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要約

グルコース取り込みは、FRETベースの遺伝的にコードされたグルコースセンサーによって示されるように、TAR DNA結合タンパク質(TDP-43)タンパク質障害の影響を受ける ショウジョウバエ 運動ニューロンにおいて増加する。

要約

筋萎縮性側索硬化症は、診断後2〜5年以内に進行性筋力低下および死亡を引き起こす神経変性疾患である。臨床症状は、体重減少を含みます, 脂質異常症, および高代謝;しかし,これらは運動ニューロン変性とどのように関連しているのかは不明である。細胞質含包、運動機能障害、寿命の減少を含むALSのいくつかの特徴を再現するTDP-43タンパク質障害の ショウジョウバエ モデルを用いて、最近、幅広い代謝欠陥を同定した。これらの中で、解糖はアップレギュレートされ、遺伝的相互作用実験が補償神経保護機構の証拠を提供することが判明した。実際、ホスホフルクトキナーゼのアップレギュレーションにもかかわらず、解糖症における率制限酵素は、食事および遺伝子操作を用いた解糖の増加が、TDP-43タンパク質症のフライモデルにおける運動機能障害および寿命の増加を緩和することが示された。さらに、運動ニューロンにおける解糖性フラックスに対するTDP-43タンパク質症に対する影響を調べるには、以前に報告された遺伝的にコードされたFRETベースのセンサFLII12Pglu-700μδ6が使用された。このセンサーは、FRETペアとして細菌性グルコースセンシングドメインとシアンおよび黄色の蛍光タンパク質で構成されています。グルコース結合の際、センサはコンフォメーション変化を起こしてFRETが発生する。FLII12Pglu-700μδ6を用いて、グルコース取り込みは、変異体を引き起こすALSであるTDP-43G298Sを発現する運動ニューロンにおいて有意に増加することが判明した。ここでは、TDP-43タンパク質症のコンテキストでグルコースセンサFLII12Pglu-700μδ6を発現する幼虫腹側神経コード製剤におけるグルコース取り込み 、ex vivo、を測定する方法を示す。このアプローチは、グルコース取り込み量を測定し、異なる細胞タイプまたはALSおよび関連する神経変性疾患を引き起こす様々な突然変異の文脈での解糖束を評価するために使用することができる。

概要

筋萎縮性側索硬化症(ALS)は現在不治の進行性神経変性疾患です。ALSは、運動協調の喪失、不可逆的な麻痺、呼吸不全、および診断2〜5年以内の最終的な死につながる上下運動ニューロンに影響を与える1。ALSは、体重減少、脂質異常症、および高代謝(2でレビュー)などの代謝欠陥に関連付けられている。しかし、代謝におけるこれらの変化が運動ニューロン変性とどのように関連しているのかは不明である。ALSおよび関連する神経変性疾患における共通の分母は、TDP-43、RNA処理3、4、5のいくつかのステップに関与する核酸結合タンパク質である。TDP-43の変異は患者の3%〜5%にしか影響しないが、野生型TDP-43タンパク質は、ALS症例の>97%の細胞質凝集体内に見られる(6でレビュー)。この病理は、細胞質介在物、ロコモ運動機能不全および寿命の減少を含むALSの複数の側面を再現する運動ニューロンにおけるヒト野生型または変異体TDP-43(G298S)の過剰発現によってショウジョウバエでモデル化された。これらのモデルを用いて、TDP-43タンパク質症がピルビン酸レベルおよびホスホフルクキナーゼ(PFK)mRNAの有意な増加を引き起こすことが最近報告された、解糖酵素9の速度制限酵素。PFK転写物の同様の増加は、患者由来の運動ニューロンおよび脊髄において認められ、解糖症がTDP-43タンパク質症の文脈においてアップレギュレートされることを示唆した。興味深いことに、食事および遺伝子操作を用いた解糖のさらなる増加は、運動神経細胞を変性する代償的な神経保護機構と一致する、TDP-43タンパク質障害のフライモデルにおける運動機能障害および寿命の増加などのいくつかのALS表現型を緩和した。

さらに、TDP-43タンパク質症のショウジョウバエモデルにおける糖分解の変化をプローブし、グルコース取り込み量を測定するために、以前に報告された遺伝子組み換えFRETベースのセンサFLII12Pglu-700μδ610は、UAS-GAL4発現系を用いて運動ニューロンで発現した。FLII12Pglu-700μδ6グルコースセンサーは、細胞レベルでグルコースを検出するために、緑色蛍光タンパク質(シアンおよび黄色蛍光タンパク質)の2つの変異体間の共鳴エネルギー移動を使用します。これは、分子の反対側の端にあるCFPとYFPに融合した大腸菌MglB遺伝子からの細菌グルコース結合ドメインからなる。グルコース分子に結合すると、センサーはCFPとYFPを近づけてFRETを発生させ、細胞内グルコースレベル10、11、12を定量するために使用できる立体構造変化を受ける(図1)。ここでは、FLII12Pglu-700μδ6センサーを使用して、運動ニューロンにおけるTDP-43タンパク質症によるグルコース取り込みの変化を決定する方法を示す。ここで説明する実験は、ALS関連変異体TDP-43G298Sの過剰発現が、コントロールと比較してグルコース取り込みの有意な増加を引き起こすことを示している。このアプローチは、他のタイプのALS(例えば、SOD1、C9orf72など)および/または他の細胞タイプ(例えば、グリア、筋肉)で、神経変性に関連するグルコース取り込みの変化を決定するために使用することができる。

プロトコル

UAS FLII12Pglu-700μδ6トランスジェニックハエは、Volkenhoffら10 で報告され、S.シルマイヤー博士によって親切に提供された。UAS TDP-43G298S トランスジェニックラインは、T.岩subo13によって親切に提供されました。UAS FLII12Pglu-700μδ6とUAS TDP-43の両方を有する組換えショ ウジョウバエ 線は、ザルネスクの実験室で標準的な遺伝的アプローチを用いて生成され、マンゾら9で報告された。D42 GAL4は、運動ニューロンにおいてグルコースセンサ単独またはTDP-43G298S の発現を駆動するために使用された。すべてのフライラインは、12時間暗:光サイクルで25°Cで、糖蜜コーンミール培地上に維持されています。

1. ショウジョウバエ 腹側神経コード(VNC)の切開

  1. シリコンエラストマー解剖皿を作ります。
    1. メーカーのプロトコルに示されているように、50 mLチューブにシリコーンエラストマー成分を注ぎ、よくかき混ぜます。
    2. エラストマー混合物の約2 mLで35ミリメートルの組織培養皿を充填します。すべての気泡を削除するには、注射器を使用します。皿を覆い、一晩60°Cのオーブンでレベルの表面に置いて治します。
  2. ショ ウジョウバエ の幼虫を解剖し、組織の生存率を維持しながらVNCを暴露する。
    1. 放浪第三のインスター幼虫を収集し、ddH2Oで洗い、HL3バッファ(70 mM NaCl、5 mM KCl、20 mM MgCl2、10mM NaHCO 3、115 mMスクロース、5 mMトレハロース、5 mM HEPES;pH 7.1)のドロップに置きます。
    2. 一対の鉗子(#5または55鉗子)を解剖顕微鏡で使用し、幼虫の後側の前端と後端をピンで留め、昆虫ピン(Minutein pin)で幼虫を慎重に縦に伸ばします。
    3. 斜めのアイリスはさみを使用して、後部ピンのすぐ上に切開を行います。幼虫の前端に向かって切開から垂直カットを行います.
    4. 必要に応じて、HL-3 バッファーを数滴追加します。気管と浮遊器官の残りの部分をCNSを邪魔することなく取り除きます。神経筋システム(VNC、軸索、および神経筋接合部)をそのまま維持しながら、体壁を伸ばすフラップをピンで留めてCNSを露出させます。

2. 画像取得

  1. イメージング パラメータを最適化します。
    1. 切り出しを開始する前に、顕微鏡とレーザーをオンにします。画像は、40倍の水浸漬レンズを備えた直立共焦点顕微鏡を使用して取得する必要があります。405 nmレーザーを使用してCFPを励起し、CFP(465-499 nm)およびFRET(535-695 nm)検出チャネルの両方の画像を取得します。
    2. スキャン速度(6)、平均(2)、目標(40倍)、ズーム(1x)、ピンホールサイズ(1 AU)、空間分解能(512 x 512)などの取得パラメータを最適化します。信号が最適なダイナミックレンジになるようにゲインを調整します。すべての遺伝子型に同じパラメータを使用する必要があります。
  2. VNC内の運動ニューロンをイメージします。
    1. 解剖したサンプルをレンズの下に置きます。トレハロースクロースHL3バッファーに接触するようにレンズを下げます(1.2.1参照)。レンズがバッファーに完全に沈み込まないようにすることが重要です。必要に応じて、さらにバッファを追加します。
    2. CFP および FRET チャネルを使用して、VNC 正線に沿って、少なくとも 6 つの運動ニューロンがフォーカスされている光学セクションを手動で選択します。運動ニューロンは、グルコースセンサーの発現と前後軸に沿った位置に基づいて同定される。
    3. 10分ごとに画像を取得します。これらのイメージはベースラインを表します。
  3. HL-3を補うグルコースで刺激します。
    1. パスツールピペットを使用してHL3-バッファーを含むトレハロースクロースを取り出し、5 mMグルコース補充HL-3(70 mM NaCl、5 mM KCl、20mM MgCl 2、10 mM NaHCO 3、115 mM SUCROSE、5 mMグルコース、5 mM HEPES、pH 7.1)に置き換えます。このステップは、VNCの動きを可能な限り避けるために、細心の注意を払って実行する必要があります。
    2. さらに10分間、10sごとに画像を取得します。これらの画像は、刺激フェーズを表します。
  4. 画像を.cziファイルまたは画像作成ソフトウェアでサポートされているファイルタイプとして保存し、日付、遺伝的背景、実験条件(ベースラインまたは刺激)、使用するチャンネルなどのファイル名を付けます。
  5. すべての遺伝子型をイメージ化するためにパラメータを再利用します(図2A)。

3. 画像処理とROIの選択

  1. フィジー/ImageJ で czi ファイルを開き、[ カラー モード: グレースケール] を設定し、[ ビュー スタック: ハイパースタック] を選択し、[ チャンネルを別々の Windows に分割する] を選択します。
  2. ドリフト補正プラグインを使用して画像を処理する:ターボレッグとスタックレグ。各チャネルは、[プラグイン] の下の [Stackreg]を選択して個別に修正され、[変換: 変換] を選択します。
  3. 各チャンネルの平均グレー値を抽出するには、対象地域(ROI)を手動で選択します。
    1. 時系列全体にわたってフォーカスを維持しているすべての運動ニューロンをトレースすることで、ROIを選択します。ROI マネージャを使用して、各運動ニューロンのアウトラインを保存します。
    2. 各時点で各 ROI の平均グレー値を測定するには 、マルチメジャー 関数を使用します。最初のチャンネルから、刺激前イメージの 2 番目のチャンネルにトレースされた ROI をコピーします。
    3. プレ刺激画像に選択された同じセル/ROIを使用して、各チャンネルのポスト刺激画像に対してこのプロセスを繰り返します。

4. データ分析

  1. FRET/CFP チャンネルの平均グレー値を使用して、FRET/CFP 比を計算します。FRET/CFP比の変化は、細胞内グルコース濃度の変化を反映しています。
    1. ROI とタイム ポイント対時間ごとの FRET/CFP 比をプロットします。すべてのVNC内で、ROIの一部は刺激後のFRET/CFP比の低下を示します。
      注:これは、おそらく解剖によって引き起こされるストレスのために、グルコースを取り込むためにいくつかのニューロンの不能として解釈され、したがって、分析から排除されます。ROIおよび各時点の残りのFRET/CFP比は、平均化され、遺伝子型あたりのポイント当たりの単一のFRET/CFP比を生成する(グルコースセンサ単独およびTDP-43G298Sを有するグルコースセンサ)。これらの単一のFRET/CFP比は、後続のすべての正規化に使用されます。31 ROIをグルコースセンサコントロールについて分析し、TDP-43G298Sについて24のROIを分析しました。
  2. ベースライン正規化: 最初の 10 分 (ベースライン) の FRET/CFP 比の平均を計算し、実験全体の各時間ポイントに対する個々の FRET/CFP 比を 10 分ベースライン平均に正規化します ( 図 2Bを参照)。
  3. タイムポイントの正規化: TDP-43G298S FRET/CFP 比を各時点でグルコースセンサー単独から FRET/CFP 比に正規化します ( 図 3Aを参照)。
  4. 棒グラフ: 棒グラフの形式でのベースライン対刺激比較の場合、各遺伝子型に対して 5~10 分 (ベースライン) と 15~20 分 (刺激) の FRET/CFP 比を使用します。ベースライン比に対する刺激比を正規化する( 図3Bを参照)。

5. 統計分析

  1. マン・ホイットニー補正(ベースラインおよびタイムポイント正規化の場合)またはクルスコル・ワリス検定(刺激とベースラインFRET/CFP比の棒グラフ表現)を使用して正規化されたデータセットを評価します。

結果

腹側神経コード(VNC)のグルコースセンサーの画像取得
TDP-43に基づくALSのショウジョウバエモデルにおけるグルコース取り込みの違いを判定するために、遺伝的にコード化されたFRETベースのグルコースセンサーを用いた。このセンサーは、大腸菌MglB遺伝子からグルコース結合ドメインに融合したCFPおよびYFPを構成する。グルコース結合は、CFPと<...

ディスカッション

ここで詳細に説明する技術は、FLII12Pglu-700μδ6を用いた生きたショウジョウバエにおける特定の細胞型のグルコース取り込み量を測定するために適用することができる、10、11、12の範囲にグルコースレベルの変化を検出することができるFRETベースのセンサである。このセンサーは、以前は、ニューロン9...

開示事項

著者らは利益相反を宣言しない。

謝辞

ショ ウジョウバエ 株を提供してくれたステファニー・シルマイヤーと岩翼武志に感謝します。また、アリゾナ大学のマーリーイメージングコアでイメージングを支援してくれたパトリシア・ヤンスマに感謝します。この研究は、国立衛生研究所NIH NS091299、NS115514(DCZ)、HHMIギリアムフェローシップ(EM)、学部生物学研究プログラム(HBへ)によって資金提供されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
35 mm tissue culture dishesSigma AldrichCLS430165
40X water immersion lensZeiss440090dippable, N.A. 0.8
dissection scissorsRobozRS-5618
Dumont #5 forcepsVWR100189-236
Dumont #55 forcepsVWR100189-244
Minutien pinsFine Science tools26002-10used for dissections
SYLGARD 184 Silicone Elastomer KitDow1317318
Zeiss LSM880 NLO upright multiphoton/confocal microscopeZeissN/A

参考文献

  1. Ingre, C., Roos, P. M., Piehl, F., Kamel, F., Fang, F. Risk factors for amyotrophic lateral sclerosis. Clinical Epidemiology. 7, 181-193 (2015).
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