מדידת ספיגת גלוקוז במודלים של דרוסופילה של פרוטאינופתיה TDP-43

Summary

ספיגת הגלוקוז מוגברת בתאי העצב המוטוריים של Drosophila המושפעים מחלבון מחייב DNA TAR (TDP-43), כפי שצוין על ידי חיישן גלוקוז מבוסס FRET, מקודד גנטית.

Abstract

טרשת אמיוטרופית לרוחב היא הפרעה ניווניות הגורמת לחולשת שרירים מתקדמת ומוות בתוך 2-5 שנים לאחר האבחון. ביטויים קליניים כוללים ירידה במשקל, דיסליפידמיה, היפרמטבוליזם; עם זאת, עדיין לא ברור כיצד אלה מתייחסים ניוון נוירון מוטורי. באמצעות מודל Drosophila של חלבון TDP-43 כי recapitulates מספר תכונות של ALS כולל תכלילים ציטופלסמיים, תפקוד לקוי locomotor, ותוחלת חיים מופחתת, לאחרונה זיהינו ליקויים מטבוליים רחבים. בין אלה, גליקוליזה נמצאה upregulated וניסויי אינטראקציה גנטית סיפקו ראיות למנגנון neuroprotective מפצה. ואכן, למרות upregulation של phosphofructokinase, קצב הגבלת האנזים בגליקוליזיס, עלייה בגליקוליזיס באמצעות מניפולציות תזונתיות וגנטיות הוכח כדי להקל על תפקוד לקוי locomotor ותוחלת חיים מוגברת במודלים זבובים של חלבון TDP-43. כדי לחקור עוד יותר את ההשפעה על חלבון TDP-43 על שטף גליקוליטי בתאי עצב מוטוריים, דווח בעבר מקודד גנטית, חיישן מבוסס FRET, FLII12Pglu-700μδ6, שימש. חיישן זה מורכב מתחום חישת גלוקוז חיידקי וחלבונים פלואורסצנטיים ציאן וצהוב כצמד FRET. לאחר כריכת גלוקוז, החיישן עובר שינוי קונפורמציה המאפשר FRET להתרחש. באמצעות FLII12Pglu-700μδ6, ספיגת גלוקוז נמצאה עלייה משמעותית נוירונים מוטוריים המבטאים TDP-43^G298S, גרסה הגורמת ALS. כאן, אנו מראים כיצד למדוד ספיגת גלוקוז, ex vivo, בתכשירי כבל עצב גחון זחל מבטא את חיישן גלוקוז FLII12Pglu-700μδ6 בהקשר של חלבון TDP-43. גישה זו יכולה לשמש כדי למדוד את ספיגת הגלוקוז ולהעריך שטף גליקוליטי בסוגי תאים שונים או בהקשר של מוטציות שונות הגורמות ALS והפרעות ניווניות הקשורות.

Introduction

טרשת אמיוטרופית לרוחב (ALS) היא הפרעה נוירודגנרטיבית מתקדמת כי הוא כרגע חשוכת מרפא. ALS משפיע על נוירונים מוטוריים עליונים ותחתונים המובילים לאובדן קואורדינציה מוטורית, שיתוק בלתי הפיך, כשל נשימתי, ומוות בסופו של דבר בתוך 2-5 שנים של^{אבחון 1}. ALS קשורה פגמים מטבוליים כגון ירידה במשקל, דיסליפידמיה, היפרמטבוליזם (נבדק ב²); עם זאת, עדיין לא ברור כיצד שינויים אלה בחילוף החומרים מתייחסים ניוון נוירון מוטורי. מכנה נפוץ ב- ALS ומחלות ניווניות הקשורות הוא TDP-43, חלבון מחייב חומצת גרעין המעורב במספר שלבים של עיבוד RNA^3,4,5. למרות מוטציות ב TDP-43 משפיעות רק על 3%-5% מהחולים, חלבון מסוג TDP-43 מסוג בר נמצא בתוך אגרגטים ציטופלסמיים >97% ממקרי ALS (נבדק ב^-6). פתולוגיה זו עוצבה בדרוסופילה על ידי ביטוי יתר של סוג בר אנושי או מוטציה TDP-43 (G298S) בתאי עצב מוטוריים, אשר משחזר היבטים מרובים של ALS, כולל הכללות ציטופלסמיות, תפקוד לקוי של לוקומוטור ותוחלת חיים מופחתת^7,8. באמצעות מודלים אלה, דווח לאחרונה כי חלבון TDP-43 גורם לעלייה משמעותית ברמות הפירובאט וה-phosphofructokinase (PFK) mRNA, האנזים המגביל את קצב הגליקוליזיס⁹. עליות דומות בתמלילים PFK נמצאו נוירונים מוטוריים שמקורם בחולה וחוט השדרה, דבר המצביע על כך גליקוליזה הוא upregulated בהקשר של חלבון TDP-43. מעניין, עלייה נוספת בגליקוליזה באמצעות מניפולציות תזונתיות וגנטיות הקלה על מספר פנוטיפים של ALS כגון תפקוד לקוי של לוקומוטור ותוחלת חיים מוגברת במודלים של פרוטאינופתיה TDP-43, עולה בקנה אחד עם מנגנון מפצה, neuroprotective נוירונים מוטוריים מתנוונים.

כדי לחקור שינויים נוספים בגליקוליזיס ולמדוד את ספיגת הגלוקוז במודלים Drosophila של חלבון TDP-43, חיישן מבוסס FRET שדווח בעבר מקודד גנטית FLII12Pglu-700μδ6¹⁰ בא לידי ביטוי נוירונים מוטוריים במיוחד באמצעות מערכת הביטוי UAS-GAL4. חיישן הגלוקוז FLII12Pglu-700μδ6 משתמש בהעברת אנרגיית תהודה בין שתי גרסאות של חלבון פלואורסצנטי ירוק, ציאני וחלבוני פלורסנט צהובים (CFP ו- YFP) כדי לזהות גלוקוז ברמה התאית. הוא מורכב מתחום מחייב גלוקוז חיידקי מהגן E. coli MglB התמזג CFP ו YFP בקצוות מנוגדים של המולקולה. כאשר הוא קשור למולקולת גלוקוז, החיישן עובר שינוי קונפורמציה המקרב את CFP ו- YFP זה לזה ומאפשר ל- FRET להתרחש, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בו כדי לכמת את רמות הגלוקוז התאי^10,11,12 ( איור1). כאן, אנו מראים כיצד חיישן FLII12Pglu-700μδ6 יכול לשמש כדי לקבוע שינויים בספיגת הגלוקוז הנגרמים על ידי חלבון TDP-43 בתאי עצב מוטוריים. הניסויים המתוארים כאן מראים כי ביטוי יתר של מוטציה הקשורה ALS, TDP-43^G298S, בתאי עצב מוטוריים גורם לעלייה משמעותית בספיגת הגלוקוז בהשוואה לבקרות. גישה זו יכולה לשמש בסוגים אחרים של ALS (למשל, SOD1, C9orf72 וכו ') ו/או סוגי תאים אחרים (למשל, גליה, שרירים) כדי לקבוע שינויים בספיגת הגלוקוז הקשורים ניוון עצבי.

Protocol

הזבובים הטרנסגניים UAS FLII12Pglu-700μδ6 דווחו בוולקנהוף ואח'^{10 וסיפקו} בחביבות על ידי ד"ר ס. שירמאייר. הקווים הטרנסגניים של UAS TDP-43^G298S סופקו בחביבות על ידי ד"ר ט. איווצובו^13. קווים Drosophila רקומביננטי מחסה הן UAS FLII12Pglu-700μδ6 ו UAS TDP-43 טרנסגנים נוצרו במעבדת Zarnescu באמצעות גישות גנטיות סטנדרטיות ודווחו מנזו ואח^'9. D42 GAL4 שימש להנעת הביטוי של חיישן הגלוקוז לבד או יחד עם TDP-43^G298S בתאי עצב מוטוריים. כל קווי הזבוב נשמרים על מדיה קמח תירס מולסה, ב 25 °C (5 °F) ב 12 שעות כהה: מחזור אור.

1. ניתוחי חבל עצב גחון של דרוזופילה (VNC)

1. הפוך סיליקון אלסטומר מנות ניתוח.
   1. יוצקים רכיבי אלסטומר סיליקון לתוך צינור 50 מ"ל כפי שצוין בפרוטוקול היצרן ומערבבים היטב.
   2. מלאו מנות תרבית רקמות 35 מ"מ עם כ 2 מ"ל של תערובת אלסטומר. השתמש במזרק כדי להסיר בועות. מכסים את הכלים ומניחים אותם על משטח מפלס בתנור 60 מעלות צלזיוס לילה כדי לרפא.
2. לנתח זחלי Drosophila לחשוף את VNC תוך שמירה על כדאיות רקמות.
   1. לאסוף זחל instar השלישי נודד, לשטוף עם ddH₂O, ולאחר מכן למקם אותו טיפה של HL3-buffer (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MgCl₂, 10 mM NaHCO₃, 115 mM סוכרוז, 5 mM trehalose, 5 mM HEPES; pH 7.1) על צלחת מרופדת אלסטומר.
   2. באמצעות זוג מלקחיים (#5 או 55 מלקחיים) תחת מיקרוסקופ ניתוח, הצמד את הקצוות הקדמיים והאחוריים של צד הזחלים למעלה, בזהירות למתוח את הזחל לאורך עם סיכות חרקים (סיכות Minutein).
   3. לעשות קיסם ממש מעל הסיכה האחורית באמצעות זוג מספריים קשתית זוויתית. לעשות חתך אנכי החל מהחתך לכיוון הקצה החלקה, בקצהו של הזחל.
   4. הוסף כמה טיפות של מאגר HL-3 במידת הצורך. הסר את קנה הנשימה ואת שאר האיברים הצפים מבלי להפריע ל- CNS. הצמד את המדפים המותחים את דופן הגוף כדי לחשוף את מערכת החזותית תוך שמירה על המערכת הנוירו-שרירית (VNCs, אקסונים וצמתים עצביים-שריריים) ללא פגע.

2. רכישת תמונות

1. מטב את פרמטרי ההדמיה.
   1. הפעל את המיקרוסקופ ואת הלייזר לפני תחילת ניתוחים. יש לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקל זקוף עם עדשת טבילת מים פי 40. השתמש בלייזר 405 ננומטר כדי לרגש את CFP ולרכוש את התמונות הן בערוצי הזיהוי CFP (465-499 ננומטר) והן בערוצי הזיהוי FRET (535-695 ננומטר).
   2. מטב פרמטרי רכישה כגון מהירות סריקה (6), ממוצע (2), מטרה (40x), זום (1x), גודל חור סיכה (1 AU) ורזולוציה מרחבית (512 x 512). התאם את הרווח כך שהאות נמצא בטווח הדינמי האופטימלי. יש להשתמש באותם פרמטרים עבור כל הגנוטיפים.
2. תמונה נוירונים מוטוריים בתוך VNC.
   1. מניחים את צלחת הסיליקון עם הדגימה המנותחת מתחת לעדשה. הנמיכו את העדשה כך שהיא תבוא במגע עם חוצץ טרהלוז-סוכרוז HL3 (ראו 1.2.1). זה קריטי כדי להבטיח כי העדשה שקועה לחלוטין במאגר. הוסף מאגר נוסף במידת הצורך.
   2. השתמש בערוצי CFP ו- FRET כדי לבחור באופן ידני מקטע אופטי המורכב לפחות 6 נוירונים מוטוריים בפוקוס, הממוקם לאורך קו האמצע של VNC. הנוירונים המוטוריים מזוהים על סמך הביטוי של חיישן הגלוקוז והמיקום לאורך הציר הקדמי-אחורי.
   3. לרכוש תמונות כל 10 s במשך 10 דקות. תמונות אלה מייצגות את קו הבסיס.
3. לעורר עם גלוקוז בתוספת HL-3.
   1. הסר trehalose-סוכרוז המכיל HL3-buffer באמצעות פיפטה פסטר ולהחליף אותו עם גלוקוז 5 mM בתוספת HL-3 (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MgCl₂, 10 mM NaHCO₃, 115 mM סוכרוז, גלוקוז 5 mM, 5 mM HEPES, pH 7.1). שלב זה צריך להתבצע בזהירות רבה, כדי למנוע את התנועה של VNC ככל האפשר.
   2. לרכוש תמונות כל 10 s במשך 10 דקות נוספות. תמונות אלה מייצגות את שלב הגירוי.
4. שמור את התמונות כקבצי .czi או כל סוג קובץ הנתמך על-ידי תוכנת ההדמיה עם שם קובץ הכולל תאריך, רקע גנטי, מצב ניסיוני (בסיסי או גירוי) וערוצים המשמשים.
5. שימוש חוזר בפרמטרים כדי לדמות את כל הגנוטיפים (איור 2A).

3. עיבוד תמונה ובחירת ROI

1. פתחו את קבצי ה- czi בפיג'י/ImageJ והגדירו את מצב צבע: גווני אפור, בחרו 'הצג מחסנית עם: הערימה של היפר-ערימה' ובחרו 'פצל ערוצים ל- Windows נפרד'.
2. עבדו תמונות באמצעות התוספים לתיקון הסחף: turboreg ו-stackreg. כל ערוץ מתוקן בנפרד על-ידי בחירת Stackreg תחת תוספיםולאחר מכן בחר המרה: תרגום.
3. בחר באופן ידני את אזורי העניין (ROIs) כדי לחלץ את הערך האפור הממוצע של כל ערוץ.
   1. בחר את ROIs על ידי מעקב אחר כל הנוירונים המוטוריים שנותרו בפוקוס לאורך כל סדרת הזמן. השתמש במנהל ההבהבה כדי לשמור כל קו מתאר של נוירון מוטורי.
   2. השתמש בפונקציה Multi-measure כדי למדוד את הערך האפור הממוצע בכל עלה על תנאי בכל נקודת זמן. העתק את ההבערה שאותרה מהערוץ הראשון לערוץ השני עבור תמונת קדם-גירוי.
   3. חזור על תהליך זה עבור התמונות שלאחר הגירוי בכל ערוץ באמצעות אותם תאים/החזרי ROIs שנבחרו עבור התמונה שלפני הגירוי.

4. ניתוח נתונים

1. חשב את יחס FRET/CFP, באמצעות הערכים האפורים הממוצעים עבור ערוצי FRET ו- CFP. שינויים ביחס FRET/CFP משקפים שינויים בריכוז הגלוקוז התאי.
   1. התווה יחסי FRET/CFP עבור כל נקודת ROI ונקודת זמן לעומת זמן. בתוך כל VNC חלק מההגות יציגו ירידה ביחסי FRET/CFP לאחר גירוי.
      הערה: זה מתפרש כחוית יכולת של נוירונים מסוימים ספיגת גלוקוז, אולי בגלל מתח שנגרם על ידי ניתוחים ולכן מסולקים מהניתוח. יחסי FRET/CFP הנותרים עבור כל ROI ונקודת זמן הם בממוצע כדי ליצור יחס FRET / CFP יחיד לכל נקודת זמן לכל גנוטיפ (חיישן גלוקוז לבד וחיישן גלוקוז עם TDP-43^G298S). יחסי FRET/CFP יחידים אלה משמשים עבור כל הנורמליזציה הבאה. 31 ROIs נותחו עבור פקדי חיישן גלוקוז ו 24 ROIs נותחו עבור TDP-43^G298S.
2. נורמליזציה בסיסית: חשב את הממוצע של יחסי FRET/CFP עבור 10 הדקות הראשונות (בסיסיות) ולאחר מכן נרמל יחסי FRET/CFP בודדים עבור כל נקודת זמן של הניסוי כולו לממוצע הבסיסי של 10 דקות (ראה איור 2B).
3. נורמליזציה של נקודות זמן: נרמל יחס TDP-43^G298S FRET/CFP ליחסי FRET/CFP מחיישן הגלוקוז בלבד בכל נקודת זמן (ראו איור 3A).
4. תרשימי עמודות: להשוואות בסיסיות לעומת גירויים בצורה של תרשימי עמודות, השתמש ביחסי FRET/CFP בין 5-10 דקות (בסיסי) ו-15-20 דקות (גירוי) עבור כל גנוטיפ. נרמל יחס גירוי ליחס הבסיס (ראו איור 3B).

5. ניתוחים סטטיסטיים

1. להעריך את ערכות הנתונים מנורמל באמצעות תיקון מאן-ויטני (עבור נורמליזציה בסיסית ונקודת זמן) או מבחן Kruskall-Walis (עבור ייצוג גרף עמודות של גירוי לעומת יחסי FRET / CFP בסיסי).

תוצאות

רכישת תמונה של חיישן הגלוקוז במתג העצב הגחון (VNC), ex vivo
כדי לקבוע הבדלים בספיגת הגלוקוז במודל Drosophila של ALS המבוסס על TDP-43, נעשה שימוש בחיישן גלוקוז מבוסס FRET מקודד גנטית. החיישן כלל CFP ו- YFP התמזגו לתחום כריכת הגלוקוז מהגן E. coli MglB. כריכת גלוקוז מעוררת שינוי קונפ?...

Discussion

הטכניקה המתוארת בפירוט כאן ניתן ליישם כדי למדוד את ספיגת הגלוקוז בסוג מסוים של עניין Drosophila חי באמצעות FLII12Pglu-700μδ6, חיישן מבוסס FRET אשר יכול לזהות שינויים ברמות הגלוקוז לטווח מילימולרי^10,11,12. חיישן זה שימש בעבר בשילוב עם מערכת UAS-GAL4 כדי ל?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm tissue culture dishes	Sigma Aldrich	CLS430165
40X water immersion lens	Zeiss	440090	dippable, N.A. 0.8
dissection scissors	Roboz	RS-5618
Dumont #5 forceps	VWR	100189-236
Dumont #55 forceps	VWR	100189-244
Minutien pins	Fine Science tools	26002-10	used for dissections
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	Dow	1317318
Zeiss LSM880 NLO upright multiphoton/confocal microscope	Zeiss	N/A