قياس امتصاص الجلوكوز في نماذج Drosophila من اعتلال البروتين TDP-43

Summary

يتم زيادة امتصاص الجلوكوز في الخلايا العصبية الحركية Drosophila المتضررة من بروتين تار ملزمة الحمض النووي (TDP-43) اعتلال البروتين، كما هو مبين من قبل FRET القائم، ومستشعر الجلوكوز المشفرة وراثيا.

Abstract

التصلب الجانبي الضموري هو اضطراب تنكسي عصبي يسبب ضعف العضلات التدريجي والموت في غضون 2-5 سنوات بعد التشخيص. المظاهر السريرية تشمل فقدان الوزن, ديسليبيديميا, وفرط الأيض; ومع ذلك، فإنه لا يزال من غير الواضح كيف ترتبط هذه إلى انحطاط الخلايا العصبية الحركية. باستخدام نموذج Drosophila من اعتلال البروتين TDP-43 الذي يلخص العديد من ميزات ALS بما في ذلك إدراج السيتوبلازمي ، والخلل الحركي ، وانخفاض العمر ، حددنا مؤخرا عجزا استقلابيا واسع النطاق. ومن بين هذه العوامل، تبين أن التحليل الجليكولي منظم وأن تجارب التفاعل الجيني قدمت أدلة على وجود آلية تعويضية لاعصاب. في الواقع ، على الرغم من تنظيم فوسبهوفروكتوكيناز ، وهو معدل يحد من الإنزيم في انحلال الجليكوليسيس ، فقد ثبت أن زيادة في تحليل الجليكوليسيس باستخدام التلاعب الغذائي والجيني تخفف من الخلل الحركي وزيادة العمر الافتراضي في نماذج ذبابة اعتلال البروتين TDP-43. لمزيد من التحقيق في تأثير على اعتلال البروتين TDP-43 على تدفق الجليكوليك في الخلايا العصبية الحركية، تم استخدام جهاز استشعار مشفر وراثيا، FRET المستندة إلى، FLII12Pglu-700μδ6. يتكون هذا المستشعر من مجال استشعار الجلوكوز البكتيري والبروتينات الفلورية السماوي والأصفر كزوج FRET. عند ربط الجلوكوز ، يخضع المستشعر لتغيير تشكيلي يسمح بحدوث FRET. باستخدام FLII12Pglu-700μδ6، تم العثور على امتصاص الجلوكوز أن تكون زيادة كبيرة في الخلايا العصبية الحركية التي تعبر عن TDP-43^G298S،وهو البديل المسببة ALS. هنا، نعرض كيفية قياس امتصاص الجلوكوز، ex vivo، في مستحضرات الحبل العصبي البطني اليرقات التي تعبر عن مستشعر الجلوكوز FLII12Pglu-700μδ6 في سياق اعتلال البروتين TDP-43. يمكن استخدام هذا النهج لقياس امتصاص الجلوكوز وتقييم التدفق الجليكوليكي في أنواع مختلفة من الخلايا أو في سياق الطفرات المختلفة التي تسبب المرض والاضطرابات العصبية التنكسية ذات الصلة.

Introduction

التصلب الجانبي الضموري (ALS) هو اضطراب تنكسي عصبي تدريجي غير قابل للشفاء حاليا. ALS يؤثر على الخلايا العصبية الحركية العلوية والسفلية مما يؤدي إلى فقدان التنسيق الحركي, الشلل الذي لا رجعة فيه, فشل الجهاز التنفسي, والموت في نهاية المطاف في غضون 2-5 سنوات من التشخيص¹. ويرتبط ALS مع العيوب الأيضية مثل فقدان الوزن, ديسليبيديميا, وفرط الأيض (استعرضت في^2); ومع ذلك، فإنه لا يزال من غير الواضح كيف ترتبط هذه التعديلات في التمثيل الغذائي إلى انحطاط الخلايا العصبية الحركية. القاسم المشترك في ALS والأمراض العصبية التنكسية ذات الصلة هو TDP-43 ، وهو بروتين ملزم حمض النوى تشارك في عدة خطوات من تجهيز الحمض النووي الريبي^3،4،5. على الرغم من أن الطفرات في TDP-43 تؤثر فقط على 3٪ -5٪ من المرضى، تم العثور على بروتين TDP-43 البري من النوع داخل المجاميع السيتوبلازمية في >97٪ من حالات ALS (تمت مراجعتها في^6). وقد تم تصميم هذا المرض في Drosophila عن طريق الإفراط في التعبير عن النمط البري البشري أو TDP-43 المتحولة (G298S) في الخلايا العصبية الحركية ، والتي تلخص جوانب متعددة من ALS ، بما في ذلك التضمين السيتوبلازمي ، والخلل الحركي وانخفاض عمر^7،8. باستخدام هذه النماذج, أفيد مؤخرا أن اعتلال البروتين TDP-43 يسبب زيادة كبيرة في مستويات بيروفات وفوسففروكوكيناز (PFK) مرنا, معدل الحد من انزيم تحلل⁹. تم العثور على زيادات مماثلة في نصوص PFK في الخلايا العصبية الحركية المشتقة من المريض والحبل الشوكي ، مما يشير إلى أن انحلال الجليكوليسيس يتم تنظيمه في سياق اعتلال البروتين TDP-43. ومن المثير للاهتمام أن زيادة أخرى في تحليل الجليكوليسيس باستخدام التلاعبات الغذائية والجينية خففت من العديد من الأنماط الظاهرية ل ALS مثل الخلل الحركي وزيادة العمر الافتراضي في نماذج ذبابة اعتلال البروتين TDP-43 ، بما يتفق مع آلية تعويضية واعصاب في تتدهور الخلايا العصبية الحركية.

لمزيد من التغييرات التحقيق في انحلال الجليكوليسيس وقياس امتصاص الجلوكوز في نماذج Drosophila من اعتلال البروتين TDP-43، تم التعبير عن جهاز استشعار مشفرة وراثيا سابقا FRET المستندة FLII12Pglu-700μδ6¹⁰ في الخلايا العصبية الحركية على وجه التحديد باستخدام نظام التعبير UAS-GAL4. يستخدم مستشعر الجلوكوز FLII12Pglu-700μδ6 نقل الطاقة بالرنين بين متغيرين من البروتين الفلوري الأخضر، بروتينات الفلورسنت السماوي والأصفر (CFP و YFP) للكشف عن الجلوكوز على المستوى الخلوي. وهو يتألف من مجال ملزم الجلوكوز البكتيرية من الجين E. coli MglB تنصهر على CFP وYFP على طرفي نقيض من الجزيء. عندما ملزمة جزيء الجلوكوز، وأجهزة الاستشعار يخضع لتغيير تشكيلي جلب CFP وYFP أقرب معا والسماح FRET أن يحدث، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك لتحديد مستويات الجلوكوز داخل الخلايا^10،11،12 ( الشكل1). هنا، نعرض كيف يمكن استخدام مستشعر FLII12Pglu-700μδ6 لتحديد التغيرات في امتصاص الجلوكوز الناجمة عن اعتلال البروتين TDP-43 في الخلايا العصبية الحركية. التجارب الموصوفة هنا تبين أن الإفراط في التعبير عن متحولة المرتبطة ALS, TDP-43^G298S, في الخلايا العصبية الحركية يسبب زيادة كبيرة في امتصاص الجلوكوز بالمقارنة مع الضوابط. ويمكن استخدام هذا النهج في أنواع أخرى من ALS (مثل، SOD1، C9orf72، الخ) و / أو أنواع الخلايا الأخرى (مثل غليا، العضلات) لتحديد التغيرات في امتصاص الجلوكوز المرتبطة بالتنكس العصبي.

Protocol

وأبلغ عن الذباب المعدل وراثيا من نوع UAS FLII12Pglu-700μδ6 في فولكنهوف وآخرون^10، وكرم الدكتور س. شيرماير بتقديمه. تم توفير خطوط UAS TDP-43^G298S المعدلة وراثيا من قبل الدكتور ت. إيواتسوبو¹³. تم إنشاء خطوط Drosophila المؤتلفة التي تؤوي كلا من UAS FLII12Pglu-700μδ6 وUAS TDP-43 transgenes في مختبر Zarnescu باستخدام النهج الجينية القياسية وتم الإبلاغ عنها في مانزو^{وآخرون.} تم استخدام D42 GAL4 لدفع التعبير عن مستشعر الجلوكوز وحده أو جنبا إلى جنب مع TDP-43^G298S في الخلايا العصبية الحركية. يتم الحفاظ على جميع خطوط الطيران على وسائط دقيق الذرة دبس، في 25 درجة مئوية في 12 ساعة الظلام: دورة الضوء.

1. Drosophila الحبل العصبي البطني (VNC) تشريح

1. جعل السيليكون أطباق تشريح الاستومر.
   1. صب مكونات elastomer السيليكون في أنبوب 50 مل كما هو مبين في بروتوكول الشركة المصنعة ويحرك جيدا.
   2. ملء 35 مم أطباق زراعة الأنسجة مع ما يقرب من 2 مل من خليط الاستومر. استخدام حقنة لإزالة أي فقاعات. تغطية الأطباق ووضعها على سطح مستو في فرن 60 درجة مئوية بين عشية وضحاها لعلاج.
2. تشريح يرقات Drosophila لفضح VNC مع الحفاظ على صلاحية الأنسجة.
   1. جمع تجول اليرقة نجمة الثالثة، شطف مع DDH₂O، ومن ثم وضعه في قطرة من HL3 العازلة (70 mM NaCl، 5 M M KCl، 20 mM MgCl₂، 10 MM NaHCO₃، 115 mM السكروز، 5 mM trehalose، 5 mM HEPES؛ pH 7.1) على طبق مبطن elastomer.
   2. باستخدام زوج من ملقط (# 5 أو 55 ملقط) تحت مجهر تشريح ، قم بتدوين النهايات الأمامية والخلفية للجانب الظهري لليرقة لأعلى ، ومد اليرقة بعناية بالطول مع دبابيس الحشرات (دبابيس Minutein).
   3. جعل شق فقط فوق دبوس الخلفي باستخدام زوج من مقص قزحية الزاوية. قم بقطع عمودي بدءا من الشق باتجاه الطرف الأمامي لليرقة.
   4. إضافة بضع قطرات من HL-3 العازلة إذا لزم الأمر. إزالة القصبة الهوائية وبقية الأعضاء العائمة دون إزعاج الجهاز العصبي المركزي. دبوس اللوحات تمتد جدار الجسم لفضح الجهاز العصبي المركزي مع الحفاظ على النظام العصبي العضلي (VNCs، محاور عصبية، وتقاطعات العصبية والعضلية) سليمة.

2. الحصول على صورة

1. تحسين معلمات التصوير.
   1. قم بتشغيل المجهر وأشعة الليزر قبل البدء في التشريح. يجب الحصول على الصور باستخدام مجهر كونفوجكال مستقيم مع عدسة غمر المياه 40x. استخدام ليزر 405 نانومتر لإثارة CFP والحصول على الصور في كل من CFP (465-499 نانومتر) و FRET (535-695 نانومتر) قنوات الكشف.
   2. تحسين معلمات الامتلاك مثل سرعة المسح الضوئي (6) والمتوسط (2) والهدف (40x) والتكبير (1x) وحجم الثقب (1 AU) والدقة المكانية (512 × 512). ضبط كسب بحيث تكون الإشارة في النطاق الديناميكي الأمثل. يجب استخدام نفس المعلمات لكافة الأنماط الجينية.
2. صورة الخلايا العصبية الحركية داخل VNC.
   1. ضع طبق السيليكون مع العينة المفرخة تحت العدسة. خفض العدسة بحيث يأتي في اتصال مع trehalose-السكروز HL3 العازلة (انظر 1.2.1). من المهم جدا التأكد من أن العدسة مغمورة بالكامل في المخزن المؤقت. إضافة المزيد من المخزن المؤقت إذا لزم الأمر.
   2. استخدام قنوات CFP و FRET لتحديد يدويا قسم البصرية التي تتكون من ما لا يقل عن 6 الخلايا العصبية الحركية في التركيز، وتقع على طول خط الوسط VNC. يتم تحديد الخلايا العصبية الحركية على أساس التعبير عن جهاز استشعار الجلوكوز والموقف على طول المحور الأمامي الخلفي.
   3. الحصول على الصور كل 10 ق لمدة 10 دقيقة. تمثل هذه الصور خط الأساس.
3. حفز مع الجلوكوز تكمل HL-3.
   1. إزالة تريهالوز-السكروز التي تحتوي على HL3 العازلة باستخدام ماصة باستور واستبداله مع 5 MM الجلوكوز تكمل HL-3 (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MgCl₂, 10 mM NaHCO₃, 115 mM السكروز, 5 MM الجلوكوز, 5 M HEPES, pH 7.1). هذه الخطوة تحتاج إلى أن يتم بعناية كبيرة، لتجنب حركة VNC قدر الإمكان.
   2. الحصول على الصور كل 10 ق لمدة 10 دقائق أخرى. تمثل هذه الصور مرحلة التحفيز.
4. احفظ الصور كملفات .czi أو أي نوع ملف مدعوم من برنامج التصوير باسم ملف يتضمن التاريخ والخلفية الوراثية والحالة التجريبية (الأساس أو التحفيز) والقنوات المستخدمة.
5. إعادة استخدام المعلمات لتصوير كافة الأنماط الجينية(الشكل 2A).

3. معالجة الصور واختيار عائد الاستثمار

1. فتح الملفات czi في فيجي / ImageJ وتعيين وضع اللون: تدرج الرمادي، اختر عرض المكدس مع : Hyperstack، وحدد تقسيم القنوات في نوافذ منفصلة.
2. معالجة الصور باستخدام الإضافات تصحيح الانجراف: turboreg و stackreg. يتم تصحيح كل قناة بشكل منفصل عن طريق تحديد Stackreg ضمن الإضافات، ثم اختر التحويل: ترجمة.
3. حدد يدويا مناطق الاهتمام (ROIs) لاستخراج متوسط القيمة الرمادية لكل قناة.
   1. اختيار ROIs عن طريق تتبع جميع الخلايا العصبية الحركية التي لا تزال في التركيز على مدى سلسلة زمنية كاملة. استخدام مدير عائد الاستثمار لحفظ كل مخطط الخلايا العصبية الحركية.
   2. استخدم الدالة Multi-measure لقياس متوسط القيمة الرمادية في كل عائد استثمار في كل نقطة زمنية. نسخ ROIs تتبع من القناة الأولى إلى القناة الثانية لصورة ما قبل التحفيز.
   3. كرر هذه العملية لصور ما بعد التحفيز في كل قناة باستخدام نفس الخلايا / ROIs المحددة لصورة التحفيز المسبق.

4. تحليل البيانات

1. حساب نسبة FRET/CFP، باستخدام القيم الرمادية المتوسطة لقنوات FRET وCFP. تعكس التغيرات في نسب FRET/CFP التعديلات في تركيز الجلوكوز داخل الخلايا.
   1. نسب المؤامرة FRET/CFP لكل عائد استثمار ونقطة زمنية مقابل وقت. داخل كل VNC بعض من ROIs سوف تظهر انخفاضا في نسب FRET / CFP بعد التحفيز.
      ملاحظة: يتم تفسير هذا على أنه عدم قدرة بعض الخلايا العصبية على امتصاص الجلوكوز ، ربما بسبب الإجهاد الناجم عن التشريح وبالتالي يتم استبعاده من التحليل. أما نسب FRET/CFP المتبقية لكل عائد استثمار ونقطة زمنية في المتوسط فيولد نسبة واحدة من FRET/CFP لكل نقطة زمنية لكل نمط جيني (مستشعر الجلوكوز وحده ومستشعر الجلوكوز مع TDP-43^G298S). وتستخدم هذه النسب FRET/CFP واحد لجميع التطبيع اللاحقة. تم تحليل 31 ROIs لضوابط استشعار الجلوكوز وتم تحليل 24 ROIs ل TDP-43^G298S.
2. تطبيع خط الأساس: حساب متوسط نسب FRET/CFP لأول 10 دقائق (خط الأساس)، ومن ثم تطبيع نسب FRET/CFP الفردية لكل نقطة زمنية من التجربة بأكملها إلى متوسط خط الأساس 10 دقيقة (انظر الشكل 2B).
3. تطبيع نقطة التوقيت: تطبيع نسب TDP-43^G298S FRET/CFP إلى نسب FRET/CFP من مستشعر الجلوكوز وحده في كل نقطة زمنية (انظر الشكل 3A).
4. الرسوم البيانية الشريطية: بالنسبة لمقارنات خط الأساس مقابل التحفيز في شكل رسوم بيانية شريطية، استخدم نسب FRET/CFP من 5-10 دقائق (خط الأساس) و15-20 دقيقة (التحفيز) لكل نمط جيني. تطبيع نسبة التحفيز إلى نسبة خط الأساس (انظر الشكل 3B).

5. التحليلات الإحصائية

1. تقييم مجموعات البيانات العادية باستخدام تصحيح Mann-Whitney (لتطبيع خط الأساس والنقطة الزمنية) أو اختبار Kruskall-Walis (لتمثيل الرسم البياني الشريطي للتحفيز مقابل نسب FRET/CFP الأساسية).

النتائج

الحصول على صورة من جهاز استشعار الجلوكوز في الحبل العصبي البطني (VNC)، ex vivo
لتحديد الاختلافات في امتصاص الجلوكوز في نموذج Drosophila من ALS على أساس TDP-43 ، تم استخدام مستشعر الجلوكوز المشفر وراثيا القائم على FRET. يتألف جهاز الاستشعار CFP وYFP تنصهر في مجال ربط الجلوكوز من ...

Discussion

ويمكن تطبيق هذه التقنية الموضحة بالتفصيل هنا لقياس امتصاص الجلوكوز في نوع معين من الخلايا من الاهتمام في Drosophila الحية باستخدام FLII12Pglu-700μδ6، وهو جهاز استشعار FRET القائم الذي يمكن الكشف عن التغيرات في مستويات الجلوكوز إلى نطاق ميليمولار^10،11،

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm tissue culture dishes	Sigma Aldrich	CLS430165
40X water immersion lens	Zeiss	440090	dippable, N.A. 0.8
dissection scissors	Roboz	RS-5618
Dumont #5 forceps	VWR	100189-236
Dumont #55 forceps	VWR	100189-244
Minutien pins	Fine Science tools	26002-10	used for dissections
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	Dow	1317318
Zeiss LSM880 NLO upright multiphoton/confocal microscope	Zeiss	N/A