Estudio de modelos experimentales de donación de órganos para trasplante pulmonar

Resumen

El presente estudio muestra el establecimiento de tres modelos diferentes de donación pulmonar (donación post-muerte encefálica, donación post-muerte circulatoria y donación post-shock hemorrágico). Compara los procesos inflamatorios y los trastornos patológicos asociados a estos eventos.

Resumen

Los modelos experimentales son herramientas importantes para comprender los fenómenos etiológicos implicados en diversos eventos fisiopatológicos. En este contexto, se utilizan diferentes modelos animales para estudiar los elementos desencadenantes de la fisiopatología de la disfunción primaria del injerto después del trasplante para evaluar posibles tratamientos. Actualmente, podemos dividir los modelos experimentales de donación en dos grandes grupos: donación tras muerte encefálica y donación tras parada circulatoria. Además, los efectos nocivos asociados con el shock hemorrágico deben tenerse en cuenta al considerar modelos animales de donación de órganos. En este trabajo se describe el establecimiento de tres modelos diferentes de donación pulmonar (donación post-muerte encefálica, donación post-muerte circulatoria y donación post-shock hemorrágico) y se comparan los procesos inflamatorios y trastornos patológicos asociados a estos eventos. El objetivo es proporcionar a la comunidad científica modelos animales fiables de donación pulmonar para el estudio de los mecanismos patológicos asociados y la búsqueda de nuevas dianas terapéuticas para optimizar el número de injertos viables para trasplante.

Introducción

Relevancia clínica
El trasplante de órganos es una opción terapéutica bien establecida para varias patologías graves. En los últimos años, se han logrado muchos avances en los campos clínicos y experimentales del trasplante de órganos, como un mayor conocimiento de la fisiopatología de la disfunción primaria del injerto (DGP) y avances en las áreas de cuidados intensivos, inmunología y farmacología ^1,2,3. A pesar de los logros y mejoras en la calidad de los procedimientos quirúrgicos y farmacológicos relacionados, la relación entre el número de órganos disponibles y el número de receptores en lista de espera sigue siendo uno de los principales desafíos ^2,4. En este sentido, la literatura científica ha propuesto modelos animales para el estudio de terapias que puedan ser aplicadas a donantes de órganos para tratar y/o preservar los órganos hasta el momento del trasplante 5,6,7,8.

Al imitar los diferentes eventos observados en la práctica clínica, los modelos animales permiten el estudio de los mecanismos patológicos asociados y sus respectivos abordajes terapéuticos. La inducción experimental de estos eventos, en la mayoría de los casos aislados, ha generado modelos experimentales de donación de órganos y tejidos que son ampliamente investigados en la literatura científica sobre trasplante de órganos 6,7,8,9. Estos estudios emplean diferentes estrategias metodológicas, como las que inducen la muerte encefálica (TB), el shock hemorrágico (HS) y la muerte circulatoria (EC), ya que estos eventos se asocian a diferentes procesos deletéreos que comprometen la funcionalidad de los órganos y tejidos donados.

Muerte encefálica (BD)
La BD se asocia a una serie de eventos que conducen al deterioro progresivo de diferentes sistemas. Por lo general, ocurre cuando se produce un aumento agudo o gradual de la presión intracraneal (PIC) debido a un traumatismo cerebral o una hemorragia. Este aumento de la PIC promueve un aumento de la presión arterial en un intento de mantener un flujo sanguíneo cerebral estable en un proceso conocido como reflejo de Cushing^10,11. Estos cambios agudos pueden resultar en disfunciones cardiovasculares, endocrinas y neurológicas que comprometen la cantidad y calidad de los órganos donados, además de impactar en la morbimortalidad postrasplante 10,11,12,13.

Shock hemorrágico (HS)
La HS, a su vez, a menudo se asocia con donantes de órganos, ya que la mayoría de ellos son víctimas de traumatismos con pérdida significativa de volumen sanguíneo. Algunos órganos, como los pulmones y el corazón, son particularmente vulnerables a la HS debido a la hipovolemia y la consiguiente hipoperfusión tisular¹⁴. La HS induce lesión pulmonar a través del aumento de la permeabilidad capilar, edema e infiltración de células inflamatorias, mecanismos que en conjunto comprometen el intercambio gaseoso y conducen al deterioro progresivo de los órganos, descarrilando consecuentemente el proceso de donación ^6,14.

Muerte circulatoria (EC)
El uso de la donación post-EC ha ido creciendo exponencialmente en los principales centros del mundo, contribuyendo así al aumento del número de órganos recogidos. Los órganos recuperados de donantes post-EC son vulnerables a los efectos de la isquemia caliente, que ocurre después de un intervalo de baja (fase agónica) o nula irrigación sanguínea (fase asistólica)^8,15. La hipoperfusión o ausencia de flujo sanguíneo conducirá a la hipoxia tisular asociada a la pérdida brusca de ATP y a la acumulación de toxinas metabólicas en los tejidos¹⁵. A pesar de su uso actual para trasplante en la práctica clínica, persisten muchas dudas sobre el impacto del uso de estos órganos en la calidad del injerto post-trasplante y en la supervivencia del paciente¹⁵. Así, el uso de modelos experimentales para una mejor comprensión de los factores etiológicos asociados a la EC también está creciendo 8,15,16,17.

Modelos experimentales
Existen varios modelos experimentales de donación de órganos (BD, HS y CD). Sin embargo, los estudios a menudo se centran en una sola estrategia a la vez. Existe una brecha notable en los estudios que combinan o comparan dos o más estrategias. Estos modelos son muy útiles en el desarrollo de terapias que buscan aumentar el número de donaciones y en consecuencia disminuir la lista de espera de potenciales receptores. Las especies animales utilizadas para este fin varían de un estudio a otro, siendo más comúnmente seleccionados los modelos porcinos cuando el objetivo es una traslación más directa con la morfofisiología humana y una menor dificultad técnica en el procedimiento quirúrgico debido al tamaño del animal. A pesar de los beneficios, las dificultades logísticas y los altos costos están asociados con el modelo porcino. Por otro lado, el bajo coste y la posibilidad de manipulación biológica favorecen el uso de modelos de roedores, permitiendo al investigador partir de un modelo fiable para reproducir y tratar lesiones, así como integrar los conocimientos adquiridos en el campo del trasplante de órganos.

Aquí, presentamos un modelo de roedores de muerte encefálica, muerte circulatoria y donación por shock hemorrágico. Describimos los procesos inflamatorios y las condiciones patológicas asociadas a cada uno de estos modelos.

Protocolo

Los experimentos con animales cumplieron con el Comité de Ética para el Uso y Cuidado de Animales de Experimentación de la Facultad de Medicina de la Universidad de São Paulo (protocolo número 112/16).

1. Agrupación de animales

1. Asigne aleatoriamente doce ratas macho Sprague Dawley (250-300 g) a uno de los tres grupos experimentales (n = 4) para analizar y comparar los efectos asociados con los modelos animales.
2. Asignar animales al grupo de shock hemorrágico (HS, n=4): animales sometidos a cateterismo vascular con inducción de shock hemorrágico + mantenimiento durante 360 min + extracción de bloqueo cardiopulmonar + preparación de la muestra para análisis.
3. Asignar animales al grupo de muerte encefálica (BD, n=4): animales sometidos a muerte encefálica + mantenimiento durante 360 min + extracción de bloqueo cardiopulmonar + preparación de la muestra para análisis.
4. Asignar animales al grupo de muerte circulatoria (EC, n=4): animales sometidos a cateterismo vascular + inducción de muerte circulatoria + suspensión de la ventilación + isquemia a temperatura ambiente durante 180 min + preparación de la muestra para análisis.

2. Anestesia y preparación prequirúrgica

1. Coloque a la rata en una cámara cerrada con isoflurano al 5% durante 1 a 4 min. Confirme la anestesia adecuada comprobando el reflejo de pellizco del dedo del pie. En ausencia de reacciones reflejas (sin retracción de la pata), realizar la intubación orotraqueal (angiocath 14-G) con la ayuda de un laringoscopio pediátrico.
2. Con un ventilador mecánico previamente ajustado (FiO₂ 100%, volumen corriente 10 mL/kg, 90 ciclos/min y PEEP 3,0 cmH₂O), conecte el catéter traqueal al ventilador y ajuste la concentración anestésica al 2%.
   NOTA: Todos los procedimientos relacionados con modelos animales siguieron el mismo protocolo anestésico descrito en esta sección.
3. Retire el pelo de las regiones de interés (cabeza, cuello, pecho y abdomen). Luego, con una gasa, desinfecte el campo quirúrgico y la cola del animal. La desinfección se realiza con tres rondas alternas de una solución alcohólica de exfoliante de digluconato de clorhexidina.
4. Corta la punta de la cola del animal, coloca el pulgar y el índice sobre la base de la cola, y luego presiónalos y deslízalos lejos de la base. Recolectar una muestra de sangre periférica (20 μL) a través de la cola para el recuento total de leucocitos⁸.
   NOTA: Este procedimiento debe realizarse antes del inicio de la traqueostomía e inmediatamente al final de cada protocolo (BD y HS - después de 360 min).
5. Utilice una pipeta de precisión para diluir la sangre recolectada en 380 μL (1:20) de solución de Turk (ácido acético glacial 99%). Una vez diluida, pipetear la muestra de sangre en una cámara de Neubauer y colocarla bajo un microscopio (40x). Realizar el recuento total de leucocitos en los cuatro cuadrantes laterales de la cámara.

3. Traqueostomía

1. Con la ayuda de unas tijeras y fórceps adecuados, realice una disección longitudinal de la tráquea cervical, comenzando desde el tercio medio del cuello hasta la muesca supraesteral (incisión de 1,5 cm). Después de la incisión de la piel y el tejido subcutáneo, diseccionar los músculos cervicales hasta que la tráquea quede expuesta.
2. Coloque una ligadura de seda 2-0 debajo de la tráquea.
3. Con unas microtijeras, traqueostomizar el tercio superior de la tráquea para lograr una ventilación uniforme. Cortar horizontalmente la tráquea entre dos anillos cartilaginosos para acomodar el diámetro de una cánula metálica (3,5 cm).
4. Inserte el tubo de ventilación y fíjelo con las ligaduras preparadas.
5. Conecte el tubo de ventilación al sistema de ventilación para animales pequeños.
6. Ventilar la rata con un volumen corriente de 10 mL/kg, una velocidad de 70 ciclos/min y una PEEP de 3 cmH₂O.

4. Cateterismo de arterias y venas femorales

1. Exponga el triángulo femoral a través de una pequeña incisión (1,5 cm) en la región inguinal. Identificar y aislar los vasos femorales. Para este procedimiento, utilice un microscopio estereoscópico (aumento de 3,2x).
2. Coloque dos ligaduras de seda 4-0 debajo de los vasos sanguíneos (vena o arteria), una distalmente y la otra proximalmente. Cierre la ligadura más distal, luego coloque un nudo preajustado en la ligadura proximal y tire de ella.
3. Inserte el catéter a través de una pequeña incisión preformada en los vasos. Fije la cánula para evitar la luxación.
   NOTA: Fabricar los catéteres a partir de un extensor neonatal de 20 cm soldado por calentamiento a un catéter intravenoso periférico adecuado al calibre de la red venosa del animal, evitando así la regurgitación del contenido sanguíneo. Lubricar la cánula con heparina, evitando la formación de trombos y complicaciones durante la medición de la presión arterial media (PAM).
4. Conecte el catéter arterial a un transductor de presión y a un sistema de monitoreo de signos vitales para registrar la presión arterial media (PAM). El transductor debe colocarse a la altura del corazón del animal. Registre el MAP cada período de 10 minutos.
5. Coloque el catéter de jeringa (3 mL) en la vena, con el objetivo de hidratarlo y desangrarlo cuando sea necesario.

5. Inducción de shock hemorrágico

1. A través de un acceso venoso y con una jeringa heparinizada, extraer pequeños volúmenes de sangre hasta alcanzar valores de PAM de 50 mmHg, estableciendo así un shock hemorrágico.
   NOTA: Recolectar una alícuota de 2 ml de sangre cada 10 min en la primera hora del experimento y cada 30 min en las horas subsiguientes.
2. Mantenga la presión estable en aproximadamente 50 mmHg durante un período de 360 min. Para ello, retira o añade alícuotas de sangre si la presión aumenta o disminuye, respectivamente.
3. Coloque una fuente de calor cerca para evitar la hipotermia.
   NOTA: Aquí, se utiliza una lámpara de calor.
4. Al final del protocolo, recoja el bloqueo pulmonar en la capacidad pulmonar total (TLC) y congélelo rápidamente en nitrógeno líquido o colóquelo en una solución de fijación para estudios adicionales.
   NOTA: Con la ayuda de un ventilador para animales pequeños, se puede acceder a los parámetros ventilatorios durante el protocolo. En el presente estudio, estos parámetros se evaluaron inmediatamente antes de la inducción de HS (Línea de base) y 360 min después (Final).

6. Inducción de la muerte circulatoria

1. Para inducir la muerte circulatoria, administrar 150 mg/kg de tiopental sódico a través de la vía venosa. A continuación, apague el sistema de ventilación.
2. Obsérvese la disminución progresiva de la PAM hasta llegar a 0 mmHg. A partir de este punto, considere el inicio del período de isquemia cálida y comience el conteo de tiempo. El animal debe permanecer a temperatura ambiente (aproximadamente 22 °C) durante 180 min.
3. Al final del protocolo, vuelva a conectar los pulmones al ventilador mecánico y recoja el bloqueo pulmonar en TLC para su recolección. Congele rápidamente con nitrógeno líquido o colóquelo en la solución de fijación para realizar más estudios.

7. Inducción de muerte encefálica

1. Coloca a la rata en posición prona.
2. Retire la piel del cráneo con unas tijeras quirúrgicas. Perforar un pozo de calibre 1 mm, 2,80 mm anterior y 10,0 mm ventral al bregma y 1,5 mm lateral a la sutura sagital.
3. Inserte todo el catéter con balón en la cavidad craneal y asegúrese de que el balón esté precargado con solución salina (500 μL).
4. Con la ayuda de una jeringa, infle rápidamente el catéter.
5. Confirmar la muerte encefálica mediante la observación de una elevación abrupta de la PAM (reflejo de Cushing), ausencia de reflejos, midriasis bilateral y apnea. Después de la confirmación, suspenda la anestesia y mantenga al animal con ventilación mecánica durante 360 min.
6. Coloque una fuente de calor cerca para evitar la hipotermia.
7. Al final del protocolo, recoja el bloqueo pulmonar en TLC para su recolección y congélelo rápidamente en nitrógeno líquido o colóquelo en una solución de fijación para estudios adicionales.
   NOTA: Con la ayuda de un ventilador para animales pequeños, se puede acceder a los parámetros ventilatorios durante el protocolo. En el presente estudio, evaluamos estos parámetros inmediatamente antes de la inducción de la ME (Inicio) y después de 360 minutos (Final).

Resultados

Presión arterial media (PAM)
Para determinar las repercusiones hemodinámicas de BD y HS, se evaluó la PAM a lo largo de los 360 min del protocolo. La medición basal se recogió después de la extracción de la piel y la perforación del cráneo y antes de la recolección de alícuotas de sangre para los animales sometidos a BD o HS, respectivamente. Antes de la inducción de BD y HS, la PAM basal de los dos grupos fue similar (BD: 110,5 ± 6,1 vs. HS: 105,8 ± 2,3 mmHg; p=0,5; ANOVA de dos vías)....

Discusión

En los últimos años, el creciente número de diagnósticos de muerte encefálica le ha llevado a convertirse en el mayor proveedor de órganos y tejidos destinados a trasplantes. Este crecimiento, sin embargo, ha ido acompañado de un increíble aumento de las donaciones después de la muerte circulatoria. A pesar de su naturaleza multifactorial, la mayoría de los mecanismos desencadenantes de las causas de muerte comienzan después o acompañan a un traumatismo con una pérdida extensa del contenido sanguíneo

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
14-gauge angiocath	DB	38186714	Orotracheal intubation
2.0-silk	Brasuture	AA553	Tracheal tube fixation
24-gauge angiocath	DB	38181214	Arterial and venous access
4.0-silk	Brasuture	AA551	Fixation of arterial and venous cannulas
Alcoholic chlorhexidine digluconate solution (2%).	Vic Pharma	Y/N	Asepsis
Trichotomy apparatus	Oster	Y/N	Clipping device
Precision balance	Shimadzu	D314800051	Analysis of the wet/dry weight ratio
Barbiturate (Thiopental)	Cristália	18080003	DC induction
Balloon catheter (Fogarty-4F)	Edwards Life Since	120804	BD induction
Neonatal extender	Embramed	497267	Used as catheters with the aid of the 24 G angiocath
FlexiVent	Scireq	1142254	Analysis of ventilatory parameters
Heparin	Blau Farmaceutica SA	7000982-06	Anticoagulant
Isoflurane	Cristália	10,29,80,130	Inhalation anesthesia
Micropipette (1000 µL)	Eppendorf	347765Z	Handling of small- volume liquids
Micropipette (20 µL)	Eppendorf	H19385F	Handling of small- volume liquids
Microscope	Zeiss	1601004545	Assistance in the visualization of structures for the surgical procedure
Multiparameter monitor	Dixtal	101503775	MAP registration
Motorized drill	Midetronic	MCA0439	Used to drill a 1 mm caliber borehole
Neubauer chamber	Kasvi	D15-BL	Cell count
Pediatric laryngoscope	Oxygel	Y/N	Assistance during tracheal intubation
Syringe (3 mL)	SR	3330N4	Hydration and exsanguination during HS protocol
Pressure transducer	Edwards Life Since	P23XL	MAP registration
Metallic tracheal tube	Biomedical	006316/12	Rigid cannula for analysis with the FlexiVent ventilator
Isoflurane vaporizer	Harvard Bioscience	1,02,698	Anesthesia system
Mechanical ventilator for small animals (683)	Harvard Apparatus	MA1 55-0000	Mechanical ventilation
xMap methodology	Millipore	RECYTMAG-65K-04	Analysis of inflammatory markers