TDP-43 Proteinopatisinin Drosophila Modellerinde Glikoz Alımının Ölçülmesi

Özet

TAR DNA bağlayıcı protein (TDP-43) proteinopatisi tarafından etkilenen Drosophila motor nöronlarında, FRET tabanlı, genetik olarak kodlanmış bir glikoz sensörü tarafından belirtildiği gibi glikoz alımı artar.

Özet

Amyotrofik lateral skleroz, tanıyı takip eden 2-5 yıl içinde ilerleyici kas güçsüzlüğüne ve ölüme neden olan nörodejeneratif bir bozukluktur. Klinik bulgular arasında kilo kaybı, dislipidemi ve hipermetabolizm sayılabilir; bununla birlikte, bunların motor nöron dejenerasyonu ile nasıl ilişkili olduğu belirsizliğini korumaktadır. Sitoplazmik inklüzyonlar, lokomotor disfonksiyonu ve azaltılmış yaşam süresi dahil olmak üzere ALS'nin çeşitli özelliklerini yeniden sağlayan bir Drosophila TDP-43 proteinopati modeli kullanarak, yakın zamanda geniş kapsamlı metabolik eksiklikler tespit ettik. Bunlar arasında glikolizin güncel olduğu tespit edildi ve genetik etkileşim deneyleri telafi edici bir nöroprotektif mekanizma için kanıt sağladı. Nitekim, glikolizde enzim oranını sınırlayan fosfolreküsyona rağmen, diyet ve genetik manipülasyonlar kullanılarak glikolizde bir artış, TDP-43 proteinopatisinin sinek modellerinde lokomotor disfonksiyonunu ve yaşam süresini artırdığı gösterilmiştir. Motor nöronlarda TDP-43 proteinopatisinin glikolitik akı üzerindeki etkisini daha fazla araştırmak için, daha önce genetik olarak kodlanmış, FRET tabanlı bir sensör olan FLII12Pglu-700μδ6 kullanıldı. Bu sensör, bakteriyel glikoz algılama etki alanı ve FRET çifti olarak siyan ve sarı floresan proteinlerden oluşur. Glikoz bağlanması üzerine sensör, FRET'in gerçekleşmesine izin vererek konformasyonsal bir değişikliğe uğrar. FLII12Pglu-700μδ6 kullanılarak, glikoz alımının ALS'ye neden olan bir varyant olan TDP-43^G298S'yiifade eden motor nöronlarda önemli ölçüde arttığı bulunmuştur. Burada, TDP-43 proteinopatisi bağlamında Glikoz sensörü FLII12Pglu-700μδ6'yı ifade eden larva ventral sinir kordonu preparatlarında glikoz alımının nasıl ölçüldüğünü gösteriyoruz. Bu yaklaşım, glikoz alımını ölçmek ve farklı hücre tiplerinde glikolitik akıyı değerlendirmek veya ALS ve ilgili nörodejeneratif bozukluklara neden olan çeşitli mutasyonlar bağlamında kullanılabilir.

Giriş

Amyotrofik Lateral Skleroz (ALS) şu anda tedavi edilemeyen ilerleyici bir nörodejeneratif bozukluktur. ALS, tanıdan sonraki 2-5 yıl içinde motor koordinasyon kaybına, geri dönüşü olmayan felce, solunum yetmezliğine ve nihai ölüme yol açan üst ve alt motor nöronları etkiler^1. ALS kilo kaybı, dislipidemi ve hipermetabolizm gibi metabolik defektlerle ilişkilidir^(2'degözden geçirilmiştir); bununla birlikte, metabolizmadaki bu değişikliklerin motor nöron dejenerasyonu ile nasıl ilişkili olduğu belirsizliğini korumaktadır. ALS ve ilgili nörodejeneratif hastalıklarda ortak bir payda, RNA işleme 3^,4 , 5'in çeşitli adımlarında yer alan nükleik asit bağlayıcı bir protein olan TDP-43'tür. TDP-43'teki mutasyonlar hastaların sadece %3-5'ini etkilese de, ALS vakalarının %97'> sinde sitoplazmik agregalarda vahşi tip TDP-43 proteini bulunur^(6'dagözden geçirilmiştir). Bu patoloji Drosophila'da, sitoplazmik inklüzyonlar, lokomotor disfonksiyonu ve azaltılmış ömür dahil olmak üzere ALS'nin birçok yönünü yeniden oluşturan motor nöronlarda insan wildtype veya mutant TDP-43'ün (G298S) aşırı ifade edilmesiyle modellenmiştir^7,8. Bu modeller kullanılarak, son zamanlarda TDP-43 proteinopatisinin piruvat seviyelerinde ve glikoliz^9'unhız sınırlayıcı enzimi olan fosfolroktokinaz (PFK) mRNA'da önemli bir artışa neden olduğu bildirilmiştir. PFK transkriptlerinde benzer artışlar hasta kaynaklı motor nöronlarda ve omuriliklerde de bulundu ve glikolizin TDP-43 proteinopatisi bağlamında güncellendiğini düşündürmektedir. İlginçtir ki, diyet ve genetik manipülasyonlar kullanarak glikolizdeki daha fazla artış, TDP-43 proteinopatisinin sinek modellerinde, dejenere motor nöronlarda telafi edici, nöroprotektif bir mekanizma ile tutarlı olarak, lokomotor disfonksiyonu ve artan yaşam süresi gibi birkaç ALS fenotipini hafifletti.

Glikolizdeki değişiklikleri daha fazla araştırmak ve TDP-43 proteinopatisinin Drosophila modellerinde glikoz alımını ölçmek için, daha önce bildirilen genetik olarak kodlanmış FRET tabanlı sensör FLII12Pglu-700μδ6^10, özellikle UAS-GAL4 ekspresyon sistemi kullanılarak motor nöronlarda ifade edildi. FLII12Pglu-700μδ6 glikoz sensörü, glikozu hücresel düzeyde tespit etmek için yeşil floresan protein, siyan ve sarı floresan proteinlerin (CFP ve YFP) iki çeşidi arasında rezonans enerjisi transferi kullanır. Molekülün zıt uçlarında CFP ve YFP'ye kaynaşmış E. coli MglB geninden bakteriyel glikoz bağlayıcı etki alanından oluşur. Bir glikoz molekülüne bağlandığında, sensör CFP ve YFP'yi birbirine yaklaştıran ve FRET'in oluşmasına izin veren, daha sonra hücre içi glikoz seviyelerini ölçmek için kullanılabilecek konformasyonel bir değişikliğe uğrar^10,11,12 ( Şekil1). Burada, FLII12Pglu-700μδ6 sensörünün motor nöronlarda TDP-43 proteinopatisinin neden olduğu glikoz alımındaki değişiklikleri belirlemek için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz. Burada açıklanan deneyler, ALS ile ilişkili bir mutant olan TDP-43^G298S'nin motor nöronlarda aşırı ifade alınmasının, kontrollere kıyasla glikoz alımında önemli bir artışa neden olduğunu göstermektedir. Bu yaklaşım, nörodejenerasyonla ilişkili glikoz alımındaki değişiklikleri belirlemek için diğer ALS türlerinde (örneğin, SOD1, C9orf72, vb.) ve/veya diğer hücre tiplerinde (örneğin, glia, kaslar) kullanılabilir.

Protokol

UAS FLII12Pglu-700μδ6 transgenik sinekler Volkenhoff ve ark.^10'da bildirilmiştir ve Dr. S. Schirmeier tarafından nazikça sağlanmıştır. UAS TDP-43^G298S transgenik hatları Dr. T. Iwatsubo¹³tarafından sağlanmıştır. Zarnescu laboratuvarında standart genetik yaklaşımlar kullanılarak hem UAS FLII12Pglu-700μδ6 hem de UAS TDP-43 transgenes barındıran rekombinant Drosophila hatları üretildi ve Manzo ve^ark. D42 GAL4, glikoz sensörünün tek başına veya motor nöronlarda TDP-43^G298S ile birlikte ekspresyonunun yönlendirilmesinde kullanıldı. Tüm sinek hatları pekmez mısır unu ortamlarında, 12 saat karanlıkta 25 °C'de tutulur: ışık döngüsü.

1. Drosophila Ventral Sinir Kordonu (VNC) diseksiyonları

1. Silikon elastomer diseksiyon yemekleri yapın.
   1. Silikon elastomer bileşenlerini üreticinin protokolünde belirtildiği gibi 50 mL'lik bir tüpe dökün ve iyice karıştırın.
   2. 35 mm doku kültürü yemeklerini elastomer karışımından yaklaşık 2 mL ile doldurun. Kabarcıkları çıkarmak için bir şırınna kullanın. Bulaşıkları örtün ve tedavi etmek için gece boyunca 60 °C fırında düz bir yüzeye yerleştirin.
2. Doku canlılığını korurken VNC'yi ortaya çıkarmak için Drosophila larvalarını parçalara ayrıştırın.
   1. Gezgin bir üçüncü başlangıç larvası toplayın, ddH₂O ile durulayın ve ardından elastomer kaplı bir çanak üzerine bir damla HL3 tamponuna (70 mM NaCl, 5 mM KCl,₂₀mM MgCl 2 , 10 mM NaHCO₃, 115 mM sakkaroz, 5 mM trehaloz, 5 mM HEPES; pH 7.1) yerleştirin.
   2. Bir diseksiyon mikroskobu altında bir çift toka (#5 veya 55 tospi) kullanarak, larva dorsal tarafının ön ve arka uçlarını yukarı sabitleyin, larvayı böcek pimleriyle (Minutein Pinleri) uzunlamasına dikkatlice uzatın.
   3. Bir çift açılı iris makası kullanarak arka pimin hemen üstünde bir kesi yapın. Kesiden başlayarak larvaların ön ucuna doğru dikey bir kesim yapın.
   4. Gerekirse birkaç damla HL-3 arabelleği ekleyin. CNS'yi bozmadan nefes borusu ve yüzen organların geri kalanını çıkarın. Nöromüsküler sistemi (VNC'ler, aksonlar ve nöromüsküler kavşaklar) sağlam tutarken CNS'yi ortaya çıkarmak için vücut duvarını geren kapakları sabitle.

2. Görüntü alımı

1. Görüntüleme parametrelerini en iyi duruma getirme.
   1. Diseksiyonlara başlamadan önce mikroskobu ve lazerleri açın. Görüntüler, 40x su daldırma lensli dik bir konfokal mikroskop kullanılarak elde edilmelidir. CFP'yi heyecanlandırmak ve hem CFP (465-499 nm) hem de FRET (535-695 nm) algılama kanallarındaki görüntüleri elde etmek için 405 nm lazer kullanın.
   2. Tarama hızı (6), ortalama (2), hedef (40x), yakınlaştırma (1x), iğne deliği boyutu (1 AU) ve uzamsal çözünürlük (512 x 512) gibi alım parametrelerini optimize edin. Kazancı, sinyalin en uygun dinamik aralıkta olacak şekilde ayarlayın. Tüm genotipler için aynı parametreler kullanılmalıdır.
2. VNC içindeki görüntü motoru nöronları.
   1. Silikon kabı, parçalanmış numune ile merceğin altına yerleştirin. Lensi trehalose-sakkaroz HL3 tamponu ile temasa geçecek şekilde dirileyin (bkz. 1.2.1). Lensin tampona tamamen batırılmasını sağlamak önemlidir. Gerekirse daha fazla arabellek ekleyin.
   2. VNC orta hattı boyunca bulunan, odaktaki en az 6 motor nörondan oluşan bir optik bölümü manuel olarak seçmek için CFP ve FRET kanallarını kullanın. Motor nöronlar, glikoz sensörünün ifadesine ve ön-arka eksen boyunca konuma göre tanımlanır.
   3. 10 dakika boyunca her 10 dakikada bir görüntü alın. Bu görüntüler taban çizgisini temsil eder.
3. HL-3 takviyeli glikoz ile uyarın.
   1. Pasteur pipet kullanarak HL3 tamponu içeren trehaloz-sakkarozu çıkarın ve 5 mM glikoz takviyeli HL-3 (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MgCl₂, 10 mM NaHCO₃, 115 mM sakkaroz, 5 mM glikoz, 5 mM HEPES, pH 7.1) ile değiştirin. VNC'nin hareketini mümkün olduğunca önlemek için bu adımın büyük bir dikkatle gerçekleştirilmesi gerekir.
   2. Her 10 dakikada bir 10 dakika daha görüntü alın. Bu görüntüler stimülasyon aşamasını temsil eder.
4. Görüntüleri .czi dosyaları veya görüntüleme yazılımı tarafından desteklenen herhangi bir dosya türü olarak tarih, genetik arka plan, deneysel durum (taban çizgisi veya stimülasyon) ve kullanılan kanallar dahil olmak üzere bir dosya adıyla kaydedin.
5. Tüm genotipleri görüntüleyen parametreleri yeniden kullanın (Şekil 2A).

3. Görüntü işleme ve yatırım getirisi seçimi

1. Czi dosyalarını Fiji/ImageJ'de açın ve Renk Modu: Gri Tonlama'yı ayarlayın, Yığını Şu şekilde Görüntüle: Hyperstack'i seçin ve Kanalları Ayrı Pencerelere Böl 'üseçin.
2. Drift düzeltme eklentilerini kullanarak görüntüleri işleyin: turboreg ve stackreg. Eklentileraltında Stackreg seçilerek ve ardından Dönüştürme: Çeviri'yi seçerek her kanal ayrı ayrı düzeltilir.
3. Her kanalın ortalama gri değerini ayıklamak için İlgi Alanlarını (ROI) el ile seçin.
   1. Tüm zaman serisi boyunca odakta kalan tüm motor nöronları izleyerek ROI'leri seçin. Her motor nöron anahattını kaydetmek için yatırım getirisi yöneticisini kullanın.
   2. Her zaman noktasındaki her yatırım getirislerindeki ortalama gri değeri ölçmek için Çok ölçüm işlevini kullanın. İlk kanaldan izlenen ROI'leri, uyarım öncesi görüntü için ikinci kanala kopyalayın.
   3. Her kanaldaki uyarım sonrası görüntüler için bu işlemi, uyarılma öncesi görüntü için seçilen hücreleri/ROI'leri kullanarak tekrarlayın.

4. Veri analizi

1. FRET ve CFP kanalları için ortalama gri değerleri kullanarak FRET/CFP oranını hesaplayın. FRET/CFP oranlarındaki değişiklikler hücre içi glikoz konsantrasyonundaki değişiklikleri yansıtır.
   1. Her yatırım getirisi ve zaman noktası için zamana karşı FRET/CFP oranlarını çizin. Her VNC'de ROI'lerin bazıları stimülasyonu takiben FRET/CFP oranlarında bir düşüş gösterecektir.
      NOT: Bu, bazı nöronların muhtemelen diseksiyonların neden olduğu stres nedeniyle glikoz alamamaları ve bu nedenle analizden dışlanmaları olarak yorumlanır. Her yatırım getirisi ve zaman noktası için kalan FRET/CFP oranları, genotip başına zaman noktası başına tek bir FRET/CFP oranı oluşturmak için ortalamadır (sadece glikoz sensörü ve TDP-43^G298S'liglikoz sensörü). Bu tek FRET/CFP oranları sonraki tüm normalleştirmeler için kullanılır. Glikoz Sensörü kontrolleri için 31 ROI ve TDP-43^{G298S için 24}ROI analiz edildi.
2. Temel normalleştirme: İlk 10 dakika (taban çizgisi) için FRET/CFP oranlarının ortalamasını hesaplayın ve ardından tüm denemenin her zaman noktası için ayrı FRET/CFP oranlarını 10 dakikalık taban çizgisi ortalamasına normalleştirin (bkz. Şekil 2B).
3. Zaman noktası normalleştirmesi: TDP-43^G298S FRET/CFP oranlarını her zaman noktasında tek başına glikoz sensöründen FRET/CFP oranlarına normalleştirin (bkz. Şekil 3A).
4. Çubuk grafikler: Çubuk grafikler şeklinde taban çizgisi ile stimülasyon karşılaştırmaları için, her genotip için 5-10 dk (taban çizgisi) ve 15-20 dk (stimülasyon) arasında FRET/CFP oranları kullanın. Stimülasyon oranını taban çizgisi oranına normalleştirin (bkz. Şekil 3B).

5. İstatistiksel analizler

1. Mann-Whitney düzeltmesi (temel ve zaman noktası normalleştirmeleri için) veya Kruskall-Walis testi (stimülasyonun taban çizgisi FRET/CFP oranlarına karşı çubuk grafik gösterimi için) kullanarak normalleştirilmiş veri kümelerini değerlendirin.

Sonuçlar

Ventral sinir kordonu (VNC), ex vivo glikoz sensörünün görüntü alımı
TDP-43'e dayalı bir DROSOPHILA ALS modelinde glikoz alımındaki farklılıkları belirlemek için genetik olarak kodlanmış FRET tabanlı bir glikoz sensörü kullanılmıştır. Sensör, CFP ve YFP'den oluşuyor ve E. coli MglB geninden glikoz bağlama alanına kaynaştı. Glikoz bağlama, CFP ve YFP ^{10 , 11,}

Tartışmalar

Burada ayrıntılı olarak açıklanan teknik, glikoz seviyelerindeki değişiklikleri milimoler^biraralık 10 , 11^,12'ye kadar algılayabilen FRET tabanlı bir sensör olan FLII12Pglu-700μδ6 kullanılarak canlı Drosophila'ya belirli bir hücre türünde glikoz alımını ölçmek için^{uygulanabilir.} Bu sensör daha önce UAS-GAL4 sistemi ile birlikte, ifadesini nöronlar^9,

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm tissue culture dishes	Sigma Aldrich	CLS430165
40X water immersion lens	Zeiss	440090	dippable, N.A. 0.8
dissection scissors	Roboz	RS-5618
Dumont #5 forceps	VWR	100189-236
Dumont #55 forceps	VWR	100189-244
Minutien pins	Fine Science tools	26002-10	used for dissections
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	Dow	1317318
Zeiss LSM880 NLO upright multiphoton/confocal microscope	Zeiss	N/A