Untersuchung experimenteller Organspendemodelle für die Lungentransplantation

Zusammenfassung

Die vorliegende Studie zeigt die Etablierung von drei verschiedenen Lungenspendemodellen (Post-Hirntod-Spende, Post-Kreislauftod-Spende und Post-Hämorrhagische Schockspende). Sie vergleicht die mit diesen Ereignissen verbundenen entzündlichen Prozesse und pathologischen Störungen.

Zusammenfassung

Experimentelle Modelle sind wichtige Werkzeuge, um die ätiologischen Phänomene zu verstehen, die an verschiedenen pathophysiologischen Ereignissen beteiligt sind. In diesem Zusammenhang werden verschiedene Tiermodelle verwendet, um die Elemente zu untersuchen, die die Pathophysiologie der primären Transplantatdysfunktion nach Transplantation auslösen, um mögliche Behandlungen zu bewerten. Derzeit können wir experimentelle Spendemodelle in zwei große Gruppen einteilen: Spende nach Hirntod und Spende nach Kreislaufstillstand. Darüber hinaus sollten die schädlichen Auswirkungen eines hämorrhagischen Schocks berücksichtigt werden, wenn Tiermodelle für Organspenden in Betracht gezogen werden. Hier beschreiben wir die Etablierung von drei verschiedenen Lungenspendemodellen (Post-Hirntod-Spende, Post-Kreislauf-Todesspende und Post-Hämorrhagische Schockspende) und vergleichen die mit diesen Ereignissen verbundenen entzündlichen Prozesse und pathologischen Störungen. Ziel ist es, der wissenschaftlichen Gemeinschaft zuverlässige Tiermodelle der Lungenspende zur Verfügung zu stellen, um die damit verbundenen pathologischen Mechanismen zu untersuchen und nach neuen therapeutischen Zielen zu suchen, um die Anzahl der lebensfähigen Transplantate für die Transplantation zu optimieren.

Einleitung

Klinische Relevanz
Die Organtransplantation ist eine etablierte therapeutische Option für verschiedene schwere Erkrankungen. In den letzten Jahren wurden viele Fortschritte auf dem klinischen und experimentellen Gebiet der Organtransplantation erzielt, wie z. B. ein besseres Wissen über die Pathophysiologie der primären Transplantatdysfunktion (PID) und Fortschritte in den Bereichen Intensivmedizin, Immunologie und Pharmakologie ^1,2,3. Trotz der Errungenschaften und Verbesserungen bei der Qualität der damit verbundenen chirurgischen und pharmakologischen Verfahren bleibt das Verhältnis zwischen der Anzahl der verfügbaren Organe und der Anzahl der Empfänger auf der Warteliste eine der größten Herausforderungen ^2,4. In diesem Zusammenhang wurden in der wissenschaftlichen Literatur Tiermodelle für die Untersuchung von Therapien vorgeschlagen, die bei Organspendern angewendet werden können, um die Organe bis zum Zeitpunkt der Transplantation zu behandeln und/oder zu erhalten 5,6,7,8.

Durch die Nachahmung der verschiedenen in der klinischen Praxis beobachteten Ereignisse ermöglichen Tiermodelle die Untersuchung der damit verbundenen pathologischen Mechanismen und ihrer jeweiligen therapeutischen Ansätze. Die experimentelle Induktion dieser Ereignisse hat in den meisten Einzelfällen experimentelle Modelle der Organ- und Gewebespende hervorgebracht, die in der wissenschaftlichen Literatur zur Organtransplantation umfassend untersucht werden 6,7,8,9. Diese Studien verwenden unterschiedliche methodische Strategien, wie z. B. die Induktion des Hirntods (BD), des hämorrhagischen Schocks (HS) und des Kreislauftodes (CD), da diese Ereignisse mit verschiedenen schädlichen Prozessen verbunden sind, die die Funktionalität der gespendeten Organe und Gewebe beeinträchtigen.

Hirntod (BD)
BD ist mit einer Reihe von Ereignissen verbunden, die zu einer fortschreitenden Verschlechterung verschiedener Systeme führen. Sie tritt in der Regel auf, wenn ein akuter oder allmählicher Anstieg des Hirndrucks (ICP) aufgrund eines Hirntraumas oder einer Blutung auftritt. Dieser Anstieg des ICP fördert einen Anstieg des Blutdrucks, um einen stabilen zerebralen Blutfluss aufrechtzuerhalten, ein Prozess, der als Cushing-Reflex bekannt ist^10,11. Diese akuten Veränderungen können zu kardiovaskulären, endokrinen und neurologischen Funktionsstörungen führen, die die Quantität und Qualität der gespendeten Organe beeinträchtigen und sich auf die Morbidität und Mortalität nach der Transplantation auswirken 10,11,12,13.

Hämorrhagischer Schock (HS)
HS wiederum wird oft mit Organspendern in Verbindung gebracht, da die meisten von ihnen Opfer eines Traumas mit erheblichem Verlust des Blutvolumens sind. Einige Organe, wie die Lunge und das Herz, sind aufgrund von Hypovolämie und daraus resultierender Gewebehypoperfusion besonders anfällig für HS¹⁴. HS induziert Lungenschäden durch erhöhte Kapillarpermeabilität, Ödeme und Infiltration von Entzündungszellen, Mechanismen, die zusammen den Gasaustausch beeinträchtigen und zu einer fortschreitenden Verschlechterung der Organe führen, wodurch der Spendeprozess entgleist ^6,14.

Kreislauftod (CD)
Die Verwendung von Post-CD-Spenden hat in den großen Zentren der Welt exponentiell zugenommen und trägt so zur Zunahme der Anzahl der gesammelten Organe bei. Organe, die von Post-CD-Spendern gewonnen wurden, sind anfällig für die Auswirkungen einer warmen Ischämie, die nach einem Intervall niedriger (agonische Phase) oder keiner Blutversorgung (asystostolische Phase) ^auftritt8,15. Eine Hypoperfusion oder das Fehlen eines Blutflusses führt zu einer Gewebehypoxie, die mit dem abrupten Verlust von ATP und der Ansammlung von Stoffwechseltoxinen im Gewebe einhergeht¹⁵. Trotz der derzeitigen Verwendung für die Transplantation in der klinischen Praxis bestehen nach wie vor viele Zweifel an den Auswirkungen der Verwendung dieser Organe auf die Qualität des Transplantats nach der Transplantation und auf das Überleben der Patienten¹⁵. So^{nimmt auch} die Verwendung von experimentellen Modellen für ein besseres Verständnis der ätiologischen Faktoren, die mit Zöliakie assoziiert sind, zu 8,15,16,17 zu.

Experimentelle Modelle
Es gibt verschiedene experimentelle Organspendemodelle (BD, HS und CD). Studien konzentrieren sich jedoch oft nur auf jeweils eine Strategie. Es gibt eine auffällige Lücke bei Studien, die zwei oder mehr Strategien kombinieren oder vergleichen. Diese Modelle sind sehr nützlich bei der Entwicklung von Therapien, die darauf abzielen, die Anzahl der Spenden zu erhöhen und damit die Warteliste potenzieller Empfänger zu verkürzen. Die Tierarten, die für diesen Zweck verwendet werden, variieren von Studie zu Studie, wobei Schweinemodelle häufiger ausgewählt werden, wenn das Ziel eine direktere Translation mit der menschlichen Morphophysiologie und weniger technische Schwierigkeiten beim chirurgischen Eingriff aufgrund der Größe des Tieres ist. Trotz der Vorteile sind mit dem Schweinemodell logistische Schwierigkeiten und hohe Kosten verbunden. Auf der anderen Seite begünstigen die niedrigen Kosten und die Möglichkeit der biologischen Manipulation die Verwendung von Nagetiermodellen, die es dem Forscher ermöglichen, von einem zuverlässigen Modell auszugehen, um Läsionen zu reproduzieren und zu behandeln sowie das im Bereich der Organtransplantation erworbene Wissen zu integrieren.

Hier stellen wir ein Nagetiermodell für Hirntod, Kreislauftod und hämorrhagische Schockspende vor. Wir beschreiben Entzündungsprozesse und pathologische Zustände, die mit jedem dieser Modelle verbunden sind.

Protokoll

Die Tierversuche entsprachen der Ethikkommission für die Verwendung und Pflege von Versuchstieren der Medizinischen Fakultät der Universität von São Paulo (Protokollnummer 112/16).

1. Gruppierung von Tieren

1. Zwölf männliche Sprague-Dawley-Ratten (250-300 g) wurden nach dem Zufallsprinzip einer von drei Versuchsgruppen (n=4) zugeteilt, um die mit den Tiermodellen verbundenen Effekte zu analysieren und zu vergleichen.
2. Zuordnung der Tiere zur hämorrhagischen Schockgruppe (HS, n=4): Tiere, die einer Gefäßkatheterisierung mit hämorrhagischer Schockinduktion + Aufrechterhaltung für 360 min + Herz-Lungen-Blockextraktion + Probenvorbereitung für die Analyse unterzogen wurden.
3. Zuordnung der Tiere zur Hirntodgruppe (BD, n=4): Tiere, die dem Hirntod ausgesetzt sind + Wartung für 360 min + Herz-Lungen-Blockextraktion + Probenvorbereitung für die Analyse.
4. Zuordnung der Tiere zur Kreislauftodgruppe (CD, n=4): Tiere, die einer Gefäßkatheterisierung unterzogen wurden + Induktion des Kreislauftodes + Unterbrechung der Beatmung + Ischämie bei Raumtemperatur für 180 min + Probenvorbereitung für die Analyse.

2. Anästhesie und präoperative Vorbereitung

1. Legen Sie die Ratte für 1 - 4 min in eine geschlossene Kammer mit 5% Isofluran. Bestätigen Sie die richtige Anästhesie, indem Sie den Zehenkneifreflex überprüfen. Wenn keine Reflexreaktionen auftreten (kein Pfotenretraktion), ist eine orotracheale Intubation (14-G-Angiocath) mit Hilfe eines pädiatrischen Laryngoskops durchzuführen.
2. Schließen Sie den Trachealkatheter mit einem zuvor eingestellten mechanischen Beatmungsgerät (FiO₂ 100 %, Tidalvolumen 10 ml/kg, 90 Zyklen/min und PEEP 3,0 cmH₂O) an das Beatmungsgerät an und stellen Sie die Anästhesiekonzentration auf 2 % ein.
   HINWEIS: Alle Verfahren, die sich auf Tiermodelle beziehen, folgten dem gleichen Anästhesieprotokoll, das in diesem Abschnitt beschrieben wird.
3. Entfernen Sie das Fell aus den interessierenden Regionen (Kopf, Hals, Brust und Bauch). Desinfizieren Sie dann mit Gaze das Operationsfeld und den Schwanz des Tieres. Die Desinfektion erfolgt mit drei abwechselnden Runden einer alkoholischen Lösung des Chlorhexidin-Digluconat-Peelings.
4. Schneiden Sie die Schwanzspitze des Tieres ab, legen Sie den Daumen und den Zeigefinger über den Schwanzansatz und drücken Sie sie dann von der Basis weg und schieben Sie sie weg. Entnehmen Sie eine periphere Blutprobe (20 μl) durch den Schwanz für die Gesamtleukozytenzahl⁸.
   HINWEIS: Dieses Verfahren muss vor Beginn der Tracheostomie und unmittelbar am Ende jedes Protokolls (BD und HS - nach 360 min) durchgeführt werden.
5. Verwenden Sie eine Präzisionspipette, um das gesammelte Blut in 380 μl (1:20) Turk-Lösung (Eisessig 99%) zu verdünnen. Nach der Verdünnung wird die Blutprobe in eine Neubauer-Kammer pipettiert und unter ein Mikroskop gelegt (40x). Führen Sie die Gesamtleukozytenzahl in den vier seitlichen Quadranten der Kammer durch.

3. Tracheostomie

1. Führen Sie mit Hilfe einer geeigneten Schere und Pinzette eine Längsdissektion der zervikalen Luftröhre durch, beginnend mit dem mittleren Drittel des Halses bis zur suprasternalen Kerbe (1,5 cm Schnitt). Nach dem Schnitt der Haut und des Unterhautgewebes wird die Halsmuskulatur präpariert, bis die Luftröhre freiliegt.
2. Platzieren Sie eine 2-0-Seidenligatur unter der Luftröhre.
3. Mit einer Mikroschere wird das obere Drittel der Luftröhre tracheotomiert, um eine gleichmäßige Belüftung zu erreichen. Schneiden Sie die Luftröhre horizontal zwischen zwei Knorpelringen, um den Durchmesser einer Metallkanüle (3,5 cm) aufzunehmen.
4. Führen Sie den Belüftungsschlauch ein und fixieren Sie ihn mit vorbereiteten Ligaturen.
5. Schließen Sie den Beatmungsschlauch an das Belüftungssystem für Kleintiere an.
6. Die Ratte wird mit einem Atemzugvolumen von 10 ml/kg, einer Rate von 70 Zyklen/min und einem PEEP von 3 cmH₂O beatmet.

4. Katheterisierung der Oberschenkelarterie und -vene

1. Legen Sie das Oberschenkeldreieck durch einen kleinen Schnitt (1,5 cm) in der Leistenregion frei. Identifizieren und isolieren Sie die Oberschenkelgefäße. Verwenden Sie für diesen Eingriff ein Stereomikroskop (3,2-fache Vergrößerung).
2. Platzieren Sie zwei 4-0-Seidenligaturen unter den Blutgefäßen (Vene oder Arterie), eine distal und die andere proximal. Schließen Sie die am weitesten entfernte Ligatur, setzen Sie dann einen voreingestellten Knoten in die proximale Ligatur und ziehen Sie daran.
3. Führen Sie den Katheter durch einen kleinen, vorgeformten Schnitt in die Gefäße ein. Fixieren Sie die Kanüle, um eine Verrenkung zu vermeiden.
   HINWEIS: Stellen Sie die Katheter aus einem 20 cm langen Neugeborenen-Extender, der durch Erhitzen mit einem peripheren intravenösen Katheter verschweißt wird, her, der für das Kaliber des venösen Netzwerks des Tieres geeignet ist, um so das Aufstoßen des Blutinhalts zu verhindern. Schmieren Sie die Kanüle mit Heparin, um die Bildung von Thromben und Komplikationen bei der Messung des mittleren arteriellen Drucks (MAP) zu vermeiden.
4. Schließen Sie den Arterienkatheter an einen Druckwandler und ein Vitalparameterüberwachungssystem an, um den mittleren arteriellen Druck (MAP) aufzuzeichnen. Der Schallkopf sollte auf Höhe des Herzens des Tieres positioniert werden. Zeichnen Sie den MAP alle 10 Minuten auf.
5. Führen Sie den Spritzenkatheter (3 ml) in die Vene ein und zielen Sie bei Bedarf auf Flüssigkeitszufuhr und Blutausblutung ab.

5. Induktion des hämorrhagischen Schocks

1. Durch venösen Zugang und mit einer heparinisierten Spritze werden kleine Blutmengen entnommen, bis MAP-Werte von 50 mmHg erreicht sind, wodurch ein hämorrhagischer Schock hergestellt wird.
   HINWEIS: Entnehmen Sie in der ersten Stunde des Experiments alle 10 Minuten und in den folgenden Stunden alle 30 Minuten ein 2-ml-Aliquot Blut.
2. Halten Sie den Druck 360 Minuten lang stabil bei ca. 50 mmHg. Um dies zu tun, entfernen oder fügen Sie Aliquots des Blutes hinzu, wenn der Druck steigt bzw. sinkt.
3. Stellen Sie eine Wärmequelle in die Nähe, um eine Unterkühlung zu vermeiden.
   HINWEIS: Hier wird eine Wärmelampe verwendet.
4. Am Ende des Protokolls wird der Lungenblock bei der Gesamtlungenkapazität (DC) entnommen und entweder in flüssigem Stickstoff schockgefroren oder für weitere Untersuchungen in eine Fixierlösung gelegt.
   HINWEIS: Mit Hilfe eines Kleintierbeatmungsgeräts können die Beatmungsparameter während des Protokolls abgerufen werden. In der vorliegenden Studie wurden diese Parameter unmittelbar vor der HS-Induktion (Baseline) und 360 min später (Final) evaluiert.

6. Induktion des Kreislauftodes

1. Um den Kreislauftod herbeizuführen, verabreichen Sie 150 mg/kg Natriumthiopental durch den venösen Zugang. Schalten Sie dann die Lüftungsanlage aus.
2. Man beachte die fortschreitende Abnahme des MAP-Wertes, bis er 0 mmHg erreicht. Betrachten Sie von diesem Punkt aus den Beginn der warmen Ischämieperiode und beginnen Sie mit der Zeitzählung. Das Tier sollte 180 Minuten lang bei Raumtemperatur (ca. 22 °C) bleiben.
3. Am Ende des Protokolls schließen Sie die Lunge wieder an das mechanische Beatmungsgerät an und entnehmen Sie den Lungenblock bei TLC zur Entnahme. Entweder mit flüssigem Stickstoff schockgefrieren oder für weitere Studien in die Fixierungslösung geben.

7. Induktion des Hirntods

1. Setze die Ratte in die Bauchlage.
2. Entfernen Sie die Haut vom Schädel mit einer chirurgischen Schere. Bohren Sie ein Bohrloch im Kaliber 1 mm, 2,80 mm anterior und 10,0 mm ventral zum Bregma und 1,5 mm lateral zur sagittalen Naht.
3. Führen Sie den gesamten Ballonkatheter in die Schädelhöhle ein und stellen Sie sicher, dass der Ballon mit Kochsalzlösung (500 μl) vorgefüllt ist.
4. Mit Hilfe einer Spritze wird der Katheter schnell aufgeblasen.
5. Bestätigen Sie den Hirntod, indem Sie eine abrupte MAP-Erhöhung (Cushing-Reflex), das Fehlen von Reflexen, bilaterale Mydriasis und Apnoe beobachten. Nach der Bestätigung ist die Narkose abzubrechen und das Tier 360 Minuten lang mechanisch zu beatmen.
6. Stellen Sie eine Wärmequelle in die Nähe, um eine Unterkühlung zu vermeiden.
7. Am Ende des Protokolls wird der Lungenblock bei TLC zur Entnahme entnommen und entweder in flüssigem Stickstoff schockgefroren oder für weitere Untersuchungen in eine Fixierlösung gelegt.
   HINWEIS: Mit Hilfe eines Kleintierbeatmungsgeräts können die Beatmungsparameter während des Protokolls abgerufen werden. In der vorliegenden Studie haben wir diese Parameter unmittelbar vor der BD-Induktion (Baseline) und nach 360 Minuten (Final) evaluiert.

Ergebnisse

Mittlerer arterieller Blutdruck (MAP)
Um die hämodynamischen Auswirkungen von BD und HS zu bestimmen, wurde MAP über die 360 Minuten des Protokolls ausgewertet. Die Baseline-Messung wurde nach Hautentfernung und Schädelbohrung sowie vor der Blutaliquotentnahme bei Tieren erhoben, die einer BD bzw. HS unterzogen wurden. Vor der BD- und HS-Induktion war die Baseline-MAP der beiden Gruppen ähnlich (BD: 110,5 ± 6,1 vs. HS: 105,8 ± 2,3 mmHg; p=0,5; Zwei-Wege-ANOVA). Nach Katheterinsufflation kam es i...

Diskussion

In den letzten Jahren hat die steigende Zahl von Hirntoddiagnosen dazu geführt, dass es zum größten Anbieter von Organen und Geweben für Transplantationen geworden ist. Dieses Wachstum ging jedoch mit einem unglaublichen Anstieg der Spenden nach dem Kreislauftod einher. Trotz seiner multifaktoriellen Natur beginnen die meisten Auslösemechanismen der Todesursachen nach einem Trauma oder begleiten es mit einem ausgedehnten Verlust des Blutgehalts ^4,18.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
14-gauge angiocath	DB	38186714	Orotracheal intubation
2.0-silk	Brasuture	AA553	Tracheal tube fixation
24-gauge angiocath	DB	38181214	Arterial and venous access
4.0-silk	Brasuture	AA551	Fixation of arterial and venous cannulas
Alcoholic chlorhexidine digluconate solution (2%).	Vic Pharma	Y/N	Asepsis
Trichotomy apparatus	Oster	Y/N	Clipping device
Precision balance	Shimadzu	D314800051	Analysis of the wet/dry weight ratio
Barbiturate (Thiopental)	Cristália	18080003	DC induction
Balloon catheter (Fogarty-4F)	Edwards Life Since	120804	BD induction
Neonatal extender	Embramed	497267	Used as catheters with the aid of the 24 G angiocath
FlexiVent	Scireq	1142254	Analysis of ventilatory parameters
Heparin	Blau Farmaceutica SA	7000982-06	Anticoagulant
Isoflurane	Cristália	10,29,80,130	Inhalation anesthesia
Micropipette (1000 µL)	Eppendorf	347765Z	Handling of small- volume liquids
Micropipette (20 µL)	Eppendorf	H19385F	Handling of small- volume liquids
Microscope	Zeiss	1601004545	Assistance in the visualization of structures for the surgical procedure
Multiparameter monitor	Dixtal	101503775	MAP registration
Motorized drill	Midetronic	MCA0439	Used to drill a 1 mm caliber borehole
Neubauer chamber	Kasvi	D15-BL	Cell count
Pediatric laryngoscope	Oxygel	Y/N	Assistance during tracheal intubation
Syringe (3 mL)	SR	3330N4	Hydration and exsanguination during HS protocol
Pressure transducer	Edwards Life Since	P23XL	MAP registration
Metallic tracheal tube	Biomedical	006316/12	Rigid cannula for analysis with the FlexiVent ventilator
Isoflurane vaporizer	Harvard Bioscience	1,02,698	Anesthesia system
Mechanical ventilator for small animals (683)	Harvard Apparatus	MA1 55-0000	Mechanical ventilation
xMap methodology	Millipore	RECYTMAG-65K-04	Analysis of inflammatory markers