Zebra Balığı Larvalarının Spinal Motor Nöronlarında TDP-43'ün Optogenetik Faz Geçişi

Özet

TAR DNA bağlayıcı protein 43'ün (TDP-43) zebra balıklarını model olarak kullanarak spinal motor nöronlarda ışıkla faz geçişini teşvik eden bir protokol açıklıyoruz.

Özet

Anormal protein toplama ve seçici nöronal kırılganlık nörodejeneratif hastalıkların iki önemli özelliğidir. Bu deneysel yaklaşım şimdiye kadar sınırlı olmasına rağmen, bu özellikler arasındaki nedensel ilişkiler, hastalıkla ilişkili bir proteinin savunmasız bir hücre tipinde faz geçişini kontrol ederek sorgulanabilir. Burada, amyotrofik lateral sklerozda (ALS) dejenere motor nöronlarda meydana gelen TDP-43'ün sitoplazmik toplamasının modellenmesi için zebra balığı larvalarının spinal motor nöronlarında RNA/DNA bağlayıcı protein TDP-43'ün faz geçişini teşvik eden bir protokol açıklıyoruz. Zebra balıklarının spinal motor nöronlarına seçici olarak optogenetik bir TDP-43 varyantı sunmak için bakteriyel yapay kromozom (BAC) tabanlı bir genetik yöntem tarif ediyoruz. Zebra balığı larvalarının yüksek yarı saydamlığı, spinal motor nöronlarındaki optogenetik TDP-43'ün, sınırsız balıklara karşı ışık yayan bir diyot (LED) kullanarak basit bir dış aydınlatma ile faz geçişine izin verir. Ayrıca, optogenetik TDP-43'ün ışık aydınlatmasına verdiği tepkileri karakterize etmek için zebra balığı spinal motor nöronlarının canlı görüntüleme ve görüntü analizinin temel bir iş akışını serbestçe kullanılabilen Fiji /ImageJ yazılımı ile sunuyoruz. Bu protokol, ALS'ye karşı savunmasız bir hücresel ortamda TDP-43 faz geçişinin ve agrega oluşumunun karakterize edilmesine olanak tanır ve bu da hücresel ve davranışsal sonuçlarının araştırılmasını kolaylaştırmalıdır.

Giriş

Ribonikleoprotein (RNP) granülleri, homojen bir sıvının iki ayrı sıvı fazına dönüştüğü bir fenomen olan sıvı-sıvı faz ayırma (LLPS) yoluyla membransız bölümleri birleştirerek çekirdek ve sitoplazmadaki sayısız hücresel aktiviteyi kontrol ^eder1,2. Normalde RNP granül bileşenleri olarak işlev görür rna bağlayıcı proteinlerin düzensiz LLPS'si anormal faz geçişini teşvik eder ve protein toplanmasına yol ederim. Bu süreç nörogelişimsel ve nörodejeneratif hastalıklara bulaşmıştır3,4,5. RNA bağlayıcı proteinlerin sapkın LLPS'si ile hastalık patogenezinin nedensel ilişkisinin kesin olarak değerlendirilmesi, LLPS'nin etkili bir terapötik hedef olarak kullanılıp kullanılmayacağını ve nasıl kullanılabileceğini belirlemek için çok önemlidir. RNA bağlayıcı proteinlerin LLPS'lerinin in vitro ve tek hücreli modellerde çalışması nispeten kolaydır, ancak özellikle omurgalılarda çok hücreli organizmalarda zordur. Bu tür LLPS'leri doku ortamındaki bireysel hücrelerde analiz etmek için kritik bir gereklilik, hastalık açısından savunmasız bir hücre türünde LLPS'nin görüntülenmesi ve manipülasyonu için bir probun kesin olarak ifade etmesidir.

Amyotrofik lateral skleroz (ALS), beyin ve omuriliğin motor nöronlarının dejenerasyon nedeniyle seçici ve aşamalı olarak kaybolduğu sonuçta ölümcül bir nörolojik bozukluktur. Bugüne kadar, 25'ten fazla gendeki mutasyonlar, toplam ALS vakalarının% 5-10'unu oluşturan ALS'nin kalıtsal (veya ailesel) formu ile ilişkilendirilmiştir ve bu ALS nedenli genlerden bazıları hnRNPA1, TDP-43 ve ^FUS6,7 gibi RNP'lerden oluşan RNA bağlayıcı proteinleri kodlamaktadır. Ayrıca, toplam ALS vakalarının% 90-95'ini oluşturan ALS'nin sporadik formu, dejenere motor nöronlarda biriken TDP-43'ün sitoplazmik toplanması ile karakterizedir. Bu ALS ilişkili RNA bağlayıcı proteinlerin önemli bir özelliği, sıralı üç boyutlu yapılardan yoksun ve LLPS7,8'i yönlendiren birçok farklı proteinle zayıf protein-protein etkileşimlerine aracılık eden özünde düzensiz bölgeleri (IDR'ler) veya düşük karmaşıklık alan adlarıdır. ALS'ye neden olan mutasyonların genellikle IDR'lerde meydana gelmesi, ALS ile ilişkili bu proteinlerin anormal LLPS ve faz geçişinin ALS patogenezinin ^altında yatan olabileceği fikrine yol açmıştır9,10.

Son zamanlarda, protein-protein etkileşimlerinin ışıkla modülasyonunu sağlayan Cryptochrome 2 tabanlı bir optogenetik teknik olan optoDroplet yöntemi, proteinlerin ^IDRs11 ile faz geçişini teşvik etmek için geliştirilmiştir. Bu teknik başarıyla TDP-43'e genişletildikçe, TDP-43'ün patolojik faz geçişinin altında kalan mekanizmaları ve buna bağlı sitotoksikliğini ^ortaya çıkarmaya başlamıştır12,13,14,15. Bu protokolde, ALS'ye karşı savunmasız hücre tiplerine optogenetik bir TDP-43, yani motor nöron spesifikasyonu için bir homeodomain proteinini kodlayan mnr2b/mnx2b gen kodlaması için BAC kullanan zebra balıklarındaki spinal motor nöronları sunmak için genetik bir yöntem özetliyoruz16,17. Zebra balığı larvalarının yüksek yarı saydamlığı, omurilik motoru nöronlarında faz geçişini tetikleyen optogenetik TDP-43'ün basit, noninvaziv ışık stimülasyonuna izin verir. Ayrıca, optogenetik TDP-43'ün ışık stimülasyonuna verdiği tepkileri karakterize etmek için serbestçe kullanılabilen Fiji/ImageJ yazılımını kullanarak zebra balığı spinal motor nöronlarının canlı görüntülenmesi ve görüntü analizi için temel bir iş akışı sunuyoruz. Bu yöntemler, ALS'ye açık hücresel ortamda TDP-43 faz geçişinin araştırılmasına izin verir ve patolojik sonuçlarını hücresel ve davranışsal düzeyde keşfetmeye yardımcı olmalıdır.

Protokol

Tüm balık çalışmaları, Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvan Refahı Ofisi'nde (NIH, A5561-01 güvence numarası) bulunan Ulusal Genetik Enstitüsü'nün (Japonya) Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu (onay kimlik numarası 24-2) uyarınca gerçekleştirildi. ABD).

1. mnr2b promotöründen optogenetik TDP-43 geninin ekspresyasyonu için BAC'lerin yapımı

1. BAC hazırlığı
   1. Zebra balığı mnr2b locus (CH211-172N16, BACPAC Genomik) içeren bir zebra balığı BAC klonu satın alın. BAC DNA'sını, Isınma ve ark.18'de açıklandığı gibi CH211-172N16'yı barındıran DH10B Escherichia coli (E. coli) 5 mL gecelik LB kültüründen arındırın.
   2. CH211-172N16'yı, Warming ve ^ark.18'de açıklandığı gibi elektroporasyonla SW102 E. coli hücrelerine dönüştürün.
      NOT: Bac DNA'sının aynı elektroporasyon gününde E. coli'den arındırılması genellikle BAC dönüşümünün daha yüksek bir başarı oranı ^sağlar18. Aksi takdirde, saflaştırılmış BAC DNA'sı kullanıma kadar -20 °C'de tutulur.
   3. Tol2 transpozon aracılı BAC transgenesis19 için iTol2-amp kasetini, Asakawa ve ark.20'de açıklandığı gibi elektroporasyonla CH211-172N16'nın omurgasına sokun.
      1. E'nin gliserol stoğunu yap. polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) (Ex Taq) ile homolog rekombinasyon aracılı entegrasyonu onayladıktan sonra iTol2-amp kaset entegrasyonu (CH211-172N16-iTol2A) ile CH211-172N16 taşıyan coli hücre klonları astar çifti Tol2-L-out (5'-AAA GTA TCT GGC TAG AAT CTT ACT TGA-3') ve pTARBAC-13371r (5'-TAG CGG CCG CAA ATT TAT TA-3') ve aşağıdaki koşulları kullanarak: 1 dakika boyunca 98 °C'de bir denatürasyon adımı, ardından 10 s için 95 °C'de 25 denatürasyon döngüsü, 15 s için 55 °C'de astar tavlama ve 1 dakika için 72 °C'de astar uzatma, 354 baz çift (bp) PCR ürününü güçlendirin.
2. mnr2b-hs:opTDP-43h yapı
   1. Sırasıyla N ve C-termini'de mRFP1 ve CRY2olig ile etiketlenmiş insan vahşi tipi TDP-43/TARDBP (TDP-43h) için ifade kasetini taşıyan bir plazmid oluşturun (bundan sonra opTDP-43h)¹⁴.
      NOT: opTDP-43h parçası zebra balığı hsp70l gen promotör dizisi (650 bp) ve poliadenilasyon (polyA) sinyal dizisi ile kuşatılmalı ve ardından kanamycin direnç geni (hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan)¹⁴.
   2. Hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan kasetini hsp70l ve Kan'ı tavlayan astarlarla güçlendirin ve mnr2b geninin başlatıcı kodonlarının yukarı ve aşağı akışlarının 45 bp dizilerini astar çifti mnr2 kullanarak PCR (GXL DNA Polymerase) ile güçlendirinb-hspGFF-Forward (5'-tat cag cgc aat tac ctg caa ctc taa aca caa aag tgt tgc aGA ATT CAC TGG AGG CTT CCA GAA C-3') ve Km-r (5'-ggt tct tca tca tca aaa agg gcg tcg atc ctg aag ttc ttt gac ttt tcc atC AAT TCA GAA GAA CTC GTC AAG AA-3') aşağıdaki koşullarla: 1 dakika boyunca 98 °C'de bir denatürasyon adımı, ardından 10 s için 95 °C'de 30 denatürasyon döngüsü, 15 s için 55 °C'de astar tavlama ve 30 sn için 68 °C'de astar uzatma, ~5.7 bp'lik bir PCR ürününün yükseltülme.
   3. PCR ürünlerini agarose jel elektroforezi (100 V) ile ayırın ve hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan DNA bandını bir DNA sütunu ile arındırın. Saflaştırılmış hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan kasetinin konsantrasyonu, 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) ve 1 mM EDTA içeren Tris-EDTA tamponunda (TE) 50 ng/μL'ye ayarlayın.
   4. Hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan kasetini, Isınma ve ark.18'de açıklandığı gibi elektroporasyonla CH211-172N16-iTol2A'ya sokun ve LB agar plakalarında ampisiline ve kanamsin dirençli transformantları seçin. Hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan kasetini taşıyan CH211-172N16-iTol2A, mnr2b-hs:opTDP-43h olarak belirlenmiştir.
   5. Mnr2b-hs:opTDP-43h'yi bir BAC arıtma kiti kullanarak arındırın ve fenol/kloroform ekstraksiyonu sonrası TE'de 250 ng/μL'de çözün.
3. mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z yapı
   1. OpTDP yerine N-terminusunda (EGFP-TDP-43z) gelişmiş yeşil floresan protein (EGFP) ile etiketlenmiş zebra balığı vahşi tip tardbp taşıyan başka bir plazmid inşa edin -43h ancak aksi takdirde hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan yapısı (hsp70l-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan)¹⁴ ile aynıdır. OPTDP-43h'nin ışık stimülasyonu için iç kontrol olarak EGFP-TDP-43z kullanın.
   2. 1.2.1-1.2.5'te açıklandığı gibi mnr2b lokustaki hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan kasetini barındıran CH211-172N16-iTol2A oluşturun. Hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan kasetini taşıyan CH211-172N16-iTol2A, mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z olarak belirlenmiştir.

2. Zebra balıklarında Tol2 transpoz aracılı BAC transgenez

1. 40 mM KCl, fenol kırmızısı (%10 v/v), mnr2b-hs:opTDP-43h DNA'nın 25 ng/μL'si ve 25 ng/μL Tol2 transposase ^mRNA19 içeren enjeksiyon solüsyonunu hazırlayın.
2. Enjeksiyon çözeltisinin 1 nL'sini (mineral yağda kalibre edilmiş yaklaşık 123 μm çapında bir damlacık) tek hücreli aşamada vahşi tip zebra balığı embriyolarının sitosoluna enjekte edin. Enjekte edilen balıkları, omurilik motor nöronları da dahil olmak üzere çeşitli embriyonik dokularda kırmızı floresan protein (RFP) pozitif agregaların oluşumu için 2-3 gün sonra floresan stereomikroskop altında tarayın (dpf). RFP pozitif balığı yetişkinliğe yükseltin.
3. 2.1 ve 2.2'de açıklandığı gibi mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z DNA'sını enjekte edin. EGFP pozitif balıkları yetişkinliğe yükseltin.
4. Birkaç ay sonra, F1 yavrularını elde etmek için standart 2 L çiftleşme kafeslerine cinsel olarak olgunlaşmış enjekte edilmiş balık ve yabani tip balıkları çiftler halinde koyun. Plan-Neofluar 5x/0.15 objektif lens ile donatılmış bir epifluoresans mikroskobu kullanarak omurilik motor kolonunda RFP (opTDP-43h) veya EGFP (EGFP-TDP-43z) floresan için 3 dpf'de F1 balıklarını tarayın. Tipik olarak, bir kurucu balık 10−20 enjekte edilen balıktan tanımlanır (germline bulaşma oranı% 5−10'dur).
5. OpTDP-43h veya EGFP-TDP-43z ekspresyonunun yoğunluğu, kromozomal konum etkileri nedeniyle kurucu balıklar arasında değişebileceğinden, farklı kurucu balıklardan gelen birden fazla Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] ve Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] kesici uçlarını izole edin ve karşılaştırın.
6. Tg içeren yavrular elde etmek için Çapraz Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] ve Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] balık hatları [mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] Mendelian oranında çift transgenik balık.
7. Balığı 30 mL E3 tamponu (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM _CaCl2, 0.33 mM _MgSO4, %^10-5 Metilen Mavisi) ve melanogenez inhibe etmek için 8-10 saat döllenme sonrası (hpf) 0.003% (w/v) N-feniltiyiourea ekleyin.
8. Plastik kabı 30 hpf'den sonra alüminyum folyo ile örtün.

3. Mavi ışık aydınlatması için LED hazırlanması

1. Tablette/telefonda yüklü olan ilişkili uygulamayı kullanarak LED paneli açın. Bir spektrometrenin probunu 6 kuyu kabının boş bir kuyusuna koyun ve LED ışığını uygulama aracılığıyla ~456 nm'de zirve yapmak üzere dalga boyuna ayarlayın. Optik güç ölçerin optik sensörlerini boş kuyuya yerleştirin ve LED ışığının gücünü ayarlayın (~0,61 mW/^cm2). LED ışık ayarı kaydedilebilir ve uygulamada alınabilir.
2. Çanak/LED panel ayarını 28 °C'de inkübatöre tanıtın. Balıkların görüntülenmesi 48 hpf'den başlamadan önce bu adımı tamamla.

4. Optogenetik TDP-43'i ifade eden zebra balığı larvalarının görüntülenmesi

1. Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] çift transgenik balığı en az 47 hpf'den önce seçin, yukarıda açıklanan epifluoresans mikroskobu kurulumunu kullanarak spinal motor kolonunda RFP (opTDP-43h) veya EGFP (EGFP-TDP-43z) floresansına dayanmaktadır.
2. Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] çift transgenik balığı deforionat.
3. 42 °C'de 250 μg/mL etil 3-aminobenzoat metansülfonat tuzu içeren % 1 düşük erime sıcaklığında agarose önceden ısıtın.
4. Kısaca Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43] çift transgenik balık kısaca anestezi E3 tamponda 48 hpf Tricane konsantrasyonu içeren.
5. Önceden ısıtılmış% 1 düşük erime sıcaklığında agarose'dan bir damla oda sıcaklığında cam taban kabına koyun. Cam tabaktaki kubbe şeklindeki agarose damlasının çapı 8-10 mm'dir.
6. Pasteur pipet kullanarak, uyuşturulmuş balıkları cam taban kabındaki düşük erime sıcaklığındaki agarose ekleyin ve ardından birkaç kez pipetleyarak karıştırın. Balıkla birlikte agarose'a eklenen E3 tampon miktarını en aza indirin.
7. Omuriliğin uygun bir yatay konumda olduğundan emin olmak için agarose katılaşması sırasında bir şırınga iğnesi kullanarak (tipik olarak ~ 1 dk) balığı yan tarafta tutun. Katılaşmadan sonra, kubbe şeklindeki agarose monteli balığın üzerine birkaç damla E3 tamponu koyun.
8. Piksel başına 4,0 μs (piksel başına 12 bit), amaç için dilim başına 1,0 μm adım boyutu ve uyarılma/emisyon dalga boylarının bir kombinasyonunu kullanarak, sayısal diyafram açıklığı 1,00 olan 20x su daldırma objektif lensi ile donatılmış bir konfokal mikroskopla tarayarak omuriliğin seri konfokal z bölümlerini elde edin: Kanal 1) EGFP için 473/510 nm ve Kanal 2) mRFP1 için 559/583 nm.
   NOT: Balığın ventral tarafındaki kloaka, zaman noktalarında omurga segmentlerinin (seviye 16-17) tanımlanmasına ve karşılaştırılmaya yardımcı olan referans olarak ilgi alanlarına (ROI) dahil edilir.
9. Görüntüleme tamamlanır tamamlanmaz agarose'u bir şırınga iğnesi ile dikkatlice kırarak balıkları agarosedan çıkarın. Balığın agaroseya gömdülme süresini mümkün olduğunca kısa tutun, ancak agarose <30 dakika boyunca gömülmesi balığın canlılığını etkilemez.

5. OpTDP-43h-ekspresyon balıklarının mavi ışık yayan diyot (LED) ışığının alan aydınlatması ile ışık stimülasyonu

1. Kuyuya 7,5 mL E3 tamponu ekleyin ve görüntülenmiş Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] çift transgenik balığı kuyuya yerleştirin. Çanağı ve LED paneli bir ara parçayla (örneğin, beş slayt gözlüğü istiflenmiş olarak) 5 mm aralıklarla tutarak altı kuyulu tabağı LED panele yerleştirin.
2. Mavi LED ışığını açın. Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] çift transgenik balıklardan bazılarını, unilluminated kontrol balıkları gerektiğinde alüminyum folyo ile kaplı ayrı bir altı kuyulu tabakta tutun (yani karanlık koşullarda)¹⁴.
3. Aydınlatmadan sonra (örneğin, Şekil 3'te 72 hpf'de 24 saat boyunca), 4.3 - 4.9 adımlarını tekrarlayarak aydınlatılmış balığın omuriliğini görüntüleyin.

6. Spinal motor nöronlarda optogenetik TDP-43'ün sitoplazmik yer değiştirmesinin görselleştirilmesi

1. Görüntü dosyasını, nih image tarafından geliştirilen ve https://imagej.net/Fiji/Downloads indirilebilen açık kaynaklı bir Java görüntü işleme programı olan ImageJ/^Fiji21'de (Sürüm: 2.1.0/1.53c) açın.
2. Odak düzlemleri arasında hareket etmek için Z kaydırma çubuğunu kullanın. Görüntü |'i tıklatarak birden çok dilimin maksimum yoğunluk projeksiyonu oluşturma Yığınlar | Z proje | Maksimum Yoğunluk ve ayar Omurilik motor kolonunun hemisegmentlerini kaplayan Başlangıç dilimi ve Durdurma dilimi.
3. Görüntü |'na tıklayarak çok kanallı görüntüyü iki tek kanallı görüntüye bölün Renk | Kanalları Böl.
4. Görüntü | tıklayarak sitoplazmik EGFP-TDP-43z'nin net bir şekilde görülebilmesini sağlamak için EGFP-TDP-43z sinyalini geliştirin | ayarlama Parlaklık/Kontrast ve Minimum ayarlama
5. Analiz |'ni tıklatarak yatırım getirisi yöneticisini açın Araçlar | Yatırım getirisi yöneticisi. Hücre gövdelerinin göreli konumlarına göre, her iki görüntüde de tanımlanabilen hücreleri 48 hpf ve 72 hpf olarak bulun. Freehand seçimlerini kullanarak EGFP-TDP-43z sinyali tarafından görselleştirilen tek spinal motor nöronlarının hücre gövdelerinin hatlarını özetleyerek ve ardından yatırım getirisi yöneticisinde Ekle[t] öğesini tıklatarak ROI'leri ayarlayın.
6. Düz'ü kullanarak düz bir çizgi çizerek ve Analiz |'nı tıklatarak somanın ana eksenini ayarlayın EGFP-TDP-43z (C1) ve opTDP-43h (C2) görüntüleri için 48 ve 72 hpf'de Çizim Profili.
7. Değerleri her EGFP-TDP-43z ve opTDP-43h sinyali için en büyük değere bölerek Çizim Profilini normalleştirin. X ve y'nin istatistiksel bir yazılımda XY grafiğini kullanarak sırasıyla soma ve göreli floresan yoğunluklarının ana eksenini temsil ettiği x-y koordinatlarıyla normalleştirilmiş değerleri çizin.

7. ImageJ/Fiji kullanarak opTDP-43h ve EGFP-TDP-43z sinyalleri arasında oranmetrik karşılaştırma

1. ImageJ/Fiji'de görüntü dosyasını açın ve EGFP-TDP-43z'nin 6.1-6.5'teki gibi maksimum yoğunluk projeksiyon görüntüsünü kullanarak tek mnr2b pozitif hücreler için ROI'leri ayarlayın. Arka plan sinyalini (arka plan yatırım getirisi) temsil etmek için ventral omuriliğin (örneğin, notochord) dışına bir yatırım getirisi ekleyin.
2. Her EGFP-TDP-43z ve opTDP-43 görüntüsü için Görüntü | Yığınlar | Z proje | Dilimleri Topla ve Hemispinal motor sütununu kaplayan Başlangıç dilimini ve Durdur dilimini ayarlayın.
3. Maksimum yoğunluk projeksiyon görüntüsüyle oluşturulan yatırım getirisi yöneticisini açın. EGFP-TDP-43z için görüntü penceresini seçip yatırım getirisi yöneticisinde Tümü Göster'i tıklatarak RoI'leri Toplam Dilimler görüntüsünde görüntüleyin. Her yatırım getirisi için ortalama değerler elde etmek üzere yatırım getirisi yöneticisinde Ölçül'ü tıklatın.
4. 7.3'te sağlanan aynı yordamı izleyerek opTDP-43h için ortalama değerler elde edin.
5. Her yatırım getirisi için, arka plan yatırım getirisi için ortalamayı çıkardıktan sonra, opTDP-43h için çıkarılan ortalamayı, ORANSAL DEĞERI ELDE ETMEK İçİn EGFP-TDP-43z için çıkarılan ortalamaya bölün. Oranmetrik değerler farklı zaman noktaları arasında karşılaştırılabilir ve Prizma yazılımında Sütun grafiği kullanılarak sunulabilir.

Sonuçlar

Zebra balığı larvalarının mnr2b+ spinal motor nöronlarında optogenetik ve optogenetik olmayan TDP-43 proteinlerinin canlı görüntülenmesi
Zebra balıklarındaki spinal motor nöronlarında TDP-43 faz geçişini teşvik etmek için, sırasıyla N ve C-termini'nde mRFP1 ve ^CRY2olig22 ile etiketlenmiş bir insan TDP-43h inşa edildi ve opTDP-43h14 olarak belirlendi (Şekil 1A).

Tartışmalar

Zebra balıklarında opTDP-43h ve EGFP-TDP-43z'nin mnr2b-BAC aracılı ifadesi, spinal motor nöronlarında TDP-43 faz geçişinin canlı görüntülenmesi için eşsiz bir fırsat sağlar. Zebra balığı larvalarının vücut dokularının optik şeffaflığı, opTDP-43h'nin basit ve noninvaziv optogenetik stimülasyonuna izin verir. Zaman içinde tek spinal motor nöronlar arasındaki karşılaştırmalar, opTDP-43h'nin ışığa bağımlı oligomerizasyonunun ALS patolojisini andıran sitoplazmik kümelenmes...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Confocal microscope	Olympus	FV1200
Epifluorescence microscope	ZEISS	Axioimager Z1
Fluorescence stereomicroscope	Leica	MZ16FA
Glass base dish	IWAKI	3910-035
Incubator	MEE	CN-25C
LED panel	Nanoleaf Limited	Nanoleaf AURORA smarter kit
Mupid-2plus	TAKARA	AD110
NucleoBond BAC100	MACHEREY-NAGEL	740579
NuSieve GTG Agarose	LONZA	50181
Objective lens	Olympus	XLUMPlanFL N 20×/1.00
Objective lens	ZEISS	Plan-Neofluar 5x/0.15
Optical power meter	HIOKI	3664
Optical sensor	HIOKI	9742-10
Phenol red solution 0.5%	Merck	P0290-100ML
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase	TAKARA	R050A
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
Six-well dish	FALCON	353046
Spectrometer probe BLUE-Wave	StellerNet Inc.	VIS-50
Syringe needle	TERUMO	NN-2725R
TaKaRa Ex Taq	TAKARA	RR001A
Tricane	Sigma-Aldrich	A5040
Zebrafish BAC clone CH211-172N16	BACPAC Genomics	CH211-172N16