Akciğer Transplantasyonunda Deneysel Organ Bağışı Modellerinin İncelenmesi

Özet

Bu çalışma, üç farklı akciğer bağışı modelinin (beyin ölümü sonrası bağış, dolaşım sonrası ölüm bağışı ve hemorajik şok sonrası bağış) kurulduğunu göstermektedir. Bu olaylarla ilişkili enflamatuar süreçleri ve patolojik bozuklukları karşılaştırır.

Özet

Deneysel modeller, çeşitli patofizyolojik olaylarda yer alan etiyolojik fenomenleri anlamak için önemli araçlardır. Bu bağlamda, transplantasyon sonrası primer greft disfonksiyonunun patofizyolojisini tetikleyen unsurları incelemek ve potansiyel tedavileri değerlendirmek için farklı hayvan modelleri kullanılmıştır. Şu anda, deneysel bağış modellerini iki büyük gruba ayırabiliriz: beyin ölümünden sonra bağış ve dolaşım durmasından sonra bağış. Ek olarak, organ bağışının hayvan modelleri göz önüne alındığında hemorajik şokla ilişkili zararlı etkiler de göz önünde bulundurulmalıdır. Burada, üç farklı akciğer bağışı modelinin (beyin ölümü sonrası bağış, dolaşım sonrası ölüm bağışı ve hemorajik şok sonrası bağış) oluşturulmasını anlatıyor ve bu olaylarla ilişkili inflamatuar süreçleri ve patolojik bozuklukları karşılaştırıyoruz. Amaç, bilimsel topluluğa, ilişkili patolojik mekanizmaları incelemek ve transplantasyon için uygun greft sayısını optimize etmek için yeni terapötik hedefler aramak için güvenilir hayvan akciğer bağışı modelleri sağlamaktır.

Giriş

Klinik uygunluk
Organ nakli, birçok ciddi patoloji için iyi bilinen bir terapötik seçenektir. Son yıllarda, organ transplantasyonunun klinik ve deneysel alanlarında, primer greft disfonksiyonunun (PGT) patofizyolojisi hakkında daha fazla bilgi sahibi olmak ve yoğun bakım, immünoloji ve farmakoloji alanlarındaki ilerlemeler gibi birçok ilerleme kaydedilmiştir ^1,2,3. İlgili cerrahi ve farmakolojik prosedürlerin kalitesindeki başarılara ve gelişmelere rağmen, mevcut organ sayısı ile bekleme listesindeki alıcı sayısı arasındaki ilişki ana zorluklardan biri olmaya devam etmektedir ^2,4. Bu bağlamda, bilimsel literatür, organ bağışçılarına organ nakli zamanına kadar organları tedavi etmek ve/veya korumak için uygulanabilecek tedavileri incelemek için hayvan modelleri önermiştir 5,6,7,8.

Klinik uygulamada gözlemlenen farklı olayları taklit ederek, hayvan modelleri, ilişkili patolojik mekanizmaların ve bunların ilgili terapötik yaklaşımlarının incelenmesine izin verir. Bu olayların deneysel indüksiyonu, çoğu izole vakada, organ nakli ile ilgili bilimsel literatürde^geniş çapta araştırılan deneysel organ ve doku bağışı modelleri oluşturmuştur 6,7,8,9. Bu çalışmalar, beyin ölümü (BH), hemorajik şok (HS) ve dolaşım ölümüne (CD) neden olanlar gibi farklı metodolojik stratejiler kullanır, çünkü bu olaylar bağışlanan organ ve dokuların işlevselliğini tehlikeye atan farklı zararlı süreçlerle ilişkilidir.

Beyin ölümü (BH)
BD, farklı sistemlerin ilerleyici bozulmasına yol açan bir dizi olayla ilişkilidir. Genellikle beyin travması veya kanama nedeniyle kafa içi basıncında (ICP) akut veya kademeli bir artış meydana geldiğinde ortaya çıkar. ICP'deki bu artış, Cushing refleksi^10,11 olarak bilinen bir süreçte stabil bir serebral kan akışını sürdürmek amacıyla kan basıncında bir artışı teşvik eder. Bu akut değişiklikler, nakil sonrası morbidite ve mortaliteyi etkilemenin yanı sıra, bağışlanan organların miktarını ve kalitesini tehlikeye atan kardiyovasküler, endokrin ve nörolojik işlev bozukluklarına neden olabilir 10,11,12,13.

Hemorajik şok (HS)
HS, sırayla, çoğu organ bağışçıları ile ilişkilidir, çünkü bunların çoğu önemli kan hacmi kaybına neden olan travma kurbanlarıdır. Akciğerler ve kalp gibi bazı organlar, hipovolemi ve bunun sonucunda ortaya çıkan doku hipoperfüzyonu nedeniyle HS'ye karşı özellikle savunmasızdır¹⁴. HS, artan kılcal geçirgenlik, ödem ve enflamatuar hücrelerin infiltrasyonu yoluyla akciğer hasarına neden olur, birlikte gaz değişimini tehlikeye atan ve ilerleyici organ bozulmasına yol açan mekanizmalar, sonuç olarak bağış sürecini raydan çıkarır ^6,14.

Dolaşım ölümü (CD)
CD sonrası bağışın kullanımı büyük dünya merkezlerinde katlanarak artmakta ve böylece toplanan organ sayısının artmasına katkıda bulunmaktadır. CD sonrası donörlerden elde edilen organlar, düşük (agonik faz) veya kan akışı (asistolik faz) aralığından sonra ortaya çıkan sıcak iskeminin etkilerine karşı ^{savunmasızdır8,15}. Hipoperfüzyon veya kan akışının olmaması, ani ATP kaybı ve dokularda metabolik toksinlerin birikmesi ile ilişkili doku hipoksisine yol açacaktır¹⁵. Klinik uygulamada transplantasyon için mevcut kullanımına rağmen, bu organların kullanımının transplantasyon sonrası greftin kalitesi ve hasta sağkalımı üzerindeki etkisi hakkında birçok şüphe devam etmektedir¹⁵. Bu nedenle, ÇH ile ilişkili etiyolojik faktörlerin daha iyi anlaşılması için deneysel modellerin kullanımı da artmaktadır 8,15,16,17.

Deneysel modeller
Çeşitli deneysel organ bağışı modelleri (BD, HS ve CD) vardır. Bununla birlikte, çalışmalar genellikle bir seferde yalnızca bir stratejiye odaklanır. İki veya daha fazla stratejiyi birleştiren veya karşılaştıran çalışmalarda gözle görülür bir boşluk vardır. Bu modeller, bağış sayısını artırmayı ve sonuç olarak potansiyel alıcıların bekleme listesini azaltmayı amaçlayan tedavilerin geliştirilmesinde çok faydalıdır. Bu amaçla kullanılan hayvan türleri, çalışmadan çalışmaya değişir, amaç insan morfo fizyolojisi ile daha doğrudan bir çeviri olduğunda ve hayvanın büyüklüğü nedeniyle cerrahi prosedürde daha az teknik zorluk olduğunda domuz modelleri daha yaygın olarak seçilir. Faydalarına rağmen, lojistik zorluklar ve yüksek maliyetler domuz modeliyle ilişkilidir. Öte yandan, düşük maliyet ve biyolojik manipülasyon olasılığı, kemirgen modellerinin kullanımını destekleyerek, araştırmacının lezyonları çoğaltmak ve tedavi etmek için güvenilir bir modelden başlamasına ve ayrıca organ nakli alanında edinilen bilgileri entegre etmesine olanak tanır.

Burada, beyin ölümü, dolaşım ölümü ve hemorajik şok bağışının kemirgen bir modelini sunuyoruz. Bu modellerin her biri ile ilişkili enflamatuar süreçleri ve patolojik durumları tanımladık.

Protokol

Hayvan deneyleri, São Paulo Üniversitesi Tıp Fakültesi Deney Hayvanları Kullanımı ve Bakımı Etik Kurulu'na (protokol numarası 112/16) uygundur.

1. Hayvan gruplaması

1. Hayvan modelleriyle ilişkili etkileri analiz etmek ve karşılaştırmak için on iki erkek Sprague Dawley sıçanı (250-300 g) rastgele üç deney grubundan birine (n = 4) atayın.
2. Hayvanları hemorajik şok grubuna atayın (HS, n=4): hemorajik şok indüksiyonu + 360 dakika bakım + kardiyopulmoner blok ekstraksiyonu + analiz için numune hazırlama ile vasküler kateterizasyona tabi tutulan hayvanlar.
3. Hayvanları beyin ölümü grubuna atayın (BD, n=4): beyin ölümüne maruz kalan hayvanlar + 360 dakika bakım + kardiyopulmoner blok ekstraksiyonu + analiz için numune hazırlama.
4. Hayvanları dolaşım ölüm grubuna atayın (CD, n=4): vasküler kateterizasyon + dolaşım ölümü indüksiyonu + ventilasyonun askıya alınması + 180 dakika oda sıcaklığında iskemi + analiz için numune hazırlamaya tabi tutulan hayvanlar.

2. Anestezi ve cerrahi öncesi hazırlık

1. Sıçanı 1-4 dakika boyunca% 5 izofluran içeren kapalı bir odaya yerleştirin. Ayak parmağı sıkıştırma refleksini kontrol ederek uygun anesteziyi onaylayın. Refleks reaksiyonlarının yokluğunda (pençe retraksiyonu yok), pediatrik laringoskop yardımıyla orotrakeal entübasyon (14-G anjiyokat) yapın.
2. Önceden ayarlanmış bir mekanik ventilatör ile (FiO₂ %100, tidal hacim 10 mL/kg, 90 döngü/dak ve PEEP 3.0 cmH₂O), trakeal kateteri ventilatöre bağlayın ve anestezik konsantrasyonu %2'ye ayarlayın.
   NOT: Hayvan modelleriyle ilgili tüm prosedürler, bu bölümde açıklanan aynı anestezi protokolünü izlemiştir.
3. İlgilenilen bölgelerden (baş, boyun, göğüs ve karın) kürkü çıkarın. Daha sonra gazlı bez kullanarak cerrahi alanı ve hayvanın kuyruğunu dezenfekte edin. Dezenfeksiyon, üç alternatif tur alkollü bir klorheksidin diglukonat ovma çözeltisi ile gerçekleştirilir.
4. Hayvanın kuyruğunun ucunu kesin, başparmağınızı ve işaret parmağınızı kuyruğun tabanına yerleştirin ve ardından bastırıp tabandan uzağa kaydırın. Toplam lökosit sayısı⁸ için kuyruktan periferik kan örneği (20 μL) alın.
   NOT: Bu prosedür trakeostomi başlamadan önce ve her protokolün hemen sonunda yapılmalıdır (BD ve HS - 360 dakika sonra).
5. Toplanan kanı 380 μL (1:20) Turk çözeltisinde (Buzlu asetik asit %99) seyreltmek için hassas bir pipet kullanın. Seyreltildikten sonra, kan örneğini bir Neubauer odasına pipetleyin ve mikroskop altına (40x) yerleştirin. Toplam lökosit sayımını odanın dört yan çeyreğinde gerçekleştirin.

3. Trakeostomi

1. Uygun makas ve forseps yardımıyla, boynun orta üçte birinden başlayarak suprasternal çentiğe (1.5 cm insizyon) kadar servikal trakeanın uzunlamasına diseksiyonunu gerçekleştirin. Deri ve deri altı dokusunun kesilmesinden sonra, trakea açığa çıkana kadar servikal kasları inceleyin.
2. Soluk borusunun altına bir adet 2-0 ipek bağ yerleştirin.
3. Mikromakas kullanarak, düzgün ventilasyon elde etmek için trakeanın üst üçte birini trakeostistize edin. Metal bir kanülün çapını (3,5 cm) karşılamak için trakeayı iki kıkırdaklı halka arasında yatay olarak kesin.
4. Havalandırma tüpünü yerleştirin ve hazırlanan ligatürlerle sabitleyin.
5. Havalandırma tüpünü küçük hayvan havalandırma sistemine bağlayın.
6. Sıçanı 10 mL / kg tidal hacim, 70 döngü / dak hız ve 3 cmH₂O PEEP ile havalandırın.

4. Femoral arter ve ven kateterizasyonu

1. Femoral üçgeni kasık bölgesinde küçük bir kesiden (1,5 cm) ortaya çıkarın. Femoral damarları tanımlayın ve izole edin. Bu prosedür için bir stereomikroskop (3,2x büyütme) kullanın.
2. Kan damarlarının (ven veya arter) altına, biri distal ve diğeri proksimal olmak üzere iki adet 4-0 ipek ligatür yerleştirin. En distal ligatürü kapatın, ardından proksimal ligatüre önceden ayarlanmış bir düğüm yerleştirin ve çekin.
3. Kateteri damarlarda küçük, önceden oluşturulmuş bir kesiden yerleştirin. Çıkığı önlemek için kanülü sabitleyin.
   NOT: Kateterleri, 20 cm'lik bir yenidoğan genişleticiden, hayvanın venöz ağının kalibresine uygun bir periferik intravenöz katetere ısıtılarak kaynak yapın, böylece kan içeriğinin yetersizliğini önleyin. Ortalama arter basıncı (MAP) ölçümü sırasında trombüs oluşumunu ve komplikasyonları önleyerek kanülü heparin ile yağlayın.
4. Ortalama arter basıncını (MAP) kaydetmek için arter kateterini bir basınç dönüştürücüsüne ve bir yaşamsal belirti izleme sistemine bağlayın. Dönüştürücü, hayvanın kalbi seviyesine yerleştirilmelidir. MAP'ı her 10 dakikalık periyotta kaydedin.
5. Şırınga kateterini (3 mL) damar içine yerleştirin, gerektiğinde hidrasyon ve kan kaybını hedefleyin.

5. Hemorajik şok indüksiyonu

1. Venöz erişim yoluyla ve heparinize bir şırınga ile, 50 mmHg'lik MAP değerlerine ulaşılana kadar küçük hacimlerde kanı çıkarın, böylece hemorajik şok oluşturun.
   NOT: Deneyin ilk saatinde her 10 dakikada bir ve sonraki saatlerde her 30 dakikada bir 2 mL alikot kan toplayın.
2. Basıncı 360 dakikalık bir süre boyunca yaklaşık 50 mmHg'de sabit tutun. Bunu yapmak için, basınç sırasıyla artar veya azalırsa kan alikotlarını çıkarın veya ekleyin.
3. Hipotermiyi önlemek için yakına bir ısı kaynağı koyun.
   NOT: Burada bir ısı lambası kullanılır.
4. Protokolün sonunda, pulmoner bloğu toplam akciğer kapasitesinde (TLC) hasat edin ve sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun veya daha ileri çalışmalar için bir sabitleme solüsyonuna yerleştirin.
   NOT: Küçük bir hayvan ventilatörü yardımıyla, protokol sırasında ventilasyon parametrelerine erişilebilir. Bu çalışmada, bu parametreler HS indüksiyonundan hemen önce (Başlangıç) ve 360 dakika sonra (Final) değerlendirildi.

6. Dolaşım ölümü indüksiyonu

1. Dolaşım ölümünü indüklemek için, venöz hattan 150 mg / kg sodyum tiyopental uygulayın. Ardından havalandırma sistemini kapatın.
2. 0 mmHg'ye ulaşana kadar MAP'deki aşamalı azalmaya dikkat edin. Bu noktadan itibaren, sıcak iskemi döneminin başlangıcını düşünün ve zaman sayımına başlayın. Hayvan oda sıcaklığında (yaklaşık 22 °C) 180 dakika kalmalıdır.
3. Protokolün sonunda, akciğerleri mekanik ventilatöre yeniden bağlayın ve toplama için TLC'de pulmoner bloğu toplayın. Sıvı nitrojen kullanarak hızlı dondurma yapın veya daha ileri çalışmalar için fiksasyon çözeltisine yerleştirin.

7. Beyin ölümü indüksiyonu

1. Fareyi yüzüstü pozisyona getirin.
2. Cerrahi makas kullanarak cildi kafatasından çıkarın. 1 mm kalibreli bir sondaj deliği 2.80 mm anterior ve 10.0 mm ventral bregma ve 1.5 mm lateral sagital sütür açın.
3. Tüm balon kateterini kraniyal boşluğa yerleştirin ve balonun salinle (500 μL) önceden doldurulduğundan emin olun.
4. Bir şırınga yardımıyla, kateteri hızla şişirin.
5. Ani bir MAP yükselmesi (Cushing refleksi), reflekslerin yokluğu, bilateral midriyazis ve apne gözlemleyerek beyin ölümünü doğrulayın. Onaylandıktan sonra anesteziyi bırakın ve hayvanı 360 dakika mekanik ventilasyonda tutun.
6. Hipotermiyi önlemek için yakına bir ısı kaynağı yerleştirin.
7. Protokolün sonunda, toplama için TLC'de pulmoner bloğu hasat edin ve sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun veya daha ileri çalışmalar için bir sabitleme solüsyonuna yerleştirin.
   NOT: Küçük bir hayvan ventilatörü yardımıyla, protokol sırasında ventilasyon parametrelerine erişilebilir. Bu çalışmada, bu parametreler BD indüksiyonundan hemen önce (Başlangıç) ve 360 dakika sonra (Final) değerlendirildi.

Sonuçlar

Ortalama arter basıncı (MAP)
Behçet hastalığı ve HS'nin hemodinamik yansımalarını belirlemek için protokolün 360 dakikası boyunca MAP değerlendirildi. Başlangıç ölçümü, sırasıyla BD veya HS'ye maruz kalan hayvanlar için deri çıkarma ve kafatası sondajından sonra ve kan alikotu toplanmadan önce toplandı. Behçet hastalığı ve HS indüksiyonundan önce, iki grubun başlangıç haritası benzerdi (BD: 110.5 ± 6.1'e karşı HS: 105.8 ± 2.3 mmHg; p=0.5; iki yönlü ANOVA). ...

Tartışmalar

Son yıllarda, beyin ölümü tanılarının sayısının artması, nakil amaçlı organ ve dokuların en büyük sağlayıcısı haline gelmesine neden olmuştur. Ancak bu büyümeye, dolaşım ölümünden sonra bağışlarda inanılmaz bir artış eşlik etti. Multifaktöriyel doğasına rağmen, ölüm nedenlerini tetikleyen mekanizmaların çoğu, yoğun kan içeriği kaybı ile travmadan sonra başlar veya travmaya eşlik eder ^4,18.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
14-gauge angiocath	DB	38186714	Orotracheal intubation
2.0-silk	Brasuture	AA553	Tracheal tube fixation
24-gauge angiocath	DB	38181214	Arterial and venous access
4.0-silk	Brasuture	AA551	Fixation of arterial and venous cannulas
Alcoholic chlorhexidine digluconate solution (2%).	Vic Pharma	Y/N	Asepsis
Trichotomy apparatus	Oster	Y/N	Clipping device
Precision balance	Shimadzu	D314800051	Analysis of the wet/dry weight ratio
Barbiturate (Thiopental)	Cristália	18080003	DC induction
Balloon catheter (Fogarty-4F)	Edwards Life Since	120804	BD induction
Neonatal extender	Embramed	497267	Used as catheters with the aid of the 24 G angiocath
FlexiVent	Scireq	1142254	Analysis of ventilatory parameters
Heparin	Blau Farmaceutica SA	7000982-06	Anticoagulant
Isoflurane	Cristália	10,29,80,130	Inhalation anesthesia
Micropipette (1000 µL)	Eppendorf	347765Z	Handling of small- volume liquids
Micropipette (20 µL)	Eppendorf	H19385F	Handling of small- volume liquids
Microscope	Zeiss	1601004545	Assistance in the visualization of structures for the surgical procedure
Multiparameter monitor	Dixtal	101503775	MAP registration
Motorized drill	Midetronic	MCA0439	Used to drill a 1 mm caliber borehole
Neubauer chamber	Kasvi	D15-BL	Cell count
Pediatric laryngoscope	Oxygel	Y/N	Assistance during tracheal intubation
Syringe (3 mL)	SR	3330N4	Hydration and exsanguination during HS protocol
Pressure transducer	Edwards Life Since	P23XL	MAP registration
Metallic tracheal tube	Biomedical	006316/12	Rigid cannula for analysis with the FlexiVent ventilator
Isoflurane vaporizer	Harvard Bioscience	1,02,698	Anesthesia system
Mechanical ventilator for small animals (683)	Harvard Apparatus	MA1 55-0000	Mechanical ventilation
xMap methodology	Millipore	RECYTMAG-65K-04	Analysis of inflammatory markers