Étude de modèles expérimentaux de don d’organes pour la transplantation pulmonaire

Résumé

La présente étude montre la mise en place de trois modèles différents de don pulmonaire (don post-mort cérébrale, don post-mort circulatoire et don post-choc hémorragique). Il compare les processus inflammatoires et les troubles pathologiques associés à ces événements.

Résumé

Les modèles expérimentaux sont des outils importants pour comprendre les phénomènes étiologiques impliqués dans divers événements physiopathologiques. Dans ce contexte, différents modèles animaux sont utilisés pour étudier les éléments déclenchant la physiopathologie du dysfonctionnement primaire du greffon après transplantation afin d’évaluer les traitements potentiels. À l’heure actuelle, nous pouvons diviser les modèles expérimentaux de don en deux grands groupes : le don après mort cérébrale et le don après arrêt circulatoire. De plus, les effets délétères associés au choc hémorragique doivent être pris en compte lors de l’examen des modèles animaux de don d’organes. Nous décrivons ici la mise en place de trois modèles de don pulmonaire différents (don post-mort cérébrale, don post-mort circulatoire et don post-choc hémorragique) et comparons les processus inflammatoires et les troubles pathologiques associés à ces événements. L’objectif est de fournir à la communauté scientifique des modèles animaux fiables de don de poumons pour étudier les mécanismes pathologiques associés et rechercher de nouvelles cibles thérapeutiques afin d’optimiser le nombre de greffons viables pour la transplantation.

Introduction

Pertinence clinique
La transplantation d’organes est une option thérapeutique bien établie pour plusieurs pathologies graves. Au cours des dernières années, de nombreuses avancées ont été réalisées dans les domaines cliniques et expérimentaux de la transplantation d’organes, telles qu’une meilleure connaissance de la physiopathologie de la dysfonction primaire du greffon (DPI) et des avancées dans les domaines des soins intensifs, de l’immunologie et de la pharmacologie ^1,2,3. Malgré les réalisations et les améliorations de la qualité des procédures chirurgicales et pharmacologiques associées, la relation entre le nombre d’organes disponibles et le nombre de receveurs sur la liste d’attente reste l’un des principaux défis ^2,4. À cet égard, la littérature scientifique a proposé des modèles animaux pour l’étude de thérapies qui peuvent être appliquées aux donneurs d’organes pour traiter et/ou conserver les organes jusqu’au moment de la transplantation 5,6,7,8.

En mimant les différents événements observés en pratique clinique, les modèles animaux permettent d’étudier les mécanismes pathologiques associés et leurs approches thérapeutiques respectives. L’induction expérimentale de ces événements, dans la plupart des cas isolés, a généré des modèles expérimentaux de don d’organes et de tissus qui sont largement étudiés dans la littérature scientifique sur la transplantation d’organes 6,7,8,9. Ces études emploient différentes stratégies méthodologiques, telles que celles induisant la mort cérébrale (BD), le choc hémorragique (HS) et la mort circulatoire (CD), car ces événements sont associés à différents processus délétères qui compromettent la fonctionnalité des organes et tissus donnés.

Mort cérébrale (BD)
La BD est associée à une série d’événements qui conduisent à la détérioration progressive de différents systèmes. Elle survient généralement lorsqu’une augmentation aiguë ou progressive de la pression intracrânienne (PIC) se produit en raison d’un traumatisme cérébral ou d’une hémorragie. Cette augmentation de la PIC favorise une augmentation de la pression artérielle dans le but de maintenir un flux sanguin cérébral stable dans un processus connu sous le nom de réflexe de Cushing^10,11. Ces changements aigus peuvent entraîner des dysfonctionnements cardiovasculaires, endocriniens et neurologiques qui compromettent la quantité et la qualité des organes donnés, en plus d’avoir un impact sur la morbidité et la mortalité post-transplantation 10,11,12,13.

Choc hémorragique (HS)
L’HS, quant à elle, est souvent associée aux donneurs d’organes, car la plupart d’entre eux sont victimes de traumatismes avec une perte importante de volume sanguin. Certains organes, tels que les poumons et le cœur, sont particulièrement vulnérables à l’HS en raison de l’hypovolémie et de l’hypoperfusion tissulaire qui en résulte¹⁴. L’HS induit des lésions pulmonaires par une augmentation de la perméabilité capillaire, un œdème et une infiltration de cellules inflammatoires, des mécanismes qui, ensemble, compromettent les échanges gazeux et conduisent à une détérioration progressive des organes, faisant ainsi dérailler le processus de don ^6,14.

Mort circulatoire (MC)
L’utilisation du don post-MC a connu une croissance exponentielle dans les grands centres mondiaux, contribuant ainsi à l’augmentation du nombre d’organes collectés. Les organes prélevés sur des donneurs post-MC sont vulnérables aux effets de l’ischémie chaude, qui survient après un intervalle de faible (phase agonique) ou d’absence d’apport sanguin (phase asystolique)^8,15. L’hypoperfusion ou l’absence de circulation sanguine entraînera une hypoxie tissulaire associée à la perte brutale d’ATP et à l’accumulation de toxines métaboliques dans les tissus¹⁵. Malgré son utilisation actuelle pour la transplantation en pratique clinique, de nombreux doutes subsistent quant à l’impact de l’utilisation de ces organes sur la qualité du greffon post-greffe et sur la survie des patients¹⁵. Ainsi, l’utilisation de modèles expérimentaux pour une meilleure compréhension des facteurs étiologiques associés à la MC est également en croissance 8,15,16,17.

Modèles expérimentaux
Il existe différents modèles expérimentaux de don d’organes (BD, HS et CD). Cependant, les études se concentrent souvent sur une seule stratégie à la fois. Il y a une lacune notable dans les études qui combinent ou comparent deux stratégies ou plus. Ces modèles sont très utiles dans le développement de thérapies qui cherchent à augmenter le nombre de dons et, par conséquent, à réduire la liste d’attente des receveurs potentiels. Les espèces animales utilisées à cette fin varient d’une étude à l’autre, les modèles porcins étant plus souvent sélectionnés lorsque l’objectif est une traduction plus directe avec la physiologie morpho humaine et moins de difficulté technique dans l’acte chirurgical en raison de la taille de l’animal. Malgré les avantages, des difficultés logistiques et des coûts élevés sont associés au modèle porcin. D’autre part, le faible coût et la possibilité de manipulation biologique favorisent l’utilisation de modèles de rongeurs, permettant au chercheur de partir d’un modèle fiable pour reproduire et traiter les lésions, ainsi que d’intégrer les connaissances acquises dans le domaine de la transplantation d’organes.

Nous présentons ici un modèle de rongeur de mort cérébrale, de mort circulatoire et de don de choc hémorragique. Nous décrivons les processus inflammatoires et les états pathologiques associés à chacun de ces modèles.

Protocole

L’expérimentation animale s’est conformée au Comité d’éthique pour l’utilisation et le soin des animaux de laboratoire de la Faculté de médecine de l’Université de São Paulo (numéro de protocole 112/16).

1. Regroupement d’animaux

1. Assigner au hasard douze rats Sprague Dawley mâles (250 à 300 g) à l’un des trois groupes expérimentaux (n = 4) afin d’analyser et de comparer les effets associés aux modèles animaux.
2. Assigner les animaux au groupe choc hémorragique (HS, n=4) : animaux soumis à un cathétérisme vasculaire avec induction d’un choc hémorragique + entretien pendant 360 min + extraction du bloc cardiopulmonaire + préparation de l’échantillon pour analyse.
3. Assigner les animaux au groupe de mort cérébrale (BD, n=4) : animaux soumis à la mort cérébrale + entretien pendant 360 min + extraction du bloc cardiopulmonaire + préparation de l’échantillon pour analyse.
4. Assigner les animaux au groupe de mort circulatoire (CD, n=4) : animaux soumis à un cathétérisme vasculaire + induction de la mort circulatoire + suspension de la ventilation + ischémie à température ambiante pendant 180 min + préparation de l’échantillon pour analyse.

2. Anesthésie et préparation préopératoire

1. Placez le rat dans une chambre fermée avec 5% d’isoflurane pendant 1 à 4 min. Confirmez l’anesthésie appropriée en vérifiant le réflexe de pincement des orteils. En l’absence de réactions réflexes (pas de rétraction de la patte), réaliser une intubation orotrachéale (angiocathe 14-G) à l’aide d’un laryngoscope pédiatrique.
2. À l’aide d’un ventilateur mécanique préalablement réglé (FiO₂ 100 %, volume courant 10 mL/kg, 90 cycles/min et PEEP 3,0 cmH₂O), connectez le cathéter trachéal au ventilateur et ajustez la concentration d’anesthésique à 2 %.
   REMARQUE : Toutes les procédures liées aux modèles animaux ont suivi le même protocole d’anesthésie que celui décrit dans cette section.
3. Retirez la fourrure des régions d’intérêt (tête, cou, poitrine et abdomen). Ensuite, à l’aide d’une gaze, désinfectez le champ opératoire et la queue de l’animal. La désinfection est effectuée avec trois cycles alternés d’une solution alcoolique de gommage au digluconate de chlorhexidine.
4. Coupez le bout de la queue de l’animal, placez le pouce et l’index sur la base de la queue, puis appuyez et faites-les glisser loin de la base. Prélever un échantillon de sang périphérique (20 μL) par la queue pour obtenir le nombre total de leucocytes⁸.
   REMARQUE : Cette procédure doit être effectuée avant le début de la trachéotomie et immédiatement à la fin de chaque protocole (BD et HS - après 360 min).
5. À l’aide d’une pipette de précision, diluer le sang recueilli dans 380 μL (1 :20) de solution de Turk (acide acétique glacial 99 %). Une fois dilué, pipetez l’échantillon de sang dans une chambre Neubauer et placez-le sous un microscope (40x). Effectuez la numération leucocytaire totale dans les quatre quadrants latéraux de la chambre.

3. Trachéotomie

1. À l’aide de ciseaux et de pinces appropriés, effectuez une dissection longitudinale de la trachée cervicale, en partant du tiers médian du cou jusqu’à l’encoche sus-sternale (incision de 1,5 cm). Après l’incision de la peau et du tissu sous-cutané, disséquez les muscles cervicaux jusqu’à ce que la trachée soit exposée.
2. Placez une ligature de soie 2-0 sous la trachée.
3. À l’aide de microciseaux, trachéotomisez le tiers supérieur de la trachée pour obtenir une ventilation uniforme. Coupez horizontalement la trachée entre deux anneaux cartilagineux pour s’adapter au diamètre d’une canule métallique (3,5 cm).
4. Insérez le tube de ventilation et fixez-le avec des ligatures préparées.
5. Connectez le tube de ventilation au système de ventilation pour petits animaux.
6. Ventiler le rat avec un volume courant de 10 mL/kg, un débit de 70 cycles/min et une PEEP de 3 cmH₂O.

4. Cathétérisme de l’artère fémorale et des veines

1. Exposez le triangle fémoral par une petite incision (1,5 cm) dans la région inguinale. Identifier et isoler les vaisseaux fémoraux. Pour cette procédure, utilisez un stéréomicroscope (grossissement 3,2x).
2. Placez deux ligatures de soie 4-0 sous les vaisseaux sanguins (veine ou artère), l’une distale et l’autre proximale. Fermez la ligature la plus distale, puis placez un nœud préajusté dans la ligature proximale et tirez.
3. Insérez le cathéter à travers une petite incision préformée dans les vaisseaux. Fixez la canule pour éviter la luxation.
   REMARQUE : Faire en sorte que les cathéters d’une rallonge néonatale de 20 cm soudés par chauffage à un cathéter intraveineux périphérique adapté au calibre du réseau veineux de l’animal, empêchant ainsi la régurgitation du contenu sanguin. Lubrifiez la canule avec de l’héparine, en évitant la formation de thrombus et de complications lors de la mesure de la pression artérielle moyenne (MAP).
4. Connectez le cathéter artériel à un transducteur de pression et à un système de surveillance des signes vitaux pour enregistrer la pression artérielle moyenne (MAP). Le transducteur doit être positionné au niveau du cœur de l’animal. Enregistrez la carte toutes les 10 minutes.
5. Placez le cathéter seringue (3 ml) dans la veine, en visant l’hydratation et l’exsanguination si nécessaire.

5. Induction d’un choc hémorragique

1. Par voie veineuse et à l’aide d’une seringue héparinisée, prélever de petits volumes de sang jusqu’à ce que des valeurs de MAP de 50 mmHg soient atteintes, établissant ainsi un choc hémorragique.
   REMARQUE : Prélever une aliquote de 2 mL de sang toutes les 10 minutes au cours de la première heure de l’expérience et toutes les 30 minutes au cours des heures suivantes.
2. Maintenez la pression stable à environ 50 mmHg pendant une période de 360 min. Pour ce faire, retirez ou ajoutez des aliquotes de sang si la pression augmente ou diminue, respectivement.
3. Placez une source de chaleur à proximité pour éviter l’hypothermie.
   REMARQUE : Ici, une lampe chauffante est utilisée.
4. À la fin du protocole, prélevez le bloc pulmonaire à la capacité pulmonaire totale (CCM) et congelez-le rapidement dans de l’azote liquide ou placez-le dans une solution de fixation pour des études ultérieures.
   REMARQUE : À l’aide d’un ventilateur pour petit animal, les paramètres ventilatoires sont accessibles pendant le protocole. Dans la présente étude, ces paramètres ont été évalués immédiatement avant l’induction de l’HS (ligne de base) et 360 minutes plus tard (finale).

6. Induction de la mort circulatoire

1. Pour induire la mort circulatoire, administrer 150 mg/kg de thiopental de sodium par voie veineuse. Éteignez ensuite le système de ventilation.
2. Notez la diminution progressive de la MAP jusqu’à ce qu’elle atteigne 0 mmHg. À partir de ce point, considérez le début de la période d’ischémie chaude et commencez le décompte du temps. L’animal doit rester à température ambiante (environ 22 °C) pendant 180 min.
3. À la fin du protocole, rebranchez les poumons au ventilateur mécanique et prélevez le bloc pulmonaire à TLC pour le prélèvement. Soit la congélation éclair à l’aide d’azote liquide, soit la placer dans la solution de fixation pour des études plus approfondies.

7. Induction de la mort cérébrale

1. Placez le rat en position couchée.
2. Retirez la peau du crâne à l’aide de ciseaux chirurgicaux. Percer un trou de forage de calibre 1 mm, 2,80 mm à l’avant et 10,0 mm ventral à bregma et 1,5 mm latéral à la suture sagittale.
3. Insérez l’ensemble du cathéter à ballonnet dans la cavité crânienne et assurez-vous que le ballonnet est prérempli de solution saline (500 μL).
4. À l’aide d’une seringue, gonflez rapidement le cathéter.
5. Confirmez la mort cérébrale en observant une élévation brutale de la MAP (réflexe de Cushing), l’absence de réflexes, la mydriase bilatérale et l’apnée. Après confirmation, arrêtez l’anesthésie et maintenez l’animal sous ventilation mécanique pendant 360 minutes.
6. Placez une source de chaleur à proximité pour éviter l’hypothermie.
7. À la fin du protocole, prélever le bloc pulmonaire à TLC pour le prélèvement et soit le congeler dans de l’azote liquide, soit le placer dans une solution de fixation pour des études plus approfondies.
   REMARQUE : À l’aide d’un ventilateur pour petit animal, les paramètres ventilatoires sont accessibles pendant le protocole. Dans la présente étude, nous avons évalué ces paramètres immédiatement avant l’induction de la BD (ligne de base) et après 360 minutes (finale).

Résultats

Pression artérielle moyenne (MAP)
Pour déterminer les répercussions hémodynamiques de la BD et de l’HS, la MAP a été évaluée sur les 360 minutes du protocole. La mesure de base a été recueillie après l’ablation de la peau et le forage du crâne et avant le prélèvement d’aliquotes sanguines pour les animaux soumis à la BD ou à l’HS, respectivement. Avant l’induction de BD et d’HS, la MAP de base des deux groupes était similaire (BD : 110,5 ± 6,1 vs HS : 105,8 ± 2,3 mmHg ; ...

Discussion

Ces dernières années, le nombre croissant de diagnostics de mort cérébrale l’a conduit à devenir le plus grand fournisseur d’organes et de tissus destinés à la transplantation. Cette croissance s’est toutefois accompagnée d’une augmentation incroyable des dons après la mort circulatoire. Malgré sa nature multifactorielle, la plupart des mécanismes déclencheurs des causes de décès commencent après ou accompagnent un traumatisme avec une perte importante de la teneur en sang <...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
14-gauge angiocath	DB	38186714	Orotracheal intubation
2.0-silk	Brasuture	AA553	Tracheal tube fixation
24-gauge angiocath	DB	38181214	Arterial and venous access
4.0-silk	Brasuture	AA551	Fixation of arterial and venous cannulas
Alcoholic chlorhexidine digluconate solution (2%).	Vic Pharma	Y/N	Asepsis
Trichotomy apparatus	Oster	Y/N	Clipping device
Precision balance	Shimadzu	D314800051	Analysis of the wet/dry weight ratio
Barbiturate (Thiopental)	Cristália	18080003	DC induction
Balloon catheter (Fogarty-4F)	Edwards Life Since	120804	BD induction
Neonatal extender	Embramed	497267	Used as catheters with the aid of the 24 G angiocath
FlexiVent	Scireq	1142254	Analysis of ventilatory parameters
Heparin	Blau Farmaceutica SA	7000982-06	Anticoagulant
Isoflurane	Cristália	10,29,80,130	Inhalation anesthesia
Micropipette (1000 µL)	Eppendorf	347765Z	Handling of small- volume liquids
Micropipette (20 µL)	Eppendorf	H19385F	Handling of small- volume liquids
Microscope	Zeiss	1601004545	Assistance in the visualization of structures for the surgical procedure
Multiparameter monitor	Dixtal	101503775	MAP registration
Motorized drill	Midetronic	MCA0439	Used to drill a 1 mm caliber borehole
Neubauer chamber	Kasvi	D15-BL	Cell count
Pediatric laryngoscope	Oxygel	Y/N	Assistance during tracheal intubation
Syringe (3 mL)	SR	3330N4	Hydration and exsanguination during HS protocol
Pressure transducer	Edwards Life Since	P23XL	MAP registration
Metallic tracheal tube	Biomedical	006316/12	Rigid cannula for analysis with the FlexiVent ventilator
Isoflurane vaporizer	Harvard Bioscience	1,02,698	Anesthesia system
Mechanical ventilator for small animals (683)	Harvard Apparatus	MA1 55-0000	Mechanical ventilation
xMap methodology	Millipore	RECYTMAG-65K-04	Analysis of inflammatory markers