Mesure de l’absorption du glucose dans les modèles de drosophile de la protéopathie TDP-43

Résumé

L’absorption du glucose est augmentée dans les motoneurones de la drosophile affectés par la protéinopathie de la protéine de liaison à l’ADN TAR (TDP-43), comme l’indique un capteur de glucose génétiquement codé à base de FRET.

Résumé

La sclérose latérale amyotrophique est une maladie neurodégénérative provoquant une faiblesse musculaire progressive et la mort dans les 2 à 5 ans suivant le diagnostic. Les manifestations cliniques comprennent la perte de poids, la dyslipidémie et l’hypermétabolisme; cependant, on ne sait toujours pas comment ceux-ci sont liés à la dégénérescence des motoneurones. En utilisant un modèle de drosophile de la protéopathie TDP-43 qui récapitule plusieurs caractéristiques de la SLA, y compris les inclusions cytoplasmiques, le dysfonctionnement locomoteur et la durée de vie réduite, nous avons récemment identifié de vastes déficits métaboliques. Parmi ceux-ci, la glycolyse s’est avérée être régulée à la hausse et les expériences d’interaction génétique ont fourni des preuves d’un mécanisme neuroprotecteur compensatoire. En effet, malgré la régulation à la hausse de la phosphofructokinase, l’enzyme limitant le taux dans la glycolyse, il a été démontré qu’une augmentation de la glycolyse à l’aide de manipulations alimentaires et génétiques atténuait le dysfonctionnement locomoteur et augmentait la durée de vie dans les modèles de mouches de la protéinopathie TDP-43. Pour étudier plus avant l’effet de la protéinopathie TDP-43 sur le flux glycolytique dans les motoneurones, un capteur à base de FRET génétiquement codé précédemment, FLII12Pglu-700μδ6, a été utilisé. Ce capteur est composé d’un domaine de détection du glucose bactérien et de protéines fluorescentes cyan et jaunes comme la paire FRET. Lors de la liaison au glucose, le capteur subit un changement conformationnel permettant à FRET de se produire. En utilisant FLII12Pglu-700μδ6, l’absorption de glucose s’est avérée significativement augmentée dans les motoneurones exprimant TDP-43^G298S, une variante causant la SLA. Ici, nous montrons comment mesurer l’absorption de glucose, ex vivo,dans les préparations larvaires du cordon nerveux ventral exprimant le capteur de glucose FLII12Pglu-700μδ6 dans le contexte de la protéinopathie TDP-43. Cette approche peut être utilisée pour mesurer l’absorption du glucose et évaluer le flux glycolytique dans différents types de cellules ou dans le contexte de diverses mutations causant la SLA et les troubles neurodégénératifs connexes.

Introduction

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative progressive qui est actuellement incurable. La SLA affecte les motoneurones supérieurs et inférieurs entraînant une perte de coordination motrice, une paralysie irréversible, une insuffisance respiratoire et la mort éventuelle dans les 2 à 5 ans suivant le diagnostic^1. La SLA est associée à des défauts métaboliques tels que la perte de poids, la dyslipidémie et l’hypermétabolisme (examinés en^2); cependant, on ne sait toujours pas comment ces altérations du métabolisme sont liées à la dégénérescence des motoneurones. Un dénominateur commun dans la SLA et les maladies neurodégénératives connexes est le TDP-43, une protéine de liaison aux acides nucléiques impliquée dans plusieurs étapes du traitement de l’ARN^3,4,5. Bien que les mutations du TDP-43 n’affectent que 3% à 5% des patients, la protéine TDP-43 de type sauvage se trouve dans les agrégats cytoplasmiques dans >97% des cas de SLA (examinés dans⁶). Cette pathologie a été modélisée chez la drosophile par surexpression de type sauvage humain ou de TDP-43 mutant (G298S) dans les motoneurones, qui récapitule de multiples aspects de la SLA, notamment les inclusions cytoplasmiques, le dysfonctionnement locomoteur et la durée de vie réduite^7,8. En utilisant ces modèles, il a été récemment rapporté que la protéinopathie TDP-43 provoque une augmentation significative des niveaux de pyruvate et d’ARNm phosphofructokinase (PFK), l’enzyme limitant le taux de glycolyse⁹. Des augmentations similaires des transcriptions de PFK ont été trouvées dans les motoneurones et la moelle épinière dérivés du patient, suggérant que la glycolyse est régulée à la hausse dans le contexte de la protéinopathie TDP-43. Fait intéressant, une augmentation supplémentaire de la glycolyse à l’aide de manipulations alimentaires et génétiques a atténué plusieurs phénotypes de la SLA tels que le dysfonctionnement locomoteur et l’augmentation de la durée de vie dans les modèles de mouche de la protéinopathie TDP-43, compatible avec un mécanisme neuroprotecteur compensatoire dans les motoneurones en dégénérescence.

Pour sonder davantage les changements dans la glycolyse et mesurer l’absorption du glucose dans les modèles de drosophile de la protéinopathie TDP-43, un capteur à base de FRET génétiquement codé précédemment FLII12Pglu-700μδ6¹⁰ a été exprimé dans les motoneurones spécifiquement en utilisant le système d’expression UAS-GAL4. Le capteur de glucose FLII12Pglu-700μδ6 utilise le transfert d’énergie par résonance entre deux variantes de protéines fluorescentes vertes, les protéines fluorescentes cyan et jaunes (CFP et YFP) pour détecter le glucose au niveau cellulaire. Il s’agit d’un domaine de liaison au glucose bactérien du gène E. coli MglB fusionné à CFP et YFP aux extrémités opposées de la molécule. Lorsqu’il est lié à une molécule de glucose, le capteur subit un changement conformationnel rapprochant CFP et YFP et permettant à FRET de se produire, qui peut ensuite être utilisé pour quantifier les niveaux de glucose intracellulaire^10,11,12 ( Figure1). Ici, nous montrons comment le capteur FLII12Pglu-700μδ6 peut être utilisé pour déterminer les changements dans l’absorption du glucose causés par la protéinopathie TDP-43 dans les motoneurones. Les expériences décrites ici montrent que la surexpression d’un mutant associé à la SLA, TDP-43^G298S,dans les motoneurones provoque une augmentation significative de l’absorption de glucose par rapport aux témoins. Cette approche peut être utilisée dans d’autres types de SLA (p. ex. SOD1, C9orf72, etc.) et/ou d’autres types de cellules (p. ex. glie, muscles) pour déterminer les changements dans l’absorption du glucose associés à la neurodégénérescence.

Protocole

Les mouches transgéniques UAS FLII12Pglu-700μδ6 ont été signalées dans Volkenhoff et al.¹⁰ et aimablement fournies par le Dr S. Schirmeier. Les lignées transgéniques UAS TDP-43^G298S ont été aimablement fournies par le Dr T. Iwatsubo^13. Des lignées recombinantes de drosophiles abritant à la fois des transgènes UAS FLII12Pglu-700μδ6 et UAS TDP-43 ont été générées dans le laboratoire Zarnescu en utilisant des approches génétiques standard et rapportées dans Manzo et al.⁹. D42 GAL4 a été utilisé pour piloter l’expression du capteur de glucose seul ou avec TDP-43^G298S dans les motoneurones. Toutes les lignes de mouche sont maintenues sur des milieux de semoule de maïs à la mélasse, à 25 °C en 12 h de cycle sombre/lumière.

1. Dissections du cordon nerveux ventral de la drosophile (VNC)

1. Fabriquez des plats de dissection en élastomère de silicone.
   1. Versez les composants en élastomère de silicone dans un tube de 50 mL comme indiqué dans le protocole du fabricant et remuez bien.
   2. Remplir des boîtes de culture tissulaire de 35 mm avec environ 2 mL du mélange d’élastomères. Utilisez une seringue pour enlever les bulles. Couvrir les plats et les placer sur une surface plane dans un four à 60 °C pendant la nuit pour durcir.
2. Disséquez les larves de drosophiles pour exposer le VNC tout en maintenant la viabilité des tissus.
   1. Recueillir une larve errante du troisième stade, rincer avec ddH₂O, puis la placer dans une goutte de tampon HL3 (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MgCl_2,10 mM NaHCO_3,115 mM de saccharose, 5 mM de tréhalose, 5 mM HEPES; pH 7,1) sur un plat tapissé d’élastomère.
   2. À l’aide d’une paire de pinces (#5 ou 55 forceps) sous un microscope à dissection, épinglez les extrémités antérieure et postérieure de la larve dorsale vers le haut, en étirant soigneusement la larve dans le sens de la longueur avec des épingles à insectes (Minutein Pins).
   3. Faites une incision juste au-dessus de l’épingle postérieure à l’aide d’une paire de ciseaux à iris inclinés. Faites une coupe verticale à partir de l’incision vers l’extrémité antérieure de la larve.
   4. Ajoutez quelques gouttes de tampon HL-3 si nécessaire. Retirez la trachée et le reste des organes flottants sans perturber le SNC. Épinglez les volets qui étirent la paroi corporelle pour exposer le SNC tout en gardant le système neuromusculaire (VNC, axones et jonctions neuromusculaires) intact.

2. Acquisition d’images

1. Optimisez les paramètres d’imagerie.
   1. Allumez le microscope et les lasers avant de commencer les dissections. Les images doivent être acquises à l’aide d’un microscope confocal vertical avec une lentille d’immersion dans l’eau 40x. Utilisez un laser de 405 nm pour exciter la CFP et acquérir les images dans les canaux de détection CFP (465-499 nm) et FRET (535-695 nm).
   2. Optimisez les paramètres d’acquisition tels que la vitesse de numérisation (6), la moyenne (2), l’objectif (40x), le zoom (1x), la taille du sténopé (1 UA) et la résolution spatiale (512 x 512). Ajustez le gain de manière à ce que le signal se trouve dans la plage dynamique optimale. Les mêmes paramètres doivent être utilisés pour tous les génotypes.
2. Image des motoneurones au sein du VNC.
   1. Placez le plat en silicone avec l’échantillon disséqué sous la lentille. Abaissez la lentille de manière à ce qu’elle entre en contact avec le tampon HL3 tréhalose-saccharose (voir 1.2.1). Il est essentiel de s’assurer que la lentille est complètement immergée dans le tampon. Ajoutez plus de tampon si nécessaire.
   2. Utilisez les canaux CFP et FRET pour sélectionner manuellement une section optique composée d’au moins 6 motoneurones au point, situés le long de la ligne médiane VNC. Les motoneurones sont identifiés en fonction de l’expression du capteur de glucose et de la position le long de l’axe antérieur-postérieur.
   3. Acquérir des images toutes les 10 s pendant 10 min. Ces images représentent la ligne de base.
3. Stimuler avec du glucose supplémenté HL-3.
   1. Retirer le tréhalose-saccharose contenant un tampon HL3 à l’aide d’une pipette Pasteur et le remplacer par du HL-3 supplémenté de glucose de 5 mM (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MgCl_2,10 mM NaHCO_3,115 mM de saccharose, 5 mM de glucose, 5 mM HEPES, pH 7,1). Cette étape doit être effectuée avec le plus grand soin, afin d’éviter autant que possible le mouvement du VNC.
   2. Acquérez des images toutes les 10 s pendant 10 minutes supplémentaires. Ces images représentent la phase de stimulation.
4. Enregistrez les images en tant que fichiers .czi ou tout type de fichier pris en charge par le logiciel d’imagerie avec un nom de fichier comprenant la date, le fond génétique, l’état expérimental (ligne de base ou stimulation) et les canaux utilisés.
5. Réutilisez les paramètres pour imager tous les génotypes (Figure 2A).

3. Traitement de l’image et sélection du retour sur investissement

1. Ouvrez les fichiers czi dans Fiji/ImageJ et définissez Mode couleur: Niveaux de gris,choisissez Afficher la pile avec : Hyperstack, et sélectionnez Diviser les canaux en fenêtres séparées.
2. Traitez les images à l’aide des plugins de correction de dérive: turboreg et stackreg. Chaque canal est corrigé séparément en sélectionnant Stackreg sous Plugins, puis choisissez Transformation: Translation.
3. Sélectionnez manuellement les régions d’intérêt (ROI) pour extraire la valeur grise moyenne de chaque canal.
   1. Choisissez les ROI en traçant tous les motoneurones qui restent au centre de l’attention sur toute la série chronologique. Utilisez le gestionnaire de retour sur investissement pour enregistrer chaque contour de motoneurone.
   2. Utilisez la fonction Multi-mesure pour mesurer la valeur grise moyenne dans chaque retour sur investissement à chaque point temporel. Copiez les retours sur investissement tracés du premier canal vers le deuxième canal pour l’image de pré-stimulation.
   3. Répétez ce processus pour les images post-stimulation dans chaque canal en utilisant les mêmes cellules/ROI sélectionnés pour l’image de pré-stimulation.

4. Analyse des données

1. Calculez le rapport FRET/CFP en utilisant les valeurs grises moyennes pour les canaux FRET et CFP. Les changements dans les rapports FRET/CFP reflètent des altérations de la concentration intracellulaire de glucose.
   1. Tracez les ratios FRET/CFP pour chaque retour sur investissement et point de temps par rapport au temps. Dans chaque VNC, certains des ROI présenteront une baisse des rapports FRET/CFP après la stimulation.
      REMARQUE: Ceci est interprété comme une incapacité de certains neurones à absorber le glucose, peut-être en raison du stress causé par des dissections et sont donc éliminés de l’analyse. Les rapports FRET/CFP restants pour chaque ROI et point de temps sont moyennés pour générer un seul rapport FRET/CFP par point de temps et par génotype (capteur de glucose seul et capteur de glucose avec TDP-43^G298S). Ces rapports FRET/CFP uniques sont utilisés pour toutes les normalisations ultérieures. 31 ROI ont été analysés pour les contrôles des capteurs de glucose et 24 ROI ont été analysés pour le TDP-43^G298S.
2. Normalisation de base : calculez la moyenne des rapports FRET/CFP pendant les 10 premières minutes (ligne de base), puis normalisez les rapports FRET/CFP individuels pour chaque point temporel de l’ensemble de l’expérience à la moyenne de référence de 10 minutes (voir Figure 2B).
3. Normalisation des points temporels : Normalisez les rapports FRET/CFP TDP-43^G298S par rapport aux rapports FRET/CFP à partir du capteur de glucose seul à chaque point temporel (voir Figure 3A).
4. Graphiques à barres : Pour les comparaisons entre les lignes de base et la stimulation sous forme de graphiques à barres, utilisez des rapports FRET/CFP de 5 à 10 minutes (ligne de base) et de 15 à 20 minutes (stimulation) pour chaque génotype. Normaliser le rapport de stimulation par rapport au rapport de référence (voir la figure 3B).

5. Analyses statistiques

1. Évaluez les ensembles de données normalisées à l’aide de la correction de Mann-Whitney (pour les normalisations de base et de points temporels) ou du test de Kruskall-Walis (pour la représentation graphique à barres de la stimulation par rapport aux rapports FRET/CFP de base).

Résultats

Acquisition d’images du capteur de glucose dans le cordon nerveux ventral (VNC), ex vivo
Pour déterminer les différences dans l’absorption du glucose dans un modèle de drosophile de la SLA basé sur le TDP-43, un capteur de glucose à base de FRET génétiquement codé a été utilisé. Le capteur comprenait CFP et YFP fusionnés au domaine de liaison au glucose à partir du gène E. coli MglB. La liaison au glucose provoque un changement conformati...

Discussion

La technique décrite en détail ici peut être appliquée pour mesurer l’absorption du glucose dans un type cellulaire spécifique d’intérêt chez la drosophile vivante en utilisant FLII12Pglu-700μδ6, un capteur basé sur FRET qui peut détecter les changements dans les niveaux de glucose à une gamme millimolaire^10,11,12. Ce capteur a déjà été utilisé en conjonction avec le système UAS-GAL4 pour cibler so...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm tissue culture dishes	Sigma Aldrich	CLS430165
40X water immersion lens	Zeiss	440090	dippable, N.A. 0.8
dissection scissors	Roboz	RS-5618
Dumont #5 forceps	VWR	100189-236
Dumont #55 forceps	VWR	100189-244
Minutien pins	Fine Science tools	26002-10	used for dissections
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	Dow	1317318
Zeiss LSM880 NLO upright multiphoton/confocal microscope	Zeiss	N/A