Измерение поглощения глюкозы в моделях дрозофилы протеинопатии TDP-43

Резюме

Поглощение глюкозы увеличивается в моторных нейронах Drosophila, пораженных протеинопатией белка, связывающего ДНК(TDP-43), о чем свидетельствует генетически закодированный датчик глюкозы на основе FRET.

Аннотация

Боковой амиотрофический склероз является нейродегенеративным расстройством, вызывающим прогрессирующую мышечную слабость и смерть в течение 2-5 лет после постановки диагноза. Клинические проявления включают потерю веса, дислипидемию и гиперметаболизм; однако остается неясным, как они связаны с дегенерацией двигательных нейронов. Используя модель дрозофилы протеинопатии TDP-43, которая повторяет несколько особенностей БАС, включая цитоплазматические включения, двигательную дисфункцию и снижение продолжительности жизни, мы недавно выявили широкий спектр метаболических дефицитов. Среди них было обнаружено, что гликолиз регулируется, и эксперименты с генетическим взаимодействием предоставили доказательства компенсаторного нейропротекторного механизма. Действительно, несмотря на повышение регуляции фосфофруктокиназы, ограничивающего скорость фермента при гликолизе, было показано, что увеличение гликолиза с использованием диетических и генетических манипуляций смягчает двигательную дисфункцию и увеличивает продолжительность жизни в моделях протеинопатии TDP-43. Для дальнейшего изучения влияния протеинопатии TDP-43 на гликолитический поток в двигательных нейронах был использован ранее зарегистрированный генетически закодированный датчик на основе FRET FLII12Pglu-700μδ6. Этот датчик состоит из бактериального глюкозочувствительного домена и голубых и желтых флуоресцентных белков в качестве пары FRET. При связывании глюкозы датчик претерпевает конформационное изменение, позволяющее возникать FRET. Используя FLII12Pglu-700μδ6, было обнаружено, что поглощение глюкозы значительно увеличивается в двигательных нейронах, экспрессирующих TDP-43^G298S,вариант, вызывающий БАС. Здесь мы покажем, как измерить поглощение глюкозы, ex vivo,в препаратах личиночного вентрального нервного канатика, экспрессирующих датчик глюкозы FLII12Pglu-700μδ6 в контексте протеинопатии TDP-43. Этот подход может быть использован для измерения поглощения глюкозы и оценки гликолитического потока в различных типах клеток или в контексте различных мутаций, вызывающих БАС и связанные с ним нейродегенеративные расстройства.

Введение

Боковой амиотрофический склероз (БАС) является прогрессирующим нейродегенеративным расстройством, которое в настоящее время неизлечимо. БАС поражает верхние и нижние двигательные нейроны, что приводит к потере двигательной координации, необратимому параличу, дыхательной недостаточности и возможной смерти в течение 2-5 лет после постановки диагноза^1. БАС связан с метаболическими дефектами, такими как потеря веса, дислипидемия и гиперметаболизм (рассмотрено в^2); однако остается неясным, как эти изменения в метаболизме связаны с дегенерацией двигательных нейронов. Общим знаменателем при БАС и связанных с ним нейродегенеративных заболеваниях является TDP-43, белок, связывающий нуклеиновые кислоты, участвующий в нескольких стадиях обработки РНК^3,4,5. Хотя мутации в TDP-43 затрагивают только 3-5% пациентов, белок TDP-43 дикого типа обнаруживается в цитоплазматических агрегатах в >97% случаев БАС (рассмотрен в^6). Эта патология была смоделирована у дрозофилы путем сверхэкспрессии человеческого дикого типа или мутантного TDP-43 (G298S) в двигательных нейронах, который рекапитулирует множественные аспекты БАС, включая цитоплазматические включения, двигательную дисфункцию и снижение продолжительности жизни^7,8. Используя эти модели, недавно сообщалось, что протеинопатия TDP-43 вызывает значительное повышение уровня пирувата и мРНК фосфофруктокиназы (PFK), ограничивающего скорость фермента гликолиза^9. Аналогичное увеличение транскриптов PFK было обнаружено в производных от пациента двигательных нейронах и спинном мозге, что свидетельствует о том, что гликолиз повышается в контексте протеинопатии TDP-43. Интересно, что дальнейшее увеличение гликолиза с использованием диетических и генетических манипуляций смягчило несколько фенотипов БАС, таких как двигательная дисфункция и увеличение продолжительности жизни в моделях протеинопатии TDP-43, что согласуется с компенсаторным, нейропротекторным механизмом в дегенерирующих двигательных нейронах.

Для дальнейшего исследования изменений в гликолизе и измерения поглощения глюкозы в моделях дрозофилы протеинопатии TDP-43 ранее зарегистрированный генетически закодированный датчик на основе FRET FLII12Pglu-700μδ6¹⁰ был экспрессирован в двигательных нейронах, специально используя систему экспрессии UAS-GAL4. Датчик глюкозы FLII12Pglu-700μδ6 использует резонансный перенос энергии между двумя вариантами зеленого флуоресцентного белка, голубых и желтых флуоресцентных белков (CFP и YFP) для обнаружения глюкозы на клеточном уровне. Он состоит из бактериального глюкозосвязывающего домена из гена E. coli MglB, слитого с CFP и YFP на противоположных концах молекулы. При связывании с молекулой глюкозы датчик претерпевает конформационное изменение, сближающее CFP и YFP и позволяющее возникать FRET, которое затем может быть использовано для количественной оценки внутриклеточных уровней глюкозы^10,11,12 (рисунок 1). Здесь мы покажем, как датчик FLII12Pglu-700μδ6 может быть использован для определения изменений в поглощении глюкозы, вызванных протеинопатией TDP-43 в двигательных нейронах. Эксперименты, описанные здесь, показывают, что сверхэкспрессия мутанта, связанного с БАС, TDP-43^G298S,в двигательных нейронах вызывает значительное увеличение поглощения глюкозы по сравнению с контрольной группой. Этот подход может быть использован в других типах БАС (например, SOD1, C9orf72 и т.д.) и/или других типах клеток (например, глия, мышцы) для определения изменений в поглощении глюкозы, связанных с нейродегенерацией.

протокол

Трансгенные мухи UAS FLII12Pglu-700μδ6 были зарегистрированы в Volkenhoff et al.¹⁰ и любезно предоставлены доктором С. Ширмайером. Трансгенные линии UAS TDP-43^G298S были любезно предоставлены доктором Т. Ивацубо^13. Рекомбинантные линии Drosophila, содержащие трансгены UAS FLII12Pglu-700μδ6 и UAS TDP-43, были сгенерированы в лаборатории Zarnescu с использованием стандартных генетических подходов и сообщены в Manzo et al.^9. D42 GAL4 использовался для управления экспрессией датчика глюкозы отдельно или вместе с TDP-43^G298S в двигательных нейронах. Все линии мух поддерживаются на мелассе кукурузной муки при 25 °C в 12-часовом цикле темный:светлый.

1. Рассечение дрозофилы вентрального нервного нерва (VNC)

1. Сделайте силиконовую эластомерную рассеченную посуду.
   1. Налейте силиконовые эластомерные компоненты в трубку объемом 50 мл, как указано в протоколе производителя, и хорошо перемешайте.
   2. Наполните 35 мм посуду для посева тканей примерно 2 мл эластомерной смеси. Используйте шприц, чтобы удалить пузырьки. Накройте посуду и поместите ее на ровную поверхность в духовку с температурой 60 °C на ночь, чтобы вылечить.
2. Рассекайте личинок Drosophila, чтобы обнажить VNC при сохранении жизнеспособности тканей.
   1. Соберите блуждающую третью личинку звезды, промойте ddH₂O, а затем поместите ее в каплю HL3-буфера (70 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 20 мМ MgCl_2,10 мМ NaHCO_3,115 мМ сахарозы, 5 мМ трегалозы, 5 мМ HEPES; рН 7,1) на блюде с эластомерной подкладкой.
   2. Используя пару щипцов (No 5 или 55 щипцов) под рассекающим микроскопом, прижмите передний и задний концы спинной стороны личинки вверх, осторожно растягивая личинку вдоль с помощью булавок насекомых (Minutein Pins).
   3. Сделайте разрез чуть выше задней булавки, используя пару наклонных ножниц для радужной оболочки. Сделайте вертикальный разрез, начиная от разреза по направлению к переднему концу личинки.
   4. При необходимости добавьте несколько капель буфера HL-3. Удалите трахею и остальные плавающие органы, не нарушая ЦНС. Закрепите лоскуты, растягивающие стенку тела, чтобы обнажить ЦНС, сохраняя при этом нервно-мышечную систему (VNC, аксоны и нервно-мышечные соединения) неповрежденной.

2. Получение изображений

1. Оптимизируйте параметры изображения.
   1. Включите микроскоп и лазеры перед началом вскрытия. Изображения должны быть получены с помощью вертикального конфокального микроскопа с 40-кратной линзой погружения в воду. Используйте 405-нм лазер для возбуждения CFP и получения изображений в каналах обнаружения CFP (465-499 нм) и FRET (535-695 нм).
   2. Оптимизируйте параметры сбора, такие как скорость сканирования (6), среднее (2), объектив (40x), масштабирование (1x), размер точечного отверстия (1 а.е.) и пространственное разрешение (512 x 512). Отрегулируйте коэффициент усиления таким образом, чтобы сигнал находился в оптимальном динамическом диапазоне. Одни и те же параметры должны использоваться для всех генотипов.
2. Изображение двигательных нейронов в VNC.
   1. Поместите силиконовую посуду с рассеченным образцом под линзу. Опустите линзу так, чтобы она соприкасалась с буфером трегалозы-сахарозы HL3 (см. 1.2.1). Очень важно убедиться, что объектив полностью погружен в буфер. При необходимости добавьте дополнительный буфер.
   2. Используйте каналы CFP и FRET, чтобы вручную выбрать оптический участок, который состоит по крайней мере из 6 моторных нейронов в фокусе, расположенных вдоль средней линии VNC. Двигательные нейроны идентифицируются на основе экспрессии датчика глюкозы и положения вдоль передне-задней оси.
   3. Получайте изображения каждые 10 с в течение 10 минут. Эти изображения представляют базовую линию.
3. Стимулируют с помощью глюкозы, дополненной HL-3.
   1. Удалите трегалозу-сахарозу, содержащую HL3-буфер, с помощью пипетки Пастера и замените ее 5 мМ глюкозы с добавлением HL-3 (70 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 20 мМ MgCl_2,10 мМ NaHCO_3,115 мМ сахарозы, 5 мМ глюкозы, 5 мМ HEPES, рН 7,1). Этот шаг нужно выполнять с большой осторожностью, чтобы максимально избежать движения ВНК.
   2. Получайте изображения каждые 10 с в течение еще 10 минут. Эти изображения представляют фазу стимуляции.
4. Сохраните изображения в виде файлов .czi или любого типа файлов, поддерживаемого программным обеспечением для обработки изображений, с именем файла, включая дату, генетический фон, экспериментальное состояние (базовый уровень или стимуляция) и используемые каналы.
5. Повторно используйте параметры для изображения всех генотипов(рисунок 2A).

3. Обработка изображений и выбор ROI

1. Откройте файлы czi в Fiji/ImageJ и установите цветовой режим: оттенки серого,выберите View Stack with: Hyperstackи выберите Разделить каналы на отдельные окна.
2. Обрабатывайте изображения с помощью плагинов коррекции дрейфа: turboreg и stackreg. Каждый канал исправляется отдельно, выбрав Stackreg в разделе Плагины,а затем выбрав Трансформация: Перевод.
3. Вручную выберите интересующие регионы (ROI), чтобы извлечь среднее значение серого цвета для каждого канала.
   1. Выберите РЕНТАБЕЛЬНОСТЬ инвестиций, отслеживая все двигательные нейроны, которые остаются в фокусе в течение всего временного ряда. Используйте менеджер ROI для сохранения контура каждого двигательного нейрона.
   2. Используйте функцию Multi-measure для измерения среднего значения серого цвета в каждом ROI в каждый момент времени. Скопируйте ROI, отслеживаемые от первого канала ко второму каналу для изображения перед стимуляцией.
   3. Повторите этот процесс для изображений постстимуляции в каждом канале, используя те же клетки/ROI, выбранные для изображения до стимуляции.

4. Анализ данных

1. Рассчитайте соотношение FRET/CFP, используя средние значения серого цвета для каналов FRET и CFP. Изменения в соотношении FRET/CFP отражают изменения внутриклеточной концентрации глюкозы.
   1. Построение соотношений FRET/CFP для каждой рентабельности инвестиций и точки времени в зависимости от времени. В каждом VNC некоторые из ROI будут демонстрировать снижение соотношения FRET / CFP после стимуляции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это интерпретируется как неспособность некоторых нейронов поглощать глюкозу, возможно, из-за стресса, вызванного рассечениями, и поэтому исключаются из анализа. Остальные соотношения FRET/CFP для каждого ROI и временной точки усредняются для получения одного соотношения FRET/CFP на точку времени на генотип (только датчик глюкозы и датчик глюкозы с TDP-43^G298S). Эти единичные соотношения FRET/CFP используются для всех последующих нормализаций. 31 ROI были проанализированы для элементов управления датчиками глюкозы и 24 ROI были проанализированы для TDP-43^G298S.
2. Базовая нормализация: Рассчитайте среднее значение соотношений FRET/CFP за первые 10 мин (исходный уровень), а затем нормализуйте отдельные соотношения FRET/CFP для каждой временной точки всего эксперимента до 10-минутного базового среднего значения (см. Рисунок 2B).
3. Нормализация точки времени: Нормализуйте отношение TDP-43^G298S FRET/CFP к соотношению FRET/CFP только с помощью датчика глюкозы в каждой точке времени (см. Рисунок 3A).
4. Гистограммы: Для сравнения исходного уровня и стимуляции в виде гистограмм используйте соотношения FRET/CFP от 5-10 мин (исходный уровень) и 15-20 мин (стимуляция) для каждого генотипа. Нормализуйте отношение стимуляции к базовому соотношению (см. рисунок 3B).

5. Статистический анализ

1. Оцените нормализованные наборы данных с помощью коррекции Манна-Уитни (для нормализации исходного уровня и временных точек) или теста Крусколла-Валиса (для гистограммного представления стимуляции по сравнению с базовыми соотношениями FRET/CFP).

Результаты

Получение изображения датчика глюкозы в вентральном нервном канатике (VNC), ex vivo
Для определения различий в поглощении глюкозы в модели дрозофилы БАС на основе TDP-43 был использован генетически закодированный датчик глюкозы на основе FRET. Датчик содержал CFP и ...

Обсуждение

Метод, подробно описанный здесь, может быть применен для измерения поглощения глюкозы в определенном типе клеток, представляющих интерес для живой дрозофилы, с использованием FLII12Pglu-700μδ6, датчика на основе FRET, который может обнаруживать изменения уровня глюкозы в миллимолярном^?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm tissue culture dishes	Sigma Aldrich	CLS430165
40X water immersion lens	Zeiss	440090	dippable, N.A. 0.8
dissection scissors	Roboz	RS-5618
Dumont #5 forceps	VWR	100189-236
Dumont #55 forceps	VWR	100189-244
Minutien pins	Fine Science tools	26002-10	used for dissections
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	Dow	1317318
Zeiss LSM880 NLO upright multiphoton/confocal microscope	Zeiss	N/A