar todo en el administrador de ROI. Haga clic en Medir en el gestor de ROI para obtener los valores medios de cada ROI.
4. Adquirir valores medios para opTDP-43h siguiendo el mismo procedimiento previsto en 7.3.
5. Para cada ROI, después de restar la media para el ROI de fondo, divida la media restada para opTDP-43h por la media restada para EGFP-TDP-43z para obtener el valor ratiométrico. Los valores ratiométricos se pueden comparar entre diferentes puntos de tiempo y presentarse utilizando el gráfico de columnas en el software Prism.

Resultados

Imágenes en vivo de proteínas TDP-43 optogenéticas y no optogenéticas en las neuronas motoras espinales mnr2b + de larvas de pez cebra
Para inducir la transición de fase de TDP-43 en las neuronas motoras espinales en el pez cebra, se construyó un TDP-43h humano que está marcado con mRFP1 y ^CRY2olig22 en el N- y C-termini, respectivamente, y designado como opTDP-43h14 (Figura 1A).^<...

Discusión

La expresión mediada por mnr2b-BAC de opTDP-43h y EGFP-TDP-43z en pez cebra proporciona una oportunidad única para la obtención de imágenes en vivo de la transición de fase de TDP-43 en las neuronas motoras espinales. La transparencia óptica de los tejidos corporales de las larvas de pez cebra permite la estimulación optogenética simple y no invasiva de opTDP-43h. Las comparaciones entre neuronas motoras espinales individuales a lo largo del tiempo demostraron que la oligomerización dependiente de la lu...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Confocal microscope	Olympus	FV1200
Epifluorescence microscope	ZEISS	Axioimager Z1
Fluorescence stereomicroscope	Leica	MZ16FA
Glass base dish	IWAKI	3910-035
Incubator	MEE	CN-25C
LED panel	Nanoleaf Limited	Nanoleaf AURORA smarter kit
Mupid-2plus	TAKARA	AD110
NucleoBond BAC100	MACHEREY-NAGEL	740579
NuSieve GTG Agarose	LONZA	50181
Objective lens	Olympus	XLUMPlanFL N 20×/1.00
Objective lens	ZEISS	Plan-Neofluar 5x/0.15
Optical power meter	HIOKI	3664
Optical sensor	HIOKI	9742-10
Phenol red solution 0.5%	Merck	P0290-100ML
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase	TAKARA	R050A
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
Six-well dish	FALCON	353046
Spectrometer probe BLUE-Wave	StellerNet Inc.	VIS-50
Syringe needle	TERUMO	NN-2725R
TaKaRa Ex Taq	TAKARA	RR001A
Tricane	Sigma-Aldrich	A5040
Zebrafish BAC clone CH211-172N16	BACPAC Genomics	CH211-172N16