חקר מודלים ניסיוניים לתרומת איברים להשתלת ריאות

Summary

המחקר הנוכחי מראה את הקמתם של שלושה מודלים שונים של תרומת ריאות (תרומה לאחר מוות מוחי, תרומת מוות לאחר מחזור הדם ותרומת הלם לאחר דימומים). הוא משווה את התהליכים הדלקתיים וההפרעות הפתולוגיות הקשורות לאירועים אלה.

Abstract

מודלים ניסיוניים הם כלים חשובים להבנת התופעות האטיולוגיות המעורבות באירועים פתופיזיולוגיים שונים. בהקשר זה, מודלים שונים של בעלי חיים משמשים לחקר האלמנטים המפעילים את הפתופיזיולוגיה של תפקוד לקוי של השתל הראשוני לאחר ההשתלה כדי להעריך טיפולים פוטנציאליים. כיום, אנו יכולים לחלק מודלים ניסיוניים של תרומות לשתי קבוצות גדולות: תרומה לאחר מוות מוחי ותרומה לאחר דום דם. בנוסף, יש לשקול את ההשפעות המזיקות הקשורות להלם דימומי כאשר בוחנים מודלים של בעלי חיים של תרומת איברים. במאמר זה נתאר את הקמתם של שלושה מודלים שונים של תרומת ריאות (תרומת לאחר מוות מוחי, תרומת מוות לאחר מחזור הדם ותרומת הלם לאחר דימומים) ונשווה את התהליכים הדלקתיים וההפרעות הפתולוגיות הקשורות לאירועים אלה. המטרה היא לספק לקהילה המדעית מודלים אמינים של בעלי חיים של תרומת ריאות לחקר המנגנונים הפתולוגיים הקשורים וחיפוש מטרות טיפוליות חדשות כדי לייעל את מספר השתלים ברי קיימא להשתלה.

Introduction

רלוונטיות קלינית
השתלת איברים היא אפשרות טיפולית מבוססת היטב למספר פתולוגיות חמורות. בשנים האחרונות הושגו התקדמויות רבות בתחומים הקליניים והניסיוניים של השתלות איברים, כגון ידע רב יותר על הפתופיזיולוגיה של תפקוד לקוי של השתל הראשוני (PGD) והתקדמות בתחומי טיפול נמרץ, אימונולוגיה ופרמקולוגיה ^1,2,3. למרות ההישגים והשיפורים באיכות ההליכים הכירורגיים והפרמקולוגיים הקשורים, הקשר בין מספר האיברים הזמינים למספר המושתלים ברשימת ההמתנה נותר אחד האתגרים העיקריים ^2,4. בהקשר זה, הספרות המדעית הציעה מודלים של בעלי חיים לחקר טיפולים שניתן ליישם על תורמי איברים לטיפול ו/או שימור האיברים עד למועד ההשתלה 5,6,7,8.

על ידי חיקוי האירועים השונים שנצפו בפרקטיקה הקלינית, מודלים של בעלי חיים מאפשרים לחקור את המנגנונים הפתולוגיים הקשורים ואת הגישות הטיפוליות שלהם. האינדוקציה הניסיונית של אירועים אלה, ברוב המקרים הבודדים, יצרה מודלים ניסיוניים של תרומת איברים ורקמות הנחקרים באופן נרחב בספרות המדעית על השתלות איברים 6,7,8,9. מחקרים אלה משתמשים באסטרטגיות מתודולוגיות שונות, כגון אלה הגורמות למוות מוחי (BD), הלם דימומי (HS) ומוות במחזור הדם (CD), שכן אירועים אלה קשורים לתהליכים מזיקים שונים המסכנים את הפונקציונליות של האיברים והרקמות שנתרמו.

מוות מוחי (BD)
BD קשורה לסדרה של אירועים המובילים להידרדרות פרוגרסיבית של מערכות שונות. זה קורה בדרך כלל כאשר עלייה חריפה או הדרגתית בלחץ תוך גולגולתי (ICP) קורה עקב טראומה מוחית או דימום. עלייה זו ב- ICP מקדמת עלייה בלחץ הדם בניסיון לשמור על זרימת דם מוחית יציבה בתהליך המכונה רפלקס^{קושינג 10,11}. שינויים חריפים אלה עלולים לגרום להפרעות בתפקוד הלב וכלי הדם, האנדוקריניות והנוירולוגיות הפוגעות בכמות ואיכות האיברים הנתרמים, בנוסף להשפעה על התחלואה והתמותה לאחר ההשתלה 10,11,12,13.

הלם דימומי (HS)
HS, בתורו, קשור לעתים קרובות עם תורמי איברים, שכן רובם קורבנות של טראומה עם אובדן משמעותי של נפח הדם. איברים מסוימים, כגון הריאות והלב, פגיעים במיוחד ל- HS עקב היפובולמיה וכתוצאה מכך היפופרפוזיה של רקמות¹⁴. HS גורם לפגיעה ריאתית באמצעות חדירות נימים מוגברת, בצקת וחדירה של תאים דלקתיים, מנגנונים שיחד פוגעים בחילוף הגזים ומובילים להידרדרות מתקדמת של איברים, וכתוצאה מכך משבשים את תהליך התרומה ^6,14.

מוות במחזור הדם (CD)
השימוש בתרומת תקליטורים לאחר תרומת תקליטורים גדל באופן אקספוננציאלי במרכזים מרכזיים בעולם, ובכך תורם לגידול במספר האיברים שנאספו. איברים שנמצאו מתורמים לאחר CD פגיעים להשפעות של איסכמיה חמה, המתרחשת לאחר מרווח של אספקת דם נמוכה (שלב אגוני) או ללא אספקת דם (שלב אסיסטולי)^8,15. Hypoperfusion או היעדר זרימת הדם יוביל היפוקסיה רקמות הקשורים אובדן פתאומי של ATP הצטברות של רעלים מטבוליים ברקמות¹⁵. למרות השימוש הנוכחי בו להשתלה בפרקטיקה הקלינית, נותרו ספקות רבים לגבי השפעת השימוש באיברים אלה על איכות השתל שלאחר ההשתלה ועל הישרדות המטופל¹⁵. לפיכך, השימוש במודלים ניסיוניים להבנה טובה יותר של הגורמים האטיולוגיים הקשורים לתקליטור גדל גם הוא 8,15,16,17.

מודלים ניסיוניים
ישנם מודלים ניסיוניים שונים לתרומת איברים (BD, HS ו-CD). עם זאת, מחקרים מתמקדים לעתים קרובות רק באסטרטגיה אחת בכל פעם. קיים פער ניכר במחקרים המשלבים או משווים בין שתי אסטרטגיות או יותר. מודלים אלה שימושיים מאוד בפיתוח טיפולים המבקשים להגדיל את מספר התרומות וכתוצאה מכך להקטין את רשימת ההמתנה של מושתלים פוטנציאליים. מיני בעלי החיים המשמשים למטרה זו משתנים ממחקר למחקר, כאשר מודלים חזיריים נבחרים בדרך כלל כאשר המטרה היא תרגום ישיר יותר עם הפיזיולוגיה של מורפו האנושי ופחות קושי טכני בהליך הכירורגי בשל גודל החיה. למרות היתרונות, קשיים לוגיסטיים ועלויות גבוהות קשורים למודל החזירי. מאידך גיסא, העלות הנמוכה והאפשרות למניפולציה ביולוגית מעדיפים את השימוש במודלים של מכרסמים, המאפשרים לחוקר להתחיל ממודל אמין להתרבות ולטפל בנגעים, כמו גם לשלב את הידע שנרכש בתחום השתלות האיברים.

כאן, אנו מציגים מודל מכרסמים של מוות מוחי, מוות במחזור הדם, ותרומת הלם דימומי. אנו מתארים תהליכים דלקתיים ומצבים פתולוגיים הקשורים לכל אחד מהמודלים הללו.

Protocol

ניסויים בבעלי חיים עמדו בדרישות ועדת האתיקה לשימוש וטיפול בבעלי חיים ניסיוניים של הפקולטה לרפואה של אוניברסיטת סאו פאולו (פרוטוקול מספר 112/16).

1. קיבוץ בעלי חיים

1. הקצו באופן אקראי שנים-עשר זכרים של חולדות Sprague Dawley (250-300 גרם) לאחת משלוש קבוצות ניסוי (n=4) כדי לנתח ולהשוות את ההשפעות הקשורות למודלים של בעלי חיים.
2. הקצאת בעלי חיים לקבוצת הלם דימומי (HS, n = 4): בעלי חיים הנתונים לצנתור כלי דם עם השראת הלם דימום + תחזוקה למשך 360 דקות + מיצוי בלוק לב-ריאתי + הכנת דגימה לניתוח.
3. הקצאת בעלי חיים לקבוצת מוות מוחי (BD, n = 4): בעלי חיים הנתונים למוות מוחי + תחזוקה למשך 360 דקות + מיצוי בלוק לב-ריאתי + הכנת דגימה לניתוח.
4. הקצאת בעלי חיים לקבוצת מוות במחזור הדם (CD, n = 4): בעלי חיים הנתונים לצנתור כלי דם + השראת מוות במחזור הדם + השעיית הנשמה + איסכמיה בטמפרטורת החדר למשך 180 דקות + הכנת דגימה לניתוח.

2. הרדמה והכנה טרום ניתוחית

1. מניחים את החולדה בתא סגור עם 5% איזופלורן למשך 1 - 4 דקות. ודא הרדמה נכונה על ידי בדיקת רפלקס צביטת הבוהן. בהיעדר תגובות רפלקס (ללא נסיגת כפות), בצע אינטובציה אורוטרכאלית (אנגיוקאת 14-G) בעזרת לרינגוסקופ ילדים.
2. באמצעות מכונת הנשמה מכנית שהותאמה בעבר (FiO₂ 100%, נפח גאות ושפל 10 מ"ל/ק"ג, 90 מחזורים לדקה ו-PEEP 3.0 cmH₂O), חברו את קטטר קנה הנשימה למכונת ההנשמה והתאימו את ריכוז חומר ההרדמה ל-2%.
   הערה: כל ההליכים הקשורים למודלים של בעלי חיים פעלו לפי אותו פרוטוקול הרדמה המתואר בסעיף זה.
3. הסר פרווה מאזורי העניין (ראש, צוואר, חזה ובטן). לאחר מכן, באמצעות גזה, לחטא את שדה הניתוח ואת זנב החיה. החיטוי מתבצע עם שלושה סיבובים לסירוגין של פתרון אלכוהולי של פילינג chlorhexidine digluconate.
4. חתכו את קצה זנבו של בעל החיים, הניחו את האגודל ואת האצבע המורה על בסיס הזנב, ולאחר מכן לחצו והחליקו אותם הרחק מהבסיס. לאסוף דגימת דם היקפית (20 μL) דרך הזנב עבור ספירת לויקוציטים הכוללת⁸.
   הערה: הליך זה חייב להתבצע לפני תחילת קנה הנשימה ומיד בסוף כל פרוטוקול (BD ו- HS - לאחר 360 דקות).
5. השתמש פיפטה מדויקת כדי לדלל את הדם שנאסף ב 380 μL (1:20) של תמיסה של טורק (חומצה אצטית קרחונית 99%). לאחר הדילול, הכניסו את דגימת הדם לתא נויבאואר והניחו אותה תחת מיקרוסקופ (40x). בצע את ספירת לויקוציטים הכוללת בארבעת הרבעים הרוחביים של החדר.

3. טרכאוסטומיה

1. בעזרת מספריים ומלקחיים מתאימים, לבצע דיסקציה אורכית של קנה הנשימה הצווארי, החל מהשליש האמצעי של הצוואר לחריץ suprasternal (חתך 1.5 ס"מ). לאחר החתך של העור והרקמה התת עורית, לנתח את שרירי צוואר הרחם עד קנה הנשימה נחשף.
2. מניחים רצועת משי אחת 2-0 מתחת לקנה הנשימה.
3. באמצעות microscissors, tracheostomize את השליש העליון של קנה הנשימה כדי להשיג אוורור אחיד. חותכים אופקית את קנה הנשימה בין שתי טבעות סחוס כדי להתאים לקוטר של צינורית מתכת (3.5 ס"מ).
4. הכנס את צינור האוורור ותקן אותו עם ליגטורות מוכנות.
5. חבר את צינור האוורור למערכת האוורור של בעלי חיים קטנים.
6. אווררו את החולדה עם נפח גאות של 10 מ"ל/ק"ג, קצב של 70 מחזורים לדקה, ו-PEEP של 3 ס"מ ג'₂O.

4. עורק הירך וצנתור ורידים

1. חשוף את משולש הירך דרך חתך קטן (1.5 ס"מ) באזור המפשעה. לזהות ולבודד את כלי הירך. עבור הליך זה, השתמש בסטריאומיקרוסקופ (הגדלה פי 3.2).
2. הניחו שתי ליגטורות משי 4-0 מתחת לכלי הדם (וריד או עורק), האחת רחוקה והשנייה קרובה. סגור את הליגטורה הדיסטלית ביותר, ולאחר מכן הנח קשר מותאם מראש בליגטורה הפרוקסימלית ומשוך.
3. הכנס את הצנתר דרך חתך קטן שנוצר מראש בכלי הדם. קבע את הצינורית כדי למנוע נקע.
   הערה: יש להפוך את הצנתרים ממאריך יילודים בקוטר 20 ס"מ המרותך בחימום לצנתר היקפי תוך ורידי המתאים לקליבר הרשת הוורידית של בעל החיים, ובכך למנוע השבה של תכולת הדם. לשמן את הצינורית עם הפרין, הימנעות היווצרות של טרומבי וסיבוכים במהלך מדידת לחץ עורקים ממוצע (MAP).
4. חבר את צנתר העורק למתמר לחץ ולמערכת ניטור סימנים חיונית כדי לרשום את הלחץ העורקי הממוצע (MAP). המתמר צריך להיות ממוקם בגובה הלב של החיה. הקלט את המפה כל פרק זמן של 10 דקות.
5. הכניסו את צנתר המזרק (3 מ"ל) לווריד, במטרה להידרציה ולסגנציה בעת הצורך.

5. אינדוקציה הלם Hemorrhagic

1. באמצעות גישה ורידית ועם מזרק heparinized, להסיר כמויות קטנות של דם עד ערכי MAP של 50 מ"מ כספית הם הגיעו, ובכך ליצור הלם דימומי.
   הערה: לאסוף aliquot 2 מ"ל של דם כל 10 דקות בשעה הראשונה של הניסוי וכל 30 דקות בשעות שלאחר מכן.
2. שמור על לחץ יציב על כ 50 מ"מ כספית לתקופה של 360 דקות. לשם כך, להסיר או להוסיף aliquots של דם אם הלחץ עולה או יורד, בהתאמה.
3. שים מקור חום בקרבת מקום כדי למנוע היפותרמיה.
   הערה: כאן, נעשה שימוש במנורת חום.
4. בסוף הפרוטוקול, קצרו את הבלוק הריאתי בקיבולת הריאה הכוללת (TLC) והקפיאו בחנקן נוזלי או הניחו אותו בתמיסת קיבוע למחקרים נוספים.
   הערה: בעזרת מכונת הנשמה של בעלי חיים קטנים, ניתן לגשת לפרמטרי האוורור במהלך הפרוטוקול. במחקר הנוכחי, פרמטרים אלה הוערכו מיד לפני אינדוקציה HS (בסיסי) ו 360 דקות מאוחר יותר (סופי).

6. זירוז מוות במחזור הדם

1. כדי לגרום למוות במחזור הדם, יש לתת 150 מ"ג/ק"ג נתרן תיאופנטל דרך קו הוורידים. לאחר מכן כבה את מערכת האוורור.
2. שים לב לירידה ההדרגתית ב- MAP עד שהיא מגיעה ל- 0 מ"מ כספית. מנקודה זו, שקול את תחילת תקופת איסכמיה חמה ולהתחיל את ספירת הזמן. בעל החיים צריך להישאר בטמפרטורת החדר (כ 22 ° C) במשך 180 דקות.
3. בסוף הפרוטוקול, חבר מחדש את הריאות למכונת ההנשמה המכנית וקצור את בלוק הריאות ב- TLC לאיסוף. או להקפיא הבזק באמצעות חנקן נוזלי או למקם אותו בתמיסת הקיבוע למחקרים נוספים.

7. השראת מוות מוחי

1. הניחו את החולדה במצב נוטה.
2. הסר את העור מהגולגולת באמצעות מספריים כירורגיים. קדח קידוח בקוטר 1 מ"מ קדמי בקוטר 2.80 מ"מ וגחוני 10.0 מ"מ לברגמה ו-1.5 מ"מ רוחבי לתפר הסגיטלי.
3. הכניסו את כל צנתר הבלון לחלל הגולגולת וודאו שהבלון ממולא מראש במי מלח (500 μL).
4. בעזרת מזרק, במהירות לנפח את הצנתר.
5. אשרו מוות מוחי על ידי התבוננות בגובה פתאומי של MAP (רפלקס קושינג), היעדר רפלקסים, מידריאזיס דו-צדדי ודום נשימה. לאחר האישור, יש להפסיק את ההרדמה ולהשאיר את בעל החיים על הנשמה מכנית למשך 360 דקות.
6. הניחו מקור חום בקרבת מקום כדי למנוע היפותרמיה.
7. בסוף הפרוטוקול, קצרו את בלוק הריאתי ב-TLC לאיסוף והקפיאו בחנקן נוזלי או הניחו אותו בתמיסת קיבוע למחקרים נוספים.
   הערה: בעזרת מכונת הנשמה של בעלי חיים קטנים, ניתן לגשת לפרמטרי האוורור במהלך הפרוטוקול. במחקר הנוכחי, הערכנו פרמטרים אלה מיד לפני אינדוקציה BD (בסיסי) ולאחר 360 דקות (סופי).

תוצאות

לחץ עורקים ממוצע (MAP)
כדי לקבוע את ההשלכות ההמודינמיות של BD ו- HS, MAP הוערך לאורך 360 הדקות של הפרוטוקול. המדידה הבסיסית נאספה לאחר הסרת עור וקידוח גולגולת ולפני איסוף אליציטוט דם לבעלי חיים הנתונים BD או HS, בהתאמה. לפני השראת BD ו-HS, מפת הבסיס של שתי הקבוצות הייתה דומה (BD: 110.5 ± 6.1 לעומת HS: 1...

Discussion

בשנים האחרונות, המספר ההולך וגדל של אבחונים של מוות מוחי הוביל אותה להיות הספקית הגדולה ביותר של איברים ורקמות המיועדים להשתלה. צמיחה זו, עם זאת, לוותה בגידול מדהים בתרומות לאחר מוות במחזור. למרות אופיו הרב-גורמי, רוב המנגנונים המפעילים של סיבות המוות מתחילים לאחר טראומה או מלווים אותה עם ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
14-gauge angiocath	DB	38186714	Orotracheal intubation
2.0-silk	Brasuture	AA553	Tracheal tube fixation
24-gauge angiocath	DB	38181214	Arterial and venous access
4.0-silk	Brasuture	AA551	Fixation of arterial and venous cannulas
Alcoholic chlorhexidine digluconate solution (2%).	Vic Pharma	Y/N	Asepsis
Trichotomy apparatus	Oster	Y/N	Clipping device
Precision balance	Shimadzu	D314800051	Analysis of the wet/dry weight ratio
Barbiturate (Thiopental)	Cristália	18080003	DC induction
Balloon catheter (Fogarty-4F)	Edwards Life Since	120804	BD induction
Neonatal extender	Embramed	497267	Used as catheters with the aid of the 24 G angiocath
FlexiVent	Scireq	1142254	Analysis of ventilatory parameters
Heparin	Blau Farmaceutica SA	7000982-06	Anticoagulant
Isoflurane	Cristália	10,29,80,130	Inhalation anesthesia
Micropipette (1000 µL)	Eppendorf	347765Z	Handling of small- volume liquids
Micropipette (20 µL)	Eppendorf	H19385F	Handling of small- volume liquids
Microscope	Zeiss	1601004545	Assistance in the visualization of structures for the surgical procedure
Multiparameter monitor	Dixtal	101503775	MAP registration
Motorized drill	Midetronic	MCA0439	Used to drill a 1 mm caliber borehole
Neubauer chamber	Kasvi	D15-BL	Cell count
Pediatric laryngoscope	Oxygel	Y/N	Assistance during tracheal intubation
Syringe (3 mL)	SR	3330N4	Hydration and exsanguination during HS protocol
Pressure transducer	Edwards Life Since	P23XL	MAP registration
Metallic tracheal tube	Biomedical	006316/12	Rigid cannula for analysis with the FlexiVent ventilator
Isoflurane vaporizer	Harvard Bioscience	1,02,698	Anesthesia system
Mechanical ventilator for small animals (683)	Harvard Apparatus	MA1 55-0000	Mechanical ventilation
xMap methodology	Millipore	RECYTMAG-65K-04	Analysis of inflammatory markers