TDP-43 단백질 요법의 드로소필라 모델에서 포도당 섭취 측정

요약

포도당 섭취량은 FRET 기반의 유전자 인코딩 된 포도당 센서에 의해 표시된 바와 같이 TAR DNA 결합 단백질 (TDP-43) 단백질 병증에 의해 영향을받는 Drosophila 운동 뉴런에서 증가합니다.

초록

근위축성 측삭 경화증은 진단 후 2-5 년 이내에 진보적 인 근육 약점과 죽음을 일으키는 신경 퇴행성 질환입니다. 임상 증상은 체중 감소를 포함, 이상 지질 혈 증, 그리고 과대사; 그러나, 이러한 모터 뉴런 변성에 어떻게 관련 되어 불분명 남아. 세포질 내재, 운동 장애 및 수명 감소를 포함한 ALS의 여러 특징을 재구성하는 TDP-43 단백질 요법의 Drosophila 모델을 사용하여, 우리는 최근에 광범위한 신진 대사 적자를 확인했습니다. 이들 중, 글리코리시스는 조절되고 유전적 상호작용 실험이 보상 신경보호 메커니즘에 대한 증거를 제공하는 것으로 밝혀졌다. 실제로, 인산화루크토키나아제의 강화 규제에도 불구하고, 글리코리시스의 효소를 제한하는 속도, 식이 및 유전 적 조작을 이용한 글리코리시스의 증가는 TDP-43 단백질 요법의 비행 모델에서 운동 기능 장애 및 증가수명을 완화하는 것으로 나타났다. 모터 뉴런의 글리코리틱 플럭스에 대한 TDP-43 단백질 요법에 대한 효과를 더욱 조사하기 위해 이전에 보고된 유전자 인코딩, FRET 기반 센서, FLII12Pglu-700μδ6이 사용되었다. 이 센서는 FRET 쌍으로 세균성 포도당 감지 도메인및 시안 및 황형 광성 단백질로 구성됩니다. 포도당 결합시 센서는 FRET가 발생할 수 있도록 형성적 변화를 겪습니다. FLII12Pglu-700μδ6를 사용하여, 포도당 섭취량은 TDP-43^G298S,ALS를 유발하는 변형을 발현하는 운동 뉴런에서 현저하게 증가하는 것으로 나타났다. 여기서, TDP-43 단백질요법의 맥락에서 포도당 센서 FLII12Pglu-700δ6을 발현하는 애벌레 복부 신경코드 제제에서 포도당 통풍구, ex vivo를측정하는 방법을 보여 준다. 이 접근법은 포도당 섭취량을 측정하고 다른 세포 유형또는 ALS 및 관련 신경 퇴행성 질환을 일으키는 다양한 돌연변이의 맥락에서 글리코리틱 플럭스를 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

서문

근위축성 측삭 경화증 (ALS)은 현재 불치의 진보적 인 신경 퇴행성 질환입니다. ALS는 진단^1의2-5 년 안에 운동 조정, 돌이킬 수 없는 마비, 호흡 부전 및 최종 죽음의 손실로 이끌어 내는 상부 및 하부 운동 뉴런에 영향을 미칩니다. ALS는 체중 감소, 이상지질혈증 및 과대사와 같은 신진 대사 결함과 관련이 있습니다^(2에서검토됨); 그러나, 그것은 어떻게 신진 대사에 이러한 변경 모터 뉴런 변성관련 불분명 남아. ALS 및 관련 신경퇴행성 질환에서 흔히 발생하는 분모는 TDP-43, RNA처리^3,4,5의여러 단계에 관여하는 핵산 결합 단백질이다. TDP-43에 있는 돌연변이는 환자의 3%-5%에 영향을 미치지만, 야생 형 TDP-43 단백질은 ALS 케이스의 >97%에서 세포질 집계 에서 발견됩니다^(6에서검토). 이 병리학은 세포질 포함, 운동 기능 장애 및 감소^수명을포함하여 ALS의 여러 측면을 재구성하는 모터 뉴런에서 인간 야생형 또는 돌연변이 TDP-43 (G298S)의 과발현에 의해 드로소필라에서 모델링되었다^7,8. 이러한 모델을 이용하여, 최근에는 TDP-43 단백질요법이 피루바테 수준및 인포스포프락토키나아제(PFK) mRNA, 글리코리시스^9의속도 제한 효소의 상당한 증가를 야기한다고 보고되었다. PFK 성적증명서의 유사한 증가는 환자 유래 운동 뉴런과 척수에서 발견되었으며, 이는 당해가 TDP-43 단백질 요법의 맥락에서 강화된다는 것을 시사한다. 흥미롭게도, 식이 및 유전 조작을 이용한 글리코리시스의 추가 증가는 운동 신경을 퇴행성화하는 보상, 신경 보호 메커니즘과 일치하여 TDP-43 단백질 요법의 플라이 모델에서 운동 기능 장애 및 증가수명과 같은 여러 ALS 표현형을 완화시켰습니다.

TDP-43 단백병증의 드로소필라 모델에서 글리코리시스의 변화를 더욱 조사하고 포도당 섭취를 측정하기 위해 이전에 보고된 유전자 인코딩 된 FRET 계 센서 FLII12Pglu-700μδ6^10은 UAS-GAL4 발현 시스템을 사용하여 모터 뉴런으로 발현되었다. FLII12Pglu-700μδ6 포도당 센서는 녹색 형광 단백질, 시안 및 황형 단백질(CFP 및 YFP)의 두 가지 변이체 간의 공명 에너지 전달을 사용하여 세포 수준에서 포도당을 검출합니다. 분자의 반대쪽 끝에 CFP 및 YFP에 융합된 대장균 MglB 유전자로부터 세균성 포도당 결합 도메인으로 구성된다. 포도당 분자에 바인딩될 때, 센서는 CFP와 YFP를 더 가깝게 가져오고 FRET가 생기도록 허용하는 형성 변화를 겪으며, 이는 세포내 포도당 수준^10,11,12(도 1)를정량화하는 데 사용될 수 있다. 여기서, 우리는 FLII12Pglu-700μδ6 센서가 모터 뉴런에서 TDP-43 단백질 요법에 의한 포도당 섭취의 변화를 결정하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 를 보여줍니다. 여기에 설명된 실험은 운동 뉴런에서 ALS 관련 돌연변이, TDP-43^G298S의과발현이 대조군에 비해 포도당 섭취량이 현저하게 증가한다는 것을 보여준다. 이 접근법은 다른 유형의 ALS(예를 들어, SOD1, C9orf72 등) 및/또는 다른 세포 유형(예: 신경변성과 관련된 포도당 섭취의 변화를 결정하기 위해 사용될 수 있다).

프로토콜

UAS FLII12Pglu-700μδ6 형질식 파리는 볼켄호프 외^10에서 보고되었으며 S. Schirmeier 박사가 친절하게 제공했습니다. UAS TDP-43^G298S 형질전환라인은 T. 이왓츠보¹³박사가 친절하게 제공했습니다. UAS FLII12Pglu-700μmδ6 및 UAS TDP-43 전염을 모두 수용하는 재조합 드로소필라 라인은 표준 유전적 접근법을 사용하여 자르네스쿠 실험실에서 생성되어 만조 외^9에서보고되었다. D42 GAL4는 운동 뉴런에서 TDP-43^G298S와 함께 포도당 센서의 발현을 단독으로 또는 함께 구동하는 데 사용되었습니다. 모든 플라이 라인은 12h 다크:라이트 사이클에서 25°C에서 당밀 옥수수 밀 매체에 유지됩니다.

1. 드로소필라 복부 신경 코드 (VNC) 해부

1. 실리콘 엘라스토머 해부 접시를 만듭니다.
   1. 실리콘 엘라스토머 부품을 제조업체의 프로토콜에 표시된 대로 50mL 튜브에 붓고 잘 저어줍니다.
   2. 35mm 조직 배양 접시에 약 2mL의 천골혼합물을 채웁니다. 주사기를 사용하여 거품을 제거합니다. 접시를 덮고 밤새 60°C 오븐에 수평 표면에 놓아 치료하십시오.
2. 조직 생존가능성을 유지하면서 VNC를 노출하는 드로소필라 애벌레를 해부한다.
   1. 방황 하는 세 번째 인스타 애벌레를 수집, ddH₂O와 린스, HL3 버퍼 (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MgCl_2,10 mM NaHCO_3,115 mM trehalose, 5 mM pes HE; pH 7.1) 안 감선 에.
   2. 해부 현미경으로 한 쌍의 집게(#5 또는 55 포셉)를 사용하여 애벌레 등쪽의 전방 및 후방 끝을 위로 고정하고, 애벌레 핀(Minutein Pins)으로 길게 뻗어 조심스럽게 스트레칭합니다.
   3. 각진 홍채 가위를 사용하여 후방 핀 바로 위에 절개를 합니다. 절개에서 시작하여 애벌레의 전방 끝으로 수직 절단을 합니다.
   4. 필요한 경우 HL-3 버퍼 몇 방울을 추가합니다. CNS를 방해하지 않고 기관및 부동 장기의 나머지 부분을 제거합니다. 신경 근육 시스템 (VcNC, 축축산 및 신경 근육 접합)을 그대로 유지하면서 CNS를 노출하기 위해 신체 벽을 스트레칭 플랩을 고정하십시오.

2. 이미지 수집

1. 이미징 매개 변수를 최적화합니다.
   1. 해부를 시작하기 전에 현미경과 레이저를 켭니다. 이미지는 40배 의 물 침수 렌즈가 있는 수직 공초점 현미경을 사용하여 획득해야 합니다. 405nm 레이저를 사용하여 CFP(465-499 nm)와 FRET(535-695 nm) 검출 채널 모두에서 이미지를 획득한다.
   2. 스캔 속도(6), 평균(2), 목표(40배), 줌(1배), 핀홀 크기(1AU), 공간 해상도(512 x 512)와 같은 획득 매개 변수를 최적화합니다. 신호가 최적의 동적 범위에 있도록 게인을 조정합니다. 모든 유전자형에 동일한 매개 변수를 사용해야 합니다.
2. VNC 내의 이미지 모터 뉴런.
   1. 렌즈 아래에 해부 된 샘플과 실리콘 접시를 놓습니다. 레할로오스-자크로스 HL3 버퍼와 접촉할 수 있도록 렌즈를 낮춥니다(1.2.1 참조). 렌즈가 버퍼에 완전히 침수되도록 하는 것이 중요합니다. 필요한 경우 버퍼를 더 추가합니다.
   2. CFP 및 FRET 채널을 사용하여 VNC 미드라인을 따라 최소 6개의 모터 뉴런으로 구성된 광학 섹션을 수동으로 선택합니다. 모터 뉴런은 전방 후방 축을 따라 포도당 센서 및 위치의 발현에 기초하여 확인된다.
   3. 10초마다 10분마다 이미지를 수집합니다. 이러한 이미지는 기준선을 나타냅니다.
3. 포도당 보충 HL-3로 자극.
   1. 파스퇴르 파이펫을 사용하여 HL3 버퍼를 함유한 트레할로오스-자당을 제거하고 5mM 포도당 보충 HL-3(70mM NaCl, 5mM KCl, 20mM MgCl_2,10mM NaHCO_3,115m MM 포도당, 5mM) HE, pH 7.1)로 대체한다. 이 단계는 VNC의 움직임을 최대한 피하기 위해 세심한 주의를 기울여 수행해야합니다.
   2. 10초마다 10초마다 이미지를 획득하여 10분 간 이미지를 수집합니다. 이러한 이미지는 자극 단계를 나타냅니다.
4. 날짜, 유전 적 배경, 실험 상태 (기준선 또는 자극) 및 사용되는 채널을 포함한 파일 이름으로 이미징 소프트웨어에서 지원하는 .czi 파일 또는 파일 유형으로 이미지를 저장합니다.
5. 모든 유전자형을 이미지화하기 위해 매개변수를 재사용(도2A).

3. 이미지 프로세싱 및 ROI 선택

1. 피지 / ImageJ에서 czi 파일을 열고 색상 모드를설정 : 회색 scale, 와 함께 보기 스택을선택 : 하이퍼 스택, 별도의 윈도우로 분할 채널을선택합니다.
2. 드리프트 보정 플러그인을 사용하여 이미지를 처리 : 터보 레그와 스택 레그. 각 채널은 플러그인에서 Stackreg를 선택하여 별도로 수정한 다음 변환: 번역을 선택합니다.
3. 관심 영역(ROI)을 수동으로 선택하여 각 채널의 평균 회색 값을 추출합니다.
   1. 전체 타임 시리즈에 초점을 맞춘 모든 모터 뉴런을 추적하여 ROI를 선택합니다. ROI 관리자를 사용하여 각 모터 뉴런 윤곽선을 저장합니다.
   2. 다중 측정 함수를 사용하여 각 ROI의 평균 회색 값을 각 시점에서 측정합니다. 첫 번째 채널에서 두 번째 채널로 추적된 ROI를 복사하여 사전 자극 이미지를 볼 수 있습니다.
   3. 사전 자극 이미지에 대해 선택한 동일한 셀/ROI를 사용하여 각 채널의 후 자극 이미지에 대해 이 프로세스를 반복합니다.

4. 데이터 분석

1. FRET 및 CFP 채널의 평균 회색 값을 사용하여 FRET/CFP 비율을 계산합니다. FRET/CFP 비율의 변화는 세포내 포도당 농도의 변화를 반영합니다.
   1. 각 ROI 및 시간 대 시간에 대해 FRET/CFP 비율을 플롯합니다. 모든 VNC 내에서 일부 ROI는 자극 에 따라 FRET/CFP 비율의 하락을 나타낼 것입니다.
      참고: 이것은 포도당을 섭취하는 몇몇 뉴런의 무능력으로 해석됩니다, 아마도 해부로 기인한 긴장 때문에 분석에서 제거됩니다. 각 ROI 및 시간점에 대한 나머지 FRET/CFP 비율은 유전자형당 시간포인트당 단일 FRET/CFP 비율을 생성하기 위해 평균됩니다(포도당 센서만 및 TDP-43^G298S를가진 포도당 센서). 이러한 단일 FRET/CFP 비율은 모든 후속 정규화에 사용됩니다. 포도당 센서 제어를 위해 31개의 ROI를 분석하였고 24개의 ROI는 TDP-43^G298S에대해 분석되었다.
2. 기준 정규화: 처음 10분(기준선)에 대한 FRET/CFP 비율의 평균을 계산한 다음 전체 실험의 각 시간 지점에 대해 개별 FRET/CFP 비율을 10분 기준평균으로 정규화합니다(그림 2B참조).
3. 정시성 정규화: 각 시점에서 혼자 포도당 센서에서 PDP-43^G298S FRET/CFP 비율을 정상화(그림 3A참조).
4. 막대 그래프: 막대 그래프 형태의 기준선 대 자극 비교의 경우 각 유전자형에 대해 5-10분(기준선) 및 15-20분(자극)의 FRET/CFP 비율을 사용합니다. 자극 비율을 기준비율에 정규화합니다(그림 3B참조).

5. 통계 분석

1. Mann-Whitney 보정(기준 및 시간점 정규화용) 또는 Kruskall-Walis 테스트(자극의 막대 그래프 표현 대 기준FRET/CFP 비율)를 사용하여 정규화된 데이터 세트를 평가합니다.

결과

복부 신경 코드 (VNC), 전 생체 에서 포도당 센서의 이미지 수집
TDP-43에 근거를 둔 ALS의 Drosophila 모형에 있는 포도당 섭취에 있는 다름을 결정하기 위하여, 유전으로 인코딩된 FRET 기지를 둔 포도당 센서를 이용했습니다. 센서는 대장균 MglB 유전자로부터 포도당 결합 도메인에 융합된 CFP 및 YFP를 구성했다. 포도당 결합은 CFP와 YFP

토론

여기서 상세히 기술된 기술은 FLII12Pglu-700δ6, 밀리몰라 범위^10,11,12로포도당 수준의 변화를 검출할 수 있는 FRET 기반 센서를 사용하여 살아있는 드로소필라에 대한 특정 세포 유형의 포도당^섭취를측정하도록 적용될 수 있다. 이 센서는 이전에 UAS-GAL4 시스템과 함께 뉴런^9,10을포?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm tissue culture dishes	Sigma Aldrich	CLS430165
40X water immersion lens	Zeiss	440090	dippable, N.A. 0.8
dissection scissors	Roboz	RS-5618
Dumont #5 forceps	VWR	100189-236
Dumont #55 forceps	VWR	100189-244
Minutien pins	Fine Science tools	26002-10	used for dissections
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	Dow	1317318
Zeiss LSM880 NLO upright multiphoton/confocal microscope	Zeiss	N/A