폐이식을 위한 실험적 장기기증 모델 연구

요약

본 연구는 세 가지 다른 폐 기증 모델(뇌사 후 기증, 순환 후 사망 기증, 출혈 후 쇼크 기증)의 확립을 보여줍니다. 이러한 사건과 관련된 염증 과정과 병리학적 장애를 비교합니다.

초록

실험 모델은 다양한 병태생리학적 사건과 관련된 병인학적 현상을 이해하는 데 중요한 도구입니다. 이러한 맥락에서 이식 후 원발성 이식편 기능 장애의 병태생리를 유발하는 요소를 연구하여 잠재적인 치료법을 평가하기 위해 다양한 동물 모델을 사용합니다. 현재 우리는 실험적 기증 모델을 크게 뇌사 후 기증과 순환 정지 후 기증의 두 그룹으로 나눌 수 있습니다. 또한, 장기 기증의 동물 모델을 고려할 때 출혈성 쇼크와 관련된 해로운 영향을 고려해야 합니다. 여기서는 세 가지 폐 기증 모델(뇌사 후 기증, 순환 후 사망 기증, 출혈 후 쇼크 기증)의 확립을 설명하고 이러한 사건과 관련된 염증 과정과 병리학적 장애를 비교합니다. 목표는 관련 병리학적 메커니즘을 연구하고 이식을 위한 생존 가능한 이식편 수를 최적화하기 위한 새로운 치료 표적을 찾기 위해 신뢰할 수 있는 폐 기증 동물 모델을 과학계에 제공하는 것입니다.

서문

임상적 관련성
장기 이식은 여러 심각한 병리에 대해 잘 확립된 치료 옵션입니다. 최근 몇 년 동안 원발성 이식편 기능 장애(PGD)의 병태생리학에 대한 지식 향상과 집중 치료, 면역학 및 약리학 분야의 발전과 같은 장기 이식의 임상 및 실험 분야에서 많은 발전이 이루어졌습니다 ^1,2,3. 관련 수술 및 약리학적 시술의 성과와 질적 향상에도 불구하고, 이용 가능한 장기의 수와 대기자 명단에 있는 수혜자 수 사이의 관계는 여전히 주요 과제 중 하나로 남아 있다 ^2,4. 이와 관련하여, 과학 문헌은 이식 시점까지 장기를 치료 및/또는 보존하기 위해 장기 기증자에게 적용할 수 있는 치료법을 연구하기 위한 동물 모델을 제안했다 5,6,7,8.

임상 실습에서 관찰된 다양한 사건을 모방함으로써 동물 모델은 관련 병리학적 메커니즘과 각각의 치료 접근법을 연구할 수 있습니다. 이러한 사건의 실험적 유도는 대부분의 고립된 사례에서 장기 이식에 관한 과학 문헌에서 널리 조사된 장기 및 조직 기증의 실험 모델을 생성했다 6,7,8,9. 이러한 연구는 뇌사(BD), 출혈성 쇼크(HS) 및 순환사(CD)를 유발하는 것과 같은 다양한 방법론적 전략을 사용하는데, 이는 이러한 사건이 기증된 장기와 조직의 기능을 손상시키는 다양한 유해 과정과 관련이 있기 때문입니다.

뇌사 (BD)
BD는 다른 시스템의 점진적인 악화로 이어지는 일련의 사건과 관련이 있습니다. 일반적으로 뇌 외상이나 출혈로 인해 두개내압(ICP)의 급성 또는 점진적인 증가가 발생할 때 발생합니다. 이러한 ICP의 증가는 쿠싱 반사^10,11로 알려진 과정에서 안정적인 대뇌 혈류를 유지하기 위해 혈압 상승을 촉진합니다. 이러한 급격한 변화는 심혈관, 내분비, 신경학적 기능 장애를 일으켜 기증된 장기의 양과 질을 손상시킬 뿐만 아니라 이식 후 이환율과 사망률에 영향을 미칠 수 있다 10,11,12,13.

출혈성 쇼크(HS)
HS는 종종 장기 기증자와 관련이 있는데, 그들 중 대부분은 혈액량이 크게 손실된 외상의 희생자이기 때문입니다. 폐 및 심장과 같은 일부 장기는 저혈량혈증과 그에 따른 조직 저관류로 인해 HS에 특히 취약하다¹⁴. HS는 모세혈관 투과성 증가, 부종 및 염증 세포의 침윤을 통해 폐 손상을 유발하며, 이는 함께 가스 교환을 손상시키고 점진적인 장기 악화를 초래하여 결과적으로 기증 과정을 탈선시킵니다 ^6,14.

순환기 사망(CD)
CD 이후 기증의 사용은 세계 주요 센터에서 기하급수적으로 증가하고 있으며, 이에 따라 수집된 장기의 수가 증가하는 데 기여하고 있습니다. CD 기증 후 장기는 혈액 공급이 적거나(고통 단계) 혈액 공급이 전혀 없는(무수축^{기) 후에} 발생하는 온열 허혈의 영향에 취약합니다^8,15. 저관류 또는 혈류의 부재는 ATP의 갑작스런 손실과 조직 내 대사 독소의 축적과 관련된 조직 저산소증을 유발한다¹⁵. 현재 임상에서 이식에 사용되고 있음에도 불구하고, 이식 후 이식편의 질과 환자 생존율에 미치는 영향에 대해서는 여전히 많은 의구심이 남아 있다¹⁵. 따라서 CD와 관련된 병인학적 요인을 더 잘 이해하기 위한 실험 모델의 사용도 증가하고 있습니다 8,15,16,17.

실험 모델
다양한 실험적 장기 기증 모델(BD, HS, CD)이 있습니다. 그러나 연구는 종종 한 번에 하나의 전략에만 초점을 맞춥니다. 두 가지 이상의 전략을 결합하거나 비교하는 연구에서는 눈에 띄는 격차가 있습니다. 이러한 모델은 기증 횟수를 늘리고 결과적으로 잠재적 수혜자의 대기자 명단을 줄이려는 치료법 개발에 매우 유용합니다. 이 목적으로 사용되는 동물 종은 연구마다 다르며, 돼지 모델은 인간의 형태 생리학을 보다 직접적으로 번역하고 동물의 크기로 인한 수술 절차의 기술적 어려움이 적은 경우에 더 일반적으로 선택됩니다. 이점에도 불구하고 물류상의 어려움과 높은 비용은 돼지 모델과 관련이 있습니다. 반면에 생물학적 조작의 저렴한 비용과 가능성은 설치류 모델의 사용을 선호하여 연구자가 신뢰할 수 있는 모델에서 시작하여 병변을 재현 및 치료하고 장기 이식 분야에서 습득한 지식을 통합할 수 있도록 합니다.

여기에서는 뇌사, 순환사, 출혈성 쇼크 기증의 설치류 모델을 제시합니다. 우리는 이러한 각 모델과 관련된 염증 과정 및 병리학적 상태를 설명합니다.

프로토콜

동물 실험은 상파울루 대학교 의과대학의 실험동물 사용 및 관리 윤리위원회(프로토콜 번호 112/16)를 준수했습니다.

1. 동물 그룹화

1. 12마리의 수컷 Sprague Dawley 쥐(250-300g)를 3개의 실험 그룹(n=4) 중 하나에 무작위로 할당하여 동물 모델과 관련된 효과를 분석하고 비교합니다.
2. 출혈성 쇼크 그룹(HS, n=4)에 동물 할당: 출혈성 쇼크 유도로 혈관 카테터 삽입 + 360분 유지 + 심폐 차단 추출 + 분석을 위한 샘플 준비를 받은 동물.
3. 동물을 뇌사 그룹(BD, n=4)에 할당: 뇌사 + 360분 동안 유지 + 심폐 블록 추출 + 분석을 위한 샘플 준비 대상인 동물.
4. 동물을 순환 사망 그룹(CD, n=4)에 할당: 혈관 카테터 삽입 + 순환 사망 유도 + 환기 중단 + 실온에서 180분 동안 허혈 + 분석을 위한 샘플 준비를 받은 동물.

2. 마취 및 수술 전 준비

1. 쥐를 5% 이소플루란이 있는 밀폐된 챔버에 1 - 4분 동안 둡니다. 발가락 꼬집기 반사를 확인하여 적절한 마취를 확인합니다. 반사 반응이 없는 경우(발 후퇴 없음) 소아 후두경을 사용하여 구기관 삽관(14-G 혈관 삽관)을 수행합니다.
2. 이전에 조정된 기계식 인공호흡기(_FiO2 100%, 일회 호흡량 10mL/kg, 90주기/분, PEEP 3.0cmH2O)를 사용하여 기관카테터를 인공호흡기에 연결하고 마취 농도를 2%로 조정합니다.
   참고: 동물 모델과 관련된 모든 절차는 이 섹션에 설명된 것과 동일한 마취 프로토콜을 따랐습니다.
3. 관심 부위(머리, 목, 가슴 및 복부)에서 털을 제거합니다. 그런 다음 거즈를 사용하여 수술 부위와 동물의 꼬리를 소독합니다. 소독은 클로르헥시딘 디글루코네이트 스크럽의 알코올 용액을 3회 번갈아 가며 수행합니다.
4. 동물의 꼬리 끝을 자르고 엄지와 검지를 꼬리 밑면에 놓은 다음 눌러서 꼬리에서 밀어냅니다. 총 백혈구 수⁸을 위해 꼬리를 통해 말초 혈액 샘플(20μL)을 수집합니다.
   알림: 이 절차는 기관 절개술을 시작하기 전과 각 프로토콜이 끝날 때 즉시 수행해야 합니다(BD 및 HS - 360분 후).
5. 정밀 피펫을 사용하여 수집된 혈액을 380μL(1:20)의 Turk's 용액(빙초산 99%)으로 희석합니다. 희석되면 혈액 샘플을 Neubauer 챔버에 피펫팅하고 현미경(40x) 아래에 놓습니다. 챔버의 4개 측면 사분면에서 총 백혈구 수를 수행합니다.

3. 기관절개술

1. 적절한 가위와 집게를 사용하여 목의 중간 1/3에서 시작하여 흉골 상부 노치(1.5cm 절개)까지 경추 기관의 세로 절개를 수행합니다. 피부와 피하 조직을 절개 한 후 기관이 노출 될 때까지 경추 근육을 절개합니다.
2. 기관 아래에 2-0 실크 합자 하나를 놓습니다.
3. 미세 가위를 사용하여 기관의 위쪽 1/3을 기관절개하여 균일한 환기를 달성합니다. 금속 캐뉼라의 직경(3.5cm)을 수용하기 위해 두 개의 연골 고리 사이의 기관을 수평으로 자릅니다.
4. 환기 튜브를 삽입하고 준비된 합자로 고정하십시오.
5. 환기 튜브를 소동물 환기 시스템에 연결합니다.
6. 10mL/kg의 일회 호흡량, 70사이클/분의 속도, 3cmH_2O의 PEEP로 쥐를 환기시킵니다.

4. 대퇴 동맥 및 정맥 카테터 삽입

1. 사타구니 부위의 작은 절개(1.5cm)를 통해 대퇴골 삼각형을 노출시킵니다. 대퇴부 혈관을 식별하고 격리합니다. 이 절차에서는 실체현미경(3.2배 확대)을 사용합니다.
2. 혈관(정맥 또는 동맥) 아래에 두 개의 4-0 실크 합자를 하나는 원위에, 다른 하나는 근위부에 배치합니다. 가장 원위 합자를 닫은 다음 미리 조정된 매듭을 근위 합자에 넣고 당깁니다.
3. 혈관에 미리 형성된 작은 절개를 통해 카테터를 삽입합니다. 탈구를 방지하기 위해 캐뉼라를 고정하십시오.
   알림: 20cm 신생아 익스텐더의 카테터를 동물의 정맥 네트워크 구경에 적합한 주변 정맥 카테터에 가열하여 용접하여 혈액 내용물의 역류를 방지합니다. 캐뉼라에 헤파린을 바르고 평균 동맥압(MAP) 측정 중 혈전 형성 및 합병증을 방지합니다.
4. 동맥 카테터를 압력 변환기 및 생체 신호 모니터링 시스템에 연결하여 평균 동맥압(MAP)을 기록합니다. 변환기는 동물의 심장 높이에 위치해야 합니다. 10분마다 MAP을 기록합니다.
5. 주사기 카테터(3mL)를 정맥에 삽입하고 필요한 경우 수분 공급과 출혈을 목표로 합니다.

5. 출혈성 쇼크 유도

1. 정맥 접근을 통해 헤파린화 주사기를 사용하여 MAP 값이 50mmHg에 도달할 때까지 소량의 혈액을 제거하여 출혈성 쇼크를 일으킵니다.
   참고: 실험 첫 1시간 동안 10분마다, 이후 몇 시간 동안 30분마다 2mL의 혈액 분취액을 수집합니다.
2. 50분 동안 약 360mmHg에서 압력을 안정적으로 유지합니다. 이렇게하려면 압력이 각각 증가하거나 감소하는 경우 혈액의 부분 표본을 제거하거나 추가하십시오.
3. 저체온증을 피하기 위해 근처에 열원을 두십시오.
   알림: 여기서는 열 램프가 사용됩니다.
4. 프로토콜이 끝나면 총 폐활량(TLC)에서 폐 차단을 채취하고 액체 질소에서 급속 동결하거나 추가 연구를 위해 고정 용액에 넣습니다.
   알림: 작은 동물 인공호흡기의 도움으로 프로토콜 중에 인공호흡기 매개변수에 액세스할 수 있습니다. 본 연구에서 이러한 매개변수는 HS 유도 직전(기준선)과 360분 후(최종)에 평가되었습니다.

6. 순환 사망 유도

1. 순환계 사멸을 유도하려면 정맥 라인을 통해 150mg/kg의 티오펜탈 나트륨을 투여합니다. 그런 다음 환기 시스템을 끕니다.
2. MAP가 0mmHg에 도달할 때까지 점진적으로 감소하는 것을 볼 수 있습니다. 이 시점부터 온열 허혈 기간의 시작을 고려하고 시간 계산을 시작합니다. 동물은 실온(약 22°C)에서 180분 동안 유지되어야 합니다.
3. 프로토콜이 끝나면 폐를 기계 인공호흡기에 다시 연결하고 TLC에서 폐 차단을 채취하여 수집합니다. 액체 질소를 사용하여 급속 동결하거나 추가 연구를 위해 고정 용액에 넣으십시오.

7. 뇌사 유도

1. 쥐를 엎드린 자세로 놓습니다.
2. 수술용 가위를 사용하여 두개골에서 피부를 제거합니다. 1mm 구경 시추공을 브레그마에 전방 2.80mm, 복부 10.0mm, 시상 봉합사에 측면 1.5mm를 뚫습니다.
3. 전체 풍선 카테터를 두개강에 삽입하고 풍선에 식염수(500μL)가 미리 채워져 있는지 확인합니다.
4. 주사기를 사용하여 카테터를 빠르게 팽창시킵니다.
5. 갑작스런 MAP 상승(쿠싱 반사), 반사 부재, 양측 산동증 및 무호흡증을 관찰하여 뇌사를 확인합니다. 확인 후 마취를 중단하고 동물을 360분 동안 기계적 환기 상태로 유지하십시오.
6. 저체온증을 피하기 위해 근처에 열원을 두십시오.
7. 프로토콜이 끝나면 수집을 위해 TLC에서 폐 블록을 수확하고 액체 질소에서 급속 동결하거나 추가 연구를 위해 고정 용액에 넣습니다.
   알림: 작은 동물 인공호흡기의 도움으로 프로토콜 중에 인공호흡기 매개변수에 액세스할 수 있습니다. 본 연구에서는 BD 유도 직전(기준선)과 360분 후(최종)에 이러한 매개변수를 평가했습니다.

결과

평균 동맥압(MAP)
BD와 HS의 혈역학적 영향을 결정하기 위해 MAP은 프로토콜의 360분 동안 평가되었습니다. 기준선 측정은 피부 제거 및 두개골 드릴링 후 및 BD 또는 HS를 투여한 동물에 대한 혈액 부분 표본 수집 전에 각각 수집되었습니다. BD 및 HS 유도 이전에는 두 그룹의 기준선 MAP이 유사했습니다(BD: 110.5 ± 6.1 vs. HS: 105.8 ± 2.3mmHg; p=0.5; 양방향 ANOVA). 카테터 삽입 후 BD 그룹은 혈압 수치...

토론

최근 몇 년 동안 뇌사 진단의 수가 증가함에 따라 이식을 위한 장기 및 조직의 가장 큰 공급업체가 되었습니다. 그러나 이러한 성장은 순환기 사망 후 기증의 놀라운 증가를 동반했습니다. 다인자적 특성에도 불구하고, 사망 원인의 유발 메커니즘의 대부분은 광범위한 혈액 함량 손실을 동반한 외상 후에 시작되거나 동반된다 ^4,18.

?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
14-gauge angiocath	DB	38186714	Orotracheal intubation
2.0-silk	Brasuture	AA553	Tracheal tube fixation
24-gauge angiocath	DB	38181214	Arterial and venous access
4.0-silk	Brasuture	AA551	Fixation of arterial and venous cannulas
Alcoholic chlorhexidine digluconate solution (2%).	Vic Pharma	Y/N	Asepsis
Trichotomy apparatus	Oster	Y/N	Clipping device
Precision balance	Shimadzu	D314800051	Analysis of the wet/dry weight ratio
Barbiturate (Thiopental)	Cristália	18080003	DC induction
Balloon catheter (Fogarty-4F)	Edwards Life Since	120804	BD induction
Neonatal extender	Embramed	497267	Used as catheters with the aid of the 24 G angiocath
FlexiVent	Scireq	1142254	Analysis of ventilatory parameters
Heparin	Blau Farmaceutica SA	7000982-06	Anticoagulant
Isoflurane	Cristália	10,29,80,130	Inhalation anesthesia
Micropipette (1000 µL)	Eppendorf	347765Z	Handling of small- volume liquids
Micropipette (20 µL)	Eppendorf	H19385F	Handling of small- volume liquids
Microscope	Zeiss	1601004545	Assistance in the visualization of structures for the surgical procedure
Multiparameter monitor	Dixtal	101503775	MAP registration
Motorized drill	Midetronic	MCA0439	Used to drill a 1 mm caliber borehole
Neubauer chamber	Kasvi	D15-BL	Cell count
Pediatric laryngoscope	Oxygel	Y/N	Assistance during tracheal intubation
Syringe (3 mL)	SR	3330N4	Hydration and exsanguination during HS protocol
Pressure transducer	Edwards Life Since	P23XL	MAP registration
Metallic tracheal tube	Biomedical	006316/12	Rigid cannula for analysis with the FlexiVent ventilator
Isoflurane vaporizer	Harvard Bioscience	1,02,698	Anesthesia system
Mechanical ventilator for small animals (683)	Harvard Apparatus	MA1 55-0000	Mechanical ventilation
xMap methodology	Millipore	RECYTMAG-65K-04	Analysis of inflammatory markers