测量TDP-43蛋白病果 蝇 模型中的葡萄糖摄取

摘要

受 TAR DNA 结合蛋白 （TDP-43） 蛋白病影响 的果蝇 运动神经元中的葡萄糖摄取增加，如基于 FRET 的遗传编码葡萄糖传感器所示。

摘要

肌萎缩性侧索硬化症是一种神经退行性疾病，在诊断后 2-5 年内导致进行性肌无力和死亡。临床表现包括体重减轻、血脂异常和代谢亢进。然而，目前尚不清楚这些与运动神经元变性的关系。使用TDP-43蛋白病的 果蝇 模型，该模型概括了ALS的几个特征，包括细胞质包涵体，运动功能障碍和寿命缩短，我们最近发现了广泛的代谢缺陷。其中，糖酵解被发现是上调的，遗传相互作用实验为代偿性神经保护机制提供了证据。事实上，尽管磷酸果糖激酶（糖酵解中的限速酶）的上调，但使用饮食和遗传操作增加糖酵解被证明可以减轻运动功能障碍并延长TDP-43蛋白病苍蝇模型的寿命。为了进一步研究TDP-43蛋白病对运动神经元糖酵解通量的影响，使用了先前报道的遗传编码的基于FRET的传感器FLII12Pglu-700μδ6。该传感器由细菌葡萄糖传感域和青色和黄色荧光蛋白组成，作为FRET对。葡萄糖结合后，传感器发生构象变化，允许发生FRET。使用FLII12Pglu-700μδ6，发现表达TDP-43^G298S的运动神经元（一种引起ALS的变异体）的葡萄糖摄取显着增加。在这里，我们展示了如何在TDP-43蛋白病的背景下测量表达葡萄糖传感器FLII12Pglu-700μδ6的幼虫腹侧神经索制剂中的葡萄糖摄取， 离体。这种方法可用于测量葡萄糖摄取并评估不同细胞类型或导致ALS和相关神经退行性疾病的各种突变的糖酵解通量。

引言

肌萎缩性侧索硬化症（ALS）是一种进行性神经退行性疾病，目前无法治愈。ALS 影响上下运动神经元，导致运动协调丧失、不可逆性瘫痪、呼吸衰竭，并在诊断后 2-5 年内最终死亡¹。ALS与代谢缺陷有关，例如体重减轻，血脂异常和代谢亢进（^第2篇综述）;然而，目前尚不清楚这些代谢变化与运动神经元变性的关系。ALS和相关神经退行性疾病的一个共同点是TDP-43，这是一种参与RNA处理^3，4，5的几个步骤的核酸结合蛋白。虽然TDP-43的突变仅影响3%-5%的患者，但在>97%的ALS病例的细胞质聚集体中发现了野生型TDP-43蛋白（在⁶中回顾）。这种病理学是通过运动神经元中人类野生型或突变TDP-43（G298S）的过表达在果蝇中建模的，这概括了ALS的多个方面，包括细胞质包涵体，运动功能障碍和寿命缩短^7，8。使用这些模型，最近报道TDP-43蛋白病导致丙酮酸水平和磷酸果糖糖激酶（PFK）mRNA（糖酵解⁹的限速酶）显着增加。在患者来源的运动神经元和脊髓中发现了PFK转录本的类似增加，这表明在TDP-43蛋白病的背景下糖酵解被上调。有趣的是，使用饮食和遗传操作进一步增加糖酵解减轻了几种ALS表型，如运动功能障碍和TDP-43蛋白病苍蝇模型中寿命的增加，与退行性运动神经元的补偿性神经保护机制一致。

为了进一步探索糖酵解的变化并测量TDP-43蛋白病果蝇模型中的葡萄糖摄取，先前报道的基于FRET的遗传编码传感器FLII12Pglu-700μδ6¹⁰专门使用UAS-GAL4表达系统在运动神经元中表达。FLII12Pglu-700μδ6葡萄糖传感器使用两种绿色荧光蛋白变体（青色和黄色荧光蛋白（CFP和YFP）之间的共振能量转移来检测细胞水平的葡萄糖。它由来自大肠杆菌MglB基因的细菌葡萄糖结合结构域组成，该基因融合到分子两端的CFP和YFP。当与葡萄糖分子结合时，传感器经历构象变化，使CFP和YFP更紧密地结合在一起并允许FRET发生，然后可用于量化细胞内葡萄糖水平^{10，11，12（}图1）。在这里，我们展示了FLII12Pglu-700μδ6传感器如何用于确定由运动神经元中TDP-43蛋白病引起的葡萄糖摄取变化。这里描述的实验表明，与对照组相比，运动神经元中ALS相关突变体TDP-43^G298S的过表达会导致葡萄糖摄取显着增加。这种方法可用于其他类型的ALS（例如，SOD1，C9orf72等）和/或其他细胞类型（例如，神经胶质细胞，肌肉），以确定与神经变性相关的葡萄糖摄取的变化。

研究方案

UAS FLII12Pglu-700μδ6转基因苍蝇在Volkenhoff等人¹⁰ 中报道，并由S. Schirmeier博士提供。UAS TDP-43^G298S 转基因系由T. Iwatsubo¹³博士提供。在Zarnescu实验室使用标准遗传方法产生了含有UAS FLII12Pglu-700μδ6和UAS TDP-43转基因的重组 果蝇 系，并在Manzo等人中^报道。D42 GAL4用于单独或与TDP-43^G298S 一起驱动运动神经元中葡萄糖传感器的表达。所有飞线保持在糖蜜玉米粉培养基上，在25°C下12小时黑暗:光循环。

1. 果蝇 腹侧神经索（VNC）解剖

1. 制作有机硅弹性体解剖皿。
   1. 按照制造商协议中的指示，将有机硅弹性体成分倒入 50 mL 管中，搅拌均匀。
   2. 用约2mL弹性体混合物填充35mm组织培养皿。使用注射器去除任何气泡。盖上盘子，将它们放在60°C烤箱的水平表面上过夜以固化。
2. 解剖 果蝇 幼虫以暴露VNC，同时保持组织活力。
   1. 收集游荡的三龄幼虫，用ddH₂O冲洗，然后将其滴入HL3缓冲液（70mM NaCl，5 mM KCl，20 mM MgCl_2，10mM NaHCO 3，115 mM蔗糖，5 mM海藻糖，5 mM HEPES;pH 7.1）放在弹性体衬里皿上。
   2. 在解剖显微镜下使用一对镊子（#5或55镊子），将幼虫背侧的前端和后端朝上，用昆虫别针（Minutein Pins）小心地纵向拉伸幼虫。
   3. 使用一把倾斜的虹膜剪刀在后针上方做一个切口。从切口开始垂直切口，朝向幼虫的前端。
   4. 如果需要，加入几滴HL-3缓冲液。切除气管和其他漂浮器官，而不会干扰中枢神经系统。将伸展体壁的皮瓣固定在内膜上，以暴露中枢神经系统，同时保持神经肌肉系统（VNC、轴突和神经肌肉接头）完好无损。

2. 图像采集

1. 优化成像参数。
   1. 在开始解剖之前打开显微镜和激光器。必须使用带有40x水浸透镜的直立共聚焦显微镜获取图像。使用405 nm激光激发CFP并采集CFP（465-499 nm）和FRET（535-695 nm）检测通道中的图像。
   2. 优化采集参数，如扫描速度 （6）、平均 （2）、物镜 （40 倍）、变焦 （1 倍）、针孔尺寸 （1 AU） 和空间分辨率 （512 x 512）。调整增益，使信号处于最佳动态范围内。所有基因型必须使用相同的参数。
2. 对 VNC 内的运动神经元进行成像。
   1. 将装有解剖样品的硅胶盘放在透镜下。降低晶状体，使其与海藻糖 - 蔗糖HL3缓冲液接触（见1.2.1）。确保镜头完全浸没在缓冲器中至关重要。如果需要，添加更多缓冲区。
   2. 使用 CFP 和 FRET 通道手动选择由至少 6 个聚焦运动神经元组成的光学部分，该部分位于 VNC 中线。运动神经元是根据葡萄糖传感器的表达和沿前后轴的位置来识别的。
   3. 每10秒采集一次图像，持续10分钟。这些图像表示基线。
3. 用补充葡萄糖的HL-3刺激。
   1. 使用巴斯德移液管除去含有HL3缓冲液的海藻糖蔗糖，并用5 mM葡萄糖补充HL-3（70mM NaCl，5 mM KCl，20 mM MgCl_2，10mM NaHCO_3，115mM蔗糖，5 mM葡萄糖，5 mM HEPES，pH 7.1）代替。需要非常小心地执行此步骤，以尽可能避免VNC的移动。
   2. 每 10 秒采集一次图像，再持续 10 分钟。这些图像代表刺激阶段。
4. 将图像另存为.czi文件或成像软件支持的任何文件类型，文件名包括日期，遗传背景，实验条件（基线或刺激）和使用的通道。
5. 重复使用这些参数对所有基因型进行成像（图2A）。

3. 图像处理和投资回报率选择

1. 在 Fiji/ImageJ 中打开 czi 文件并设置"颜色模式:灰度"，选择"查看堆栈方式:超堆栈"，然后选择"将通道拆分为单独的窗口"。
2. 使用漂移校正插件处理图像:涡轮reg和堆栈。通过选择"插件"下的"Stackreg"，然后选择"转换:转换"，可以单独更正每个通道。
3. 手动选择感兴趣区域 （ROI） 以提取每个通道的平均灰度值。
   1. 通过追踪在整个时间序列中保持焦点的所有运动神经元来选择ROI。使用 ROI 管理器保存每个运动神经元轮廓。
   2. 使用 多指标 函数可以测量每个时间点每个 ROI 中的平均灰度值。将从第一通道跟踪的ROI复制到第二通道，以获得预刺激图像。
   3. 使用为刺激前图像选择的相同细胞/ROI，对每个通道中的刺激后图像重复此过程。

4. 数据分析

1. 使用 FRET 和 CFP 通道的平均灰度值计算 FRET/CFP 比率。FRET/CFP比率的变化反映了细胞内葡萄糖浓度的变化。
   1. 绘制每个 ROI 和时间点与时间的 FRET/CFP 比率。在每个VNC中，一些投资回报率将在刺激后表现出FRET /CFP比率的下降。
      注意:这被解释为某些神经元无法摄取葡萄糖，可能是由于解剖引起的压力，因此从分析中消除。对每个ROI和时间点的剩余FRET/CFP比值进行平均，以生成每个基因型（单独的葡萄糖传感器和带有TDP-43^G298S的葡萄糖传感器）的每个时间点的单个FRET/CFP比率。这些单一的FRET/CFP比率用于所有后续归一化。分析了31个葡萄糖传感器对照的投资回报率，分析了24个TDP-43^G298S的投资回报率。
2. 基线归一化:计算前10分钟（基线）的FRET/CFP比率的平均值，然后将整个实验的每个时间点的单个FRET/CFP比率归一化为10分钟基线平均值（见图2B）。
3. 时间点归一化:在每个时间点，单独通过葡萄糖传感器对TDP-43^G298S FRET/CFP比值进行归一化（见图3A）。
4. 条形图:对于条形图形式的基线与刺激比较，对每种基因型使用5-10分钟（基线）和15-20分钟（刺激）的FRET/CFP比率。将刺激比与基线比率归一化（见图3B）。

5. 统计分析

1. 使用Mann-Whitney校正（用于基线和时间点归一化）或Kruskal-Walis检验（用于刺激与基线FRET / CFP比率的条形图表示）评估归一化数据集。

结果

腹侧神经索（VNC）中葡萄糖传感器的图像采集， 离体
为了确定基于TDP-43的ALS果蝇模型中葡萄糖摄取的差异，使用了基于FRET的遗传编码葡萄糖传感器。该传感器由CFP和YFP组成，从大肠杆菌MglB基因融合到葡萄糖结合域。葡萄糖结合引发构象变化，这可以通过CFP和YFP ^10，11，12之间的荧光共振能量转移...

讨论

这里详细描述的技术可以应用于使用FLII12Pglu-700μδ6测量活果蝇感兴趣的特定细胞类型的葡萄糖摄取，FLII12Pglu-700μδ6是基于FRET的传感器，可以检测葡萄糖水平的变化到毫摩尔范围^{10，11，12。}该传感器以前曾与UAS-GAL4系统结合使用，以将其表达靶向特定的细胞类型，包括神经元^9，10?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm tissue culture dishes	Sigma Aldrich	CLS430165
40X water immersion lens	Zeiss	440090	dippable, N.A. 0.8
dissection scissors	Roboz	RS-5618
Dumont #5 forceps	VWR	100189-236
Dumont #55 forceps	VWR	100189-244
Minutien pins	Fine Science tools	26002-10	used for dissections
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	Dow	1317318
Zeiss LSM880 NLO upright multiphoton/confocal microscope	Zeiss	N/A