دراسة نماذج التبرع بالأعضاء التجريبية لزراعة الرئة

Summary

تظهر الدراسة الحالية إنشاء ثلاثة نماذج مختلفة للتبرع بالرئة (التبرع بعد موت الدماغ ، والتبرع بموت ما بعد الدورة الدموية ، والتبرع بالصدمة بعد النزف). يقارن العمليات الالتهابية والاضطرابات المرضية المرتبطة بهذه الأحداث.

Abstract

النماذج التجريبية هي أدوات مهمة لفهم الظواهر المسببة التي تنطوي عليها مختلف الأحداث الفيزيولوجية المرضية. في هذا السياق ، يتم استخدام نماذج حيوانية مختلفة لدراسة العناصر التي تؤدي إلى الفيزيولوجيا المرضية لخلل الكسب غير المشروع الأولي بعد الزرع لتقييم العلاجات المحتملة. حاليا ، يمكننا تقسيم نماذج التبرع التجريبية إلى مجموعتين كبيرتين: التبرع بعد الموت الدماغي والتبرع بعد توقف الدورة الدموية. بالإضافة إلى ذلك ، ينبغي النظر في الآثار الضارة المرتبطة بالصدمة النزفية عند النظر في النماذج الحيوانية للتبرع بالأعضاء. هنا ، نصف إنشاء ثلاثة نماذج مختلفة للتبرع بالرئة (التبرع بعد موت الدماغ ، والتبرع بموت ما بعد الدورة الدموية ، والتبرع بالصدمة بعد النزف) ومقارنة العمليات الالتهابية والاضطرابات المرضية المرتبطة بهذه الأحداث. الهدف هو تزويد المجتمع العلمي بنماذج حيوانية موثوقة للتبرع بالرئة لدراسة الآليات المرضية المرتبطة والبحث عن أهداف علاجية جديدة لتحسين عدد الطعوم القابلة للحياة للزراعة.

Introduction

الأهمية السريرية
زرع الأعضاء هو خيار علاجي راسخ للعديد من الأمراض الخطيرة. في السنوات الأخيرة ، تم تحقيق العديد من التطورات في المجالات السريرية والتجريبية لزراعة الأعضاء ، مثل زيادة المعرفة بالفيزيولوجيا المرضية لخلل الكسب غير المشروع الأولي (PGD) والتقدم في مجالات العناية المركزة وعلم المناعة وعلم الأدوية^1،2،3. على الرغم من الإنجازات والتحسينات في جودة الإجراءات الجراحية والدوائية ذات الصلة ، تظل العلاقة بين عدد الأعضاء المتاحة وعدد المتلقين في قائمة الانتظار واحدة من التحديات الرئيسية ^2,4. في هذا الصدد ، اقترحت الأدبيات العلمية نماذج حيوانية لدراسة العلاجات التي يمكن تطبيقها على المتبرعين بالأعضاء لعلاج و / أو الحفاظ على الأعضاء حتى وقت الزرع^5،6،7،8.

من خلال محاكاة الأحداث المختلفة التي لوحظت في الممارسة السريرية ، تسمح النماذج الحيوانية بدراسة الآليات المرضية المرتبطة بها والنهج العلاجية الخاصة بها. أدى الحث التجريبي لهذه الأحداث ، في معظم الحالات المعزولة ، إلى إنشاء نماذج تجريبية للتبرع بالأعضاء والأنسجة التي يتم التحقيق فيها على نطاق واسع في الأدبيات العلمية حول زرع الأعضاء^6،7،8،9. تستخدم هذه الدراسات استراتيجيات منهجية مختلفة ، مثل تلك التي تحفز الموت الدماغي (BD) ، والصدمة النزفية (HS) ، وموت الدورة الدموية (CD) ، لأن هذه الأحداث ترتبط بعمليات ضارة مختلفة تضر بوظائف الأعضاء والأنسجة المتبرع بها.

الموت الدماغي (BD)
يرتبط BD بسلسلة من الأحداث التي تؤدي إلى التدهور التدريجي للأنظمة المختلفة. يحدث عادة عندما تحدث زيادة حادة أو تدريجية في الضغط داخل الجمجمة (ICP) بسبب صدمة الدماغ أو النزيف. هذه الزيادة في برنامج المقارنات الدولية تعزز زيادة في ضغط الدم في محاولة للحفاظ على تدفق الدم الدماغي المستقر في عملية تعرف باسم منعكس كوشينغ^10,11. يمكن أن تؤدي هذه التغييرات الحادة إلى اختلالات في القلب والأوعية الدموية والغدد الصماء والعصبية التي تضر بكمية ونوعية الأعضاء المتبرع بها ، بالإضافة إلى التأثير على المراضة والوفيات بعد الزرع^{10،11،12،13}.

الصدمة النزفية (HS)
HS ، بدوره ، غالبا ما يرتبط بالمتبرعين بالأعضاء ، لأن معظمهم ضحايا للصدمة مع فقدان كبير في حجم الدم. بعض الأعضاء ، مثل الرئتين والقلب ، معرضة بشكل خاص ل HS بسبب نقص حجم الدم وما يترتب على ذلك من نقص تروية الأنسجة¹⁴. يتسبب HS في إصابة الرئة من خلال زيادة نفاذية الشعيرات الدموية ، والوذمة ، وتسلل الخلايا الالتهابية ، وهي آليات تعرض معا تبادل الغازات للخطر وتؤدي إلى تدهور تدريجي للأعضاء ، وبالتالي إخراج عملية التبرع عن مسارها ^6,14.

موت الدورة الدموية (CD)
يتزايد استخدام التبرع بعد CD بشكل كبير في المراكز العالمية الرئيسية ، مما يساهم في زيادة عدد الأعضاء التي تم جمعها. الأعضاء المستعادة من المتبرعين بعد CD عرضة لتأثيرات نقص التروية الدافئ ، والذي يحدث بعد فترة منخفضة (المرحلة الأغونية) أو عدم وجود إمدادات الدم (المرحلة الانقباضية)^8,15. سيؤدي نقص التروية أو غياب تدفق الدم إلى نقص الأكسجة في الأنسجة المرتبط بفقدان مفاجئ ل ATP وتراكم السموم الأيضية في الأنسجة¹⁵. على الرغم من استخدامه الحالي للزرع في الممارسة السريرية ، لا تزال هناك شكوك كثيرة حول تأثير استخدام هذه الأعضاء على جودة الكسب غير المشروع بعد الزرع وعلى بقاء المريض¹⁵. وبالتالي ، فإن استخدام النماذج التجريبية لفهم أفضل للعوامل المسببة المرتبطة ب CD ينمو أيضا^{8،15،16،17}.

النماذج التجريبية
هناك العديد من النماذج التجريبية للتبرع بالأعضاء (BD و HS و CD). ومع ذلك ، غالبا ما تركز الدراسات على استراتيجية واحدة فقط في كل مرة. هناك فجوة ملحوظة في الدراسات التي تجمع أو تقارن بين استراتيجيتين أو أكثر. هذه النماذج مفيدة جدا في تطوير العلاجات التي تسعى إلى زيادة عدد التبرعات وبالتالي تقليل قائمة انتظار المتلقين المحتملين. تختلف الأنواع الحيوانية المستخدمة لهذا الغرض من دراسة إلى أخرى ، حيث يتم اختيار نماذج الخنازير بشكل أكثر شيوعا عندما يكون الهدف هو ترجمة أكثر مباشرة مع فسيولوجيا مورفو البشرية وصعوبة تقنية أقل في الإجراء الجراحي بسبب حجم. على الرغم من الفوائد ، ترتبط الصعوبات اللوجستية والتكاليف المرتفعة بنموذج الخنازير. من ناحية أخرى ، فإن التكلفة المنخفضة وإمكانية التلاعب البيولوجي تفضل استخدام نماذج القوارض ، مما يسمح للباحث بالبدء من نموذج موثوق به لإعادة إنتاج الآفات وعلاجها ، وكذلك دمج المعرفة المكتسبة في مجال زراعة الأعضاء.

هنا ، نقدم نموذجا للقوارض لموت الدماغ ، وموت الدورة الدموية ، والتبرع بالصدمة النزفية. وصفنا العمليات الالتهابية والحالات المرضية المرتبطة بكل من هذه النماذج.

Protocol

امتثلت التجارب على للجنة أخلاقيات استخدام التجارب ورعايتها التابعة لكلية الطب بجامعة ساو باولو (رقم البروتوكول 112/16).

1. تجميع

1. قم بتعيين اثني عشر ذكرا من ذكور فأر Sprague Dawley بشكل عشوائي (250-300 جم) لواحدة من ثلاث مجموعات تجريبية (ن = 4) لتحليل ومقارنة التأثيرات المرتبطة بالنماذج الحيوانية.
2. تعيين لمجموعة الصدمة النزفية (HS ، n = 4): المعرضة لقسطرة الأوعية الدموية مع تحريض الصدمة النزفية + الصيانة لمدة 360 دقيقة + استخراج كتلة القلب والرئة + تحضير العينة للتحليل.
3. تعيين لمجموعة الموت الدماغي (BD ، n = 4): المعرضة للموت الدماغي + الصيانة لمدة 360 دقيقة + استخراج الكتلة القلبية الرئوية + تحضير العينة للتحليل.
4. تعيين لمجموعة موت الدورة الدموية (CD ، n = 4): المعرضة لقسطرة الأوعية الدموية + تحريض موت الدورة الدموية + تعليق التهوية + نقص التروية في درجة حرارة الغرفة لمدة 180 دقيقة + تحضير العينة للتحليل.

2. التخدير والتحضير قبل الجراحة

1. ضع الفئران في غرفة مغلقة مع 5 ٪ إيزوفلوران لمدة 1-4 دقائق. تأكد من التخدير المناسب عن طريق التحقق من منعكس قرصة إصبع القدم. في حالة عدم وجود تفاعلات منعكسة (لا تراجع مخلب) ، قم بإجراء التنبيب الرغامي (14-G angiocath) بمساعدة منظار الحنجرة للأطفال.
2. باستخدام جهاز التنفس الصناعي المعدل مسبقا (FiO₂ 100٪ ، حجم المد والجزر 10 مل / كجم ، 90 دورة / دقيقة ، و PEEP 3.0 سم H₂O) ، قم بتوصيل قسطرة القصبة الهوائية بجهاز التنفس الصناعي ، واضبط تركيز التخدير على 2٪.
   ملاحظة: اتبعت جميع الإجراءات المتعلقة بالنماذج الحيوانية نفس بروتوكول التخدير الموصوف في هذا القسم.
3. إزالة الفراء من المناطق ذات الاهتمام (الرأس والرقبة والصدر والبطن). ثم ، باستخدام الشاش ، تطهير المجال الجراحي وذيل. يتم إجراء التطهير بثلاث جولات متناوبة من محلول كحولي من فرك الكلورهيكسيدين ديغلوكونات.
4. اقطع طرف ذيل ، ضع الإبهام والسبابة فوق قاعدة الذيل ، ثم اضغط عليهما وحركهما بعيدا عن القاعدة. جمع عينة الدم المحيطية (20 ميكرولتر) من خلال الذيل لمجموع عدد الكريات البيض⁸.
   ملاحظة: يجب تنفيذ هذا الإجراء قبل بدء فغر القصبة الهوائية ومباشرة في نهاية كل بروتوكول (BD و HS - بعد 360 دقيقة).
5. استخدم ماصة دقيقة لتخفيف الدم الذي تم جمعه في 380 ميكرولتر (1:20) من محلول تورك (حمض الخليك الجليدي 99٪). بمجرد تخفيفها ، قم بسحب عينة الدم في غرفة نيوباور وضعها تحت المجهر (40x). إجراء إجمالي عدد الكريات البيض في الأرباع الجانبية الأربعة للغرفة.

3. فغر القصبة الهوائية

1. بمساعدة المقص والملقط المناسب ، قم بإجراء تشريح طولي للقصبة الهوائية العنقية ، بدءا من الثلث الأوسط من الرقبة إلى الشق فوق القص (شق 1.5 سم). بعد شق الجلد والأنسجة تحت الجلد ، تشريح عضلات عنق الرحم حتى تتعرض القصبة الهوائية.
2. ضع رباطا حريريا واحدا 2-0 أسفل القصبة الهوائية.
3. باستخدام المقص المجهري ، يقوم القصبة الهوائية باستئصال الثلث العلوي من القصبة الهوائية لتحقيق تهوية موحدة. قطع القصبة الهوائية أفقيا بين حلقتين غضروفيتين لاستيعاب قطر قنية معدنية (3.5 سم).
4. أدخل أنبوب التهوية وثبته بأربطة معدة.
5. قم بتوصيل أنبوب التهوية بنظام تهوية الصغيرة.
6. تهوية الجرذ بحجم المد والجزر 10 مل / كجم ، بمعدل 70 دورة / دقيقة ، و PEEP من 3 cmH₂O.

4. قسطرة الشريان الفخذي والوريد

1. كشف المثلث الفخذي من خلال شق صغير (1.5 سم) في المنطقة الأربية. تحديد وعزل الأوعية الفخذية. لهذا الإجراء ، استخدم مجهر مجسم (تكبير 3.2x).
2. ضع اثنين من الأربطة الحريرية 4-0 تحت الأوعية الدموية (الوريد أو الشريان) ، أحدهما بعيد والآخر قريب. أغلق الرباط البعيد ، ثم ضع عقدة مضبوطة مسبقا في الرباط القريب واسحبها.
3. أدخل القسطرة من خلال شق صغير مسبق التكوين في الأوعية. ثبت القنية لتجنب الخلع.
   ملاحظة: اصنع القسطرة من موسع حديثي الولادة 20 سم ملحوم بالتسخين إلى قسطرة وريدية محيطية مناسبة لعيار الشبكة الوريدية للحيوان ، وبالتالي منع قلس محتويات الدم. قم بتشحيم القنية بالهيبارين ، وتجنب تكوين الجلطات الدموية والمضاعفات أثناء قياس متوسط الضغط الشرياني (MAP).
4. قم بتوصيل قسطرة الشريان بمحول ضغط ونظام مراقبة العلامات الحيوية لتسجيل متوسط الضغط الشرياني (MAP). يجب وضع محول الطاقة على مستوى قلب. سجل MAP كل فترة 10 دقائق.
5. ضع قسطرة المحقنة (3 مل) في الوريد ، بهدف الترطيب والاستنزاف عند الضرورة.

5. تحريض الصدمة النزفية

1. من خلال الوصول الوريدي وباستخدام حقنة هيبارين ، قم بإزالة كميات صغيرة من الدم حتى يتم الوصول إلى قيم MAP البالغة 50 مم زئبق ، وبالتالي إنشاء صدمة نزفية.
   ملاحظة: اجمع 2 مل من الدم كل 10 دقائق في الساعة الأولى من التجربة وكل 30 دقيقة في الساعات التالية.
2. حافظ على استقرار الضغط عند حوالي 50 مم زئبق لمدة 360 دقيقة. للقيام بذلك ، قم بإزالة أو إضافة حصص من الدم إذا زاد الضغط أو انخفض ، على التوالي.
3. ضع مصدرا للحرارة في مكان قريب لتجنب انخفاض حرارة الجسم.
   ملاحظة: هنا ، يتم استخدام مصباح حراري.
4. في نهاية البروتوكول ، قم بحصاد الكتلة الرئوية عند إجمالي سعة الرئة (TLC) وإما تجميد الفلاش في النيتروجين السائل أو وضعه في محلول تثبيت لمزيد من الدراسات.
   ملاحظة: بمساعدة جهاز التنفس الصناعي للحيوانات الصغيرة ، يمكن الوصول إلى معلمات التهوية أثناء البروتوكول. في الدراسة الحالية ، تم تقييم هذه المعلمات مباشرة قبل تحريض النظام المنسق (خط الأساس) وبعد 360 دقيقة (نهائي).

6. تحريض موت الدورة الدموية

1. للحث على موت الدورة الدموية، يتم تطبيق 150 ملغ/ كغ ثيوبنتال الصوديوم عبر الخط الوريدي. ثم قم بإيقاف تشغيل نظام التهوية.
2. لاحظ الانخفاض التدريجي في MAP حتى يصل إلى 0 مم زئبق. من هذه النقطة ، فكر في بداية فترة نقص التروية الدافئة وابدأ حساب الوقت. يجب أن يبقى في درجة حرارة الغرفة (حوالي 22 درجة مئوية) لمدة 180 دقيقة.
3. في نهاية البروتوكول ، أعد توصيل الرئتين بجهاز التنفس الصناعي الميكانيكي واحصد الكتلة الرئوية في TLC لجمعها. إما أن تجمد الفلاش باستخدام النيتروجين السائل أو تضعه في محلول التثبيت لمزيد من الدراسات.

7. تحريض الموت الدماغي

1. ضع الفئران في وضعية الانبطاح.
2. إزالة الجلد من الجمجمة باستخدام مقص جراحي. حفر بئر عيار 1 مم 2.80 مم أمامي و 10.0 مم بطني إلى بريجما و 1.5 مم جانبي للخياطة السهمية.
3. أدخل قسطرة البالون بالكامل في تجويف الجمجمة وتأكد من ملء البالون مسبقا بمحلول ملحي (500 ميكرولتر).
4. بمساعدة حقنة ، قم بتضخيم القسطرة بسرعة.
5. تأكيد الموت الدماغي من خلال مراقبة ارتفاع MAP المفاجئ (منعكس كوشينغ) ، وغياب ردود الفعل ، وتوسع الحدقة الثنائي ، وانقطاع النفس. بعد التأكيد ، توقف عن التخدير واحتفظ بالحيوان على التهوية الميكانيكية لمدة 360 دقيقة.
6. ضع مصدرا للحرارة في مكان قريب لتجنب انخفاض حرارة الجسم.
7. في نهاية البروتوكول ، قم بحصاد الكتلة الرئوية في TLC للتجميع وإما تجميدها في النيتروجين السائل أو وضعها في محلول تثبيت لمزيد من الدراسات.
   ملاحظة: بمساعدة جهاز التنفس الصناعي للحيوانات الصغيرة ، يمكن الوصول إلى معلمات التهوية أثناء البروتوكول. في هذه الدراسة ، قمنا بتقييم هذه المعلمات مباشرة قبل تحريض BD (خط الأساس) وبعد 360 دقيقة (نهائي).

النتائج

متوسط الضغط الشرياني (MAP)
لتحديد تداعيات الدورة الدموية ل BD و HS ، تم تقييم MAP عبر 360 دقيقة من البروتوكول. تم جمع قياس خط الأساس بعد إزالة الجلد وحفر الجمجمة وقبل جمع حصصة الدم للحيوانات المعرضة ل BD أو HS ، على التوالي. قبل تحريض BD و HS ، كانت خطة MAP الأساسية للمجموعتين متشابهة (BD: 110.5 ± 6.1 ...

Discussion

في السنوات الأخيرة ، أدى العدد المتزايد من تشخيصات الموت الدماغي إلى أن تصبح أكبر مزود للأعضاء والأنسجة المخصصة للزراعة. ومع ذلك ، فقد رافق هذا النمو زيادة لا تصدق في التبرعات بعد موت الدورة الدموية. على الرغم من طبيعتها متعددة العوامل ، فإن معظم الآليات المسببة لأسباب الوفاة تبدأ بعد أو ت...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
14-gauge angiocath	DB	38186714	Orotracheal intubation
2.0-silk	Brasuture	AA553	Tracheal tube fixation
24-gauge angiocath	DB	38181214	Arterial and venous access
4.0-silk	Brasuture	AA551	Fixation of arterial and venous cannulas
Alcoholic chlorhexidine digluconate solution (2%).	Vic Pharma	Y/N	Asepsis
Trichotomy apparatus	Oster	Y/N	Clipping device
Precision balance	Shimadzu	D314800051	Analysis of the wet/dry weight ratio
Barbiturate (Thiopental)	Cristália	18080003	DC induction
Balloon catheter (Fogarty-4F)	Edwards Life Since	120804	BD induction
Neonatal extender	Embramed	497267	Used as catheters with the aid of the 24 G angiocath
FlexiVent	Scireq	1142254	Analysis of ventilatory parameters
Heparin	Blau Farmaceutica SA	7000982-06	Anticoagulant
Isoflurane	Cristália	10,29,80,130	Inhalation anesthesia
Micropipette (1000 µL)	Eppendorf	347765Z	Handling of small- volume liquids
Micropipette (20 µL)	Eppendorf	H19385F	Handling of small- volume liquids
Microscope	Zeiss	1601004545	Assistance in the visualization of structures for the surgical procedure
Multiparameter monitor	Dixtal	101503775	MAP registration
Motorized drill	Midetronic	MCA0439	Used to drill a 1 mm caliber borehole
Neubauer chamber	Kasvi	D15-BL	Cell count
Pediatric laryngoscope	Oxygel	Y/N	Assistance during tracheal intubation
Syringe (3 mL)	SR	3330N4	Hydration and exsanguination during HS protocol
Pressure transducer	Edwards Life Since	P23XL	MAP registration
Metallic tracheal tube	Biomedical	006316/12	Rigid cannula for analysis with the FlexiVent ventilator
Isoflurane vaporizer	Harvard Bioscience	1,02,698	Anesthesia system
Mechanical ventilator for small animals (683)	Harvard Apparatus	MA1 55-0000	Mechanical ventilation
xMap methodology	Millipore	RECYTMAG-65K-04	Analysis of inflammatory markers