الرصد في الوقت الحقيقي للتنفس الميتوكوندريا في الخلايا التائية الأولية البشرية المتباينة بالسيتوكين

Summary

التكيف الأيضي أمر أساسي للخلايا التائية لأنه يملي التمايز والثبات والسمية الخلوية. هنا ، يتم تقديم بروتوكول محسن لمراقبة التنفس الميتوكوندريا في الخلايا التائية الأولية البشرية المتمايزة خارج الجسم الحي السيتوكين .

Abstract

أثناء التنشيط ، يتكيف التمثيل الغذائي للخلايا التائية مع التغييرات التي تؤثر على مصيرها. لا غنى عن زيادة الفسفرة التأكسدية للميتوكوندريا لتنشيط الخلايا التائية ، ويعتمد بقاء الخلايا التائية للذاكرة على إعادة تشكيل الميتوكوندريا. وبالتالي ، يؤثر هذا على النتائج السريرية طويلة الأجل للعلاجات المناعية للسرطان. غالبا ما تتم دراسة التغيرات في جودة الخلايا التائية عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام علامات سطحية معروفة وليس مباشرة من خلال حالتها الأيضية. هذا بروتوكول محسن لقياس التنفس الميتوكوندريا في الوقت الحقيقي للخلايا التائية البشرية الأولية باستخدام محلل التدفق خارج الخلية والسيتوكينات IL-2 و IL-15 ، والتي تؤثر بشكل مختلف على استقلاب الخلايا التائية. يظهر أن الحالة الأيضية للخلايا التائية يمكن تمييزها بوضوح عن طريق قياس استهلاك الأكسجين عند تثبيط المجمعات الرئيسية في المسار الأيضي وأن دقة هذه القياسات تعتمد بشكل كبير على التركيز الأمثل للمثبط واستراتيجية حقن المثبطات. سيساعد هذا البروتوكول الموحد على تنفيذ التنفس الميتوكوندريا كمعيار للياقة البدنية للخلايا التائية في مراقبة ودراسة العلاجات المناعية للسرطان.

Introduction

يعد تطور الخلايا التائية الصحيحة ووظيفتها ضروريين لقدرة الجهاز المناعي على التعرف على المستضدات والاستجابة لها. تتغير الفسفرة التأكسدية للميتوكوندريا (OxPhos) وفقا لحالة الخلية التائية. تستخدم الخلايا التائية الساذجة في الغالب OxPhos لإنتاج ATP ، في حين تخضع الخلايا التائية المنشطة لانتقال استقلابي حيث يصبح تحلل السكر هو ^{المهيمن1}. بعد مرحلة المستجيب ، تعود المجموعة الفرعية الصغيرة المتبقية من خلايا الذاكرة T إلى حالة التمثيل الغذائي التي تهيمن عليها ^OxPhos2,3. تتبع تغيرات OxPhos تمايز الخلايا التائية لدرجة أنه حتى المجموعات الفرعية من الخلايا التائية يمكن تمييزها من خلال خصائصها المحددة في OxPhos ¹. وعلى العكس من ذلك، فإن OxPhos مهم لوظيفة الخلايا التائية، وقد ثبت أن تثبيط OxPhos يمنع انتشار الخلايا التائية وإنتاج السيتوكين4. لذلك ، فإن القدرة على تحديد خصائص الخلايا التائية OxPhos بطريقة دقيقة وقابلة للتكرار هي أداة قوية لأي شخص يعمل مع الخلايا التائية.

في هذا البروتوكول ، يتم قياس خصائص OxPhos للخلايا التائية باستخدام محلل التدفق خارج الخلية. تتمثل الوظيفة الأساسية لهذا المحلل في قياس محتوى الأكسجين في وسائط نمو الخلايا المراد تحليلها باستمرار. يفترض أن الأكسجين الذي تتم إزالته من وسائط النمو يتم تناوله بواسطة الخلايا. من خلال علاج الخلايا بمجموعة متنوعة من مثبطات أو معدلات OxPhos ، يرتبط انخفاض امتصاص الأكسجين بالوظيفة المثبطة أو المعدلة. على سبيل المثال ، سيؤدي تثبيط سينثاز ATP إلى انخفاض امتصاص الخلايا للأكسجين الذي كان يمكن استخدامه لإنتاج ATP عن طريق الفسفرة التأكسدية. توفر المعدات الأخرى ، بما في ذلك قطب كلارك الكهربائي وأداة Oroboros ، وظائف مماثلة ، ولكل أداة مزايا وعيوب مختلفة. يمكن استخدام مجموعة واسعة من أنواع الخلايا للدراسات في هذه الأجهزة، ولكن أحد أنواع الخلايا الصعبة بشكل خاص هو الخلايا الليمفاوية التائية الأولية ^{البشرية5}. نظرا لصغر حجمها ، وضعف البقاء على قيد الحياة خارج الجسم الحي ، وخصائصها غير الملتصقة ، يمكن أن تكون الخلايا التائية الأولية البشرية صعبة الدراسة.

هذا بروتوكول لدراسة التنفس الميتوكوندريا للخلايا التائية الأولية البشرية بواسطة محلل خارج الخلية. ينقسم البروتوكول إلى تشغيل التحسين ، حيث يتم تحديد التركيزات المثلى لعدد الخلايا لكل بئر ، وكذلك التركيز الأمثل للأوليغومايسين و FCCP. علاوة على ذلك ، يتم تشغيل الفحص ، حيث يتم استخدام الظروف المحسنة.

باستخدام PBMCs البشرية المشتقة من الدم ومزارع الخلايا التائية الأولية خارج الجسم الحي ، يوضح هذا البروتوكول أهمية التركيز الأمثل للمثبطات وأهمية استخدام حقن منفصل بدلا من الحقن المتسلسل لمثبطات الميتوكوندريا عند العمل مع أنواع الخلايا الحساسة. أخيرا ، ثبت أن هذا الفحص يمكن أن يكتشف بقوة الاختلافات الدقيقة في تنفس الميتوكوندريا عند الاستقطاب مع السيتوكينات IL-2 و IL-15.

Protocol

أجريت التجارب بموجب المبادئ التوجيهية من مستشفى هيرليف ومنطقة العاصمة الدنماركية.

ملاحظة: يحتوي هذا البروتوكول على إرشادات لكل من تشغيل التحسين وتشغيل المقايسات. يتم كتابته بوضوح في النص عندما تكون التعليمات لتشغيل التحسين أو تشغيل المقايسة. تشغيل تشغيل التحسين قبل متابعة عمليات تشغيل الفحص

1. عزل الدم المحيطي البشري أحادي النواة (PBMC) عن المعاطف الناعمة

1. عزل PBMC
   1. جمع المعاطف الناعمة من المؤسسة المناسبة (التي تم جمعها في أكياس جمع الدم). المعاطف الناعمة تنشأ من متبرعين أصحاء. استبعاد المتبرعين الذين استخدموا مسكنات الألم مؤخرا.
   2. رش كيس جمع الدم الذي يحتوي على معطف بافي مع 70٪ من الإيثانول قبل نقله إلى خزانة تدفق صفائحية. استخدم دائما تقنيات معقمة وأجهزة معقمة لجميع الخطوات
      ملاحظة: تأكد من الحصول على التصاريح الصحيحة للتعامل مع عينات الدم البشرية.
   3. نقل الدم إلى أنبوب طرد مركزي معقم 50 مل.
   4. تمييع الدم على الأقل 10 ٪ مع RPMI 1640 غير مكملة.
   5. صب 20 مل من وسط تدرج الكثافة المفضل في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل.
   6. استنشاق 25 مل من الدم المخفف إلى ماصة مصلية. اضبط وحدة تحكم الماصة الكهربائية على أقل سرعة.
   7. أمسك الأنبوب بوسط تدرج الكثافة بزاوية 45 درجة وضع طرف الماصة المصلية على الجانب الداخلي من أنبوب الطرد المركزي سعة 50 مل. إطلاق سراح ببطء 25 مل من الدم المخفف من ماصة مصلية.
   8. تأكد من عدم اختلاط الدم المخفف ووسط تدرج الكثافة. تأكد من أن الدم المخفف يستقر فوق وسط تدرج الكثافة.
   9. كرر ذلك مع أنابيب متوسطة متدرجة الكثافة اللاحقة حتى تتم معالجة جميع الدم المخفف.
   10. حرك الأنابيب بعناية إلى جهاز طرد مركزي وأجهزة طرد مركزي بسرعة 1000 × g لمدة 30 دقيقة في دوار متأرجح للخارج في درجة حرارة الغرفة (RT). تأكد من أن التسارع والكسر في الحد الأدنى.
       ملاحظة: بعد الطرد المركزي، يجب أن تكون الطبقات المختلفة مرئية. تتكون الطبقة العلوية الواضحة من الوردي إلى البرتقالي من بلازما الدم والصفائح الدموية. تتكون الطبقة البيضاء الوسطى من PBMCs تليها طبقة واضحة تتكون من وسط تدرج الكثافة ، وأخيرا طبقة حمراء داكنة في القاع مع خلايا الدم الحمراء.
   11. باستخدام ماصة باستور معقمة ، قم بشفط الطبقة البيضاء المحتوية على PBMC بعناية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل.
       ملاحظة: تأكد من عدم نقل وسط تدرج الكثافة لأن ذلك سيؤثر على تنقية المصب. البلازما الزائدة لن تؤثر على النتائج.
   12. تجمع جميع PBMCs التي تم جمعها في نفس أنبوب الطرد المركزي سعة 50 مل وتتصل إلى 50 مل مع RPMI 1640.
   13. قم بطرد الخلايا مركزيا بسرعة 500 × g لمدة 5 دقائق في RT (قم بتنفيذ خطوات الطرد المركزي المتبقية في هذا الإعداد ما لم ينص على خلاف ذلك).
   14. شفط supernatant وإعادة تعليق الخلايا في 30 مل من RPMI 1640. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم أو عداد الخلايا الآلي.
   15. للحفظ بالتبريد، أعد تعليق 30 مليون خلية كحد أقصى لكل 1 مل من وسط التجميد.
   16. انقل الخلايا إلى أنابيب التبريد وقم بتجميدها حتى -80 درجة مئوية باستخدام حاوية تجميد يتم التحكم فيها بمعدل (-1 درجة مئوية في الدقيقة). للتخزين على المدى الطويل، انقل PBMCs إلى -140 درجة مئوية.
       ملاحظة: الحد من الخلايا الزمنية الموجودة في وسط التجميد عند RT. في RT ، DMSO شديد السمية للخلايا.

2. زراعة الخلايا الليمفاوية الأولية البشرية المنشطة

1. ذوبان الخلايا (اليوم 1)
   1. قم بتسخين 10 مل من RPMI 1640 لكل عينة إلى حوالي 37 درجة مئوية.
   2. خذ العدد المطلوب من أمبولات الخلايا وخزنها مؤقتا على الثلج الجاف.
   3. أعد تعليق الخلايا المجمدة في 10 مل من RPMI 1640 المسخن مسبقا.
   4. الطرد المركزي للخلايا لمدة 5 دقائق في 500 × غرام في RT.
   5. تخلص من المادة الفائقة واغسل الخلايا مرة أخرى عن طريق التعليق في 10 مل من RPMI 1640 وأجهزة الطرد المركزي كما هو موضح في 2.1.4.
   6. تخلص من السوبرناتانت وأعد تعليق الخلايا عند 2 × ¹⁰⁶ خلية لكل مل من X-VIVO 15 متوسطة + 5٪ مصل بشري (فيما يلي: وسط الخلايا التائية).
   7. لوحة 2 مل من الخلايا لكل بئر في صفيحة زراعة خلية 24 بئر وتحضن بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية و 5٪ _CO2.
2. تنشيط الخلايا (اليوم 0)
   1. اغسل حبات CD3 / CD28 عن طريق نقل 12.5 ميكرولتر من الخرز لكل مليون خلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق. أضف 12.5 ميكرولتر من PBS لكل 12.5 ميكرولتر من الخرز.
      ملاحظة: من المهم دوامة قارورة الخرز قبل الاستخدام.
   2. ضع أنبوب الطرد المركزي الدقيق على مغناطيس مناسب لمدة 1 دقيقة.
   3. تخلص من المخزن المؤقت وأعد تعليق الخرز في الحجم الأصلي لوسط الخلايا التائية (12.5 ميكرولتر من وسط الخلايا التائية لكل 12.5 ميكرولتر من الحجم الأصلي للخرز).
   4. أضف 12.5 ميكرولتر من الخرز لكل مليون خلية تتوافق مع نسبة 1: 2 (الخرز: الخلايا).
   5. قسم الخلايا إلى حالتين مع حوالي 5 ملايين خلية في كل منهما.
   6. أضف الحجم الصحيح من السيتوكينات إلى الشروط كما هو مذكور في الجدول 1.
   7. احتضان الخلايا لمدة 3 أيام عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ _CO2.
3. زراعة الخلايا (اليوم 3 و 5)
   1. أعد تعليق الخلايا وقسمها عن طريق نقل نصف الحجم من كل بئر إلى بئر جديد. أضف نفس الحجم من وسط الخلايا التائية الطازجة إلى كل بئر.
   2. إضافة سيتوكينات جديدة إلى كل شرط كما هو مذكور في الجدول 1.

3. فحص التدفق خارج الخلية

1. ترطيب خرطوشة المستشعر (اليوم 0)
   1. قم بفك حزمة خرطوشة المستشعر وقم بإزالة خرطوشة المستشعر بعناية من لوحة الأداة المساعدة.
   2. ضع خرطوشة المستشعر رأسا على عقب ، مع الحرص على عدم لمس مجسات المستشعر.
   3. املأ لوحة الأداة المساعدة بعيار 200 ميكرولتر (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل) واستبدل خرطوشة المستشعر بعناية مرة أخرى في لوحة الأداة المساعدة.
   4. بدلا من ذلك ، للقضاء على أي تكوين فقاعة ، احتضن خرطوشة المستشعر في ماء فائق النقاء معقم بين عشية وضحاها واستبدلها بعيار تم تسخينه مسبقا في صباح يوم الفحص.
   5. احتضان لوحة خرطوشة المستشعر عند 37 درجة مئوية في خزانة تسخين غير منظمة _CO2 بين عشية وضحاها.
      ملاحظة: من المهم جدا استخدام خزانة غير منظمة CO2 لأن _CO2 الزائد سيؤثر على خرطوشة المستشعر. تأكد من تشغيل محلل التدفق (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل) قبل يوم واحد على الأقل من الاستخدام للسماح له بالإحماء حتى 37 درجة مئوية.
2. طلاء الخلايا وإعداد مثبطات الميتوكوندريا (اليوم 1)
   1. قم بإعداد محلول طلاء (انظر جدول المواد) يحتوي على NaHCO3 (الرقم الهيدروجيني 8.3 ، 0.1 م ، 1128 ميكرولتر) ، Cell-Tak (1 ملغ / مل ، 48 ميكرولتر) و NaOH (1.0 م ، 24 ميكرولتر).
      ملاحظة: يجب دائما صنع محلول الطلاء واستخدامه طازجا.
   2. افتح صفيحة زراعة خلايا XF طازجة وأضف 12 ميكرولتر من محلول الطلاء المعد حديثا إلى كل بئر. ضمان التوزيع المتساوي لمحلول الطلاء في قاع جميع الآبار.
   3. احتضن اللوحة في RT مع الغطاء لمدة 30 دقيقة وتخلص من المحلول السائل المتبقي من جميع الآبار.
   4. اغسل اللوحة ب 200 ميكرولتر من الماء المعقم وتخلص من السائل.
   5. اغسل اللوحة ب 200 ميكرولتر من PBS المعقمة من فئة زراعة الخلايا وتخلص من السائل.
   6. اترك الطبق في RT واتركه يجف لمدة 30 دقيقة على الأقل.
3. خلايا اللوحة التائية في لوحة زراعة الخلايا XF (اليوم 1)
   1. قم بإعداد 50 مل من وسائط الفحص عن طريق خلط وسائط XF RPMI المناسبة مع الجلوكوز والبيروفات والجلوتامين وفقا للإعداد التجريبي (المستويات الموصى بها: 4 mM glucose و 1 mM pyruvate و 3 mM glutamine).
   2. سخني إلى 37 درجة مئوية في حاضنة غير منظمة _CO2 واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4. تأكد من وجود وسائط كافية لطلاء الخلايا وإعداد حلول oligomycin و FCCP (القسم 3.4).
   3. صمم تخطيطا للوحة مع عدد متزايد من الخلايا لكل بئر لتشغيل التحسين أو تشغيل الفحص. استخدم أربعة 4 آبار ، مليئة بالوسائط وحقنها بالوسائط ، لقياس الخلفية.
   4. عد الخلايا التائية المعدة في القسم 2.3 (بالطريقة المفضلة) وقم بماصة العدد الصحيح من الخلايا إلى كل بئر من لوحة زراعة الخلايا XF المطلية بمحلول الطلاء ، وفقا لتخطيط اللوحة.
      ملاحظة: قد يختلف الحجم النهائي لكل بئر ولكن يجب أن يكون كافيا لتغطية قاع البئر.
   5. قم بالطرد المركزي للوحة زراعة الخلايا XF عند 1000 × g في RT لمدة 10 دقائق لالتصاق الخلية التائية بالسطح المطلي.
   6. اغسل الخلايا ب 200 ميكرولتر من وسائط الفحص ، وتخلص من الوسائط وأضف 180 ميكرولتر من وسائط الفحص.
      ملاحظة: افحص الآبار بصريا باستخدام مجهر ضوئي مقلوب للتأكد من أن الخلايا متصلة وموزعة بالتساوي عبر سطح البئر.
   7. احتضن لوحة زراعة الخلايا XF في خزانة التسخين غير الخاضعة لتنظيم _CO2 لمدة 30 دقيقة لضمان أن تكون درجة حرارة اللوحة 37 درجة مئوية.
4. خرطوشة مستشعر التحميل مع oligomycin و FCCP لتشغيل التحسين (اليوم 1)
   ملاحظة: إذا كانت تركيزات الأوليغومايسين وFCCP قد تحسنت بالفعل، فتابع في القسم 3-5.
   1. إعداد حلول عمل ل oligomycin و FCCP في وسائط الفحص (المعدة في الخطوة 3.3.1) كما هو موضح في الخطوتين 3.4.2 و 3.4.3.
   2. حلول عمل Oligomycin: قم بإعداد محلول 5 ميكرومتر (2 مل من وسائط الفحص + 10 ميكرولتر من مخزون أوليغومايسين 1 ملليمتر) ومحلول 3 ميكرومتر (8 مل من وسائط الفحص + 24 ميكرولتر من مخزون أوليغومايسين 1 ملليمتر).
   3. حل عمل FCCP: إعداد محلول 2 ميكرومتر (2 مل من وسائط الفحص + 13.2 ميكرولتر من مخزون FCCP 300 ميكرومتر) ومحلول 1.3 ميكرومتر (8 مل من وسائط الفحص + 34.6 ميكرولتر من مخزون FCCP 300 ميكرومتر)
   4. قم بتحميل حلول العمل الخاصة إما ب oligomycin أو FCCP في منافذ الحقن الخاصة بخرطوشة المستشعر (الجدول 2).
      ملاحظه. من المهم ألا تحتوي منافذ الحقن على الهواء فقط. إذا لم يتم استخدام جميع منافذ الحقن لأي سبب من الأسباب، فيجب ملء المنافذ الفارغة بوسائط الفحص.
   5. اضرب حواف اللوحة برفق على الطاولة لإزالة الفقاعات المحتملة في منافذ الحقن.
5. تحميل خرطوشة المستشعر مع oligomycin، FCCP، وantimycin A لتشغيل الفحص (اليوم 1)
   1. قم بإعداد محاليل من oligomycin، FCCP في وسائط الفحص (أعدت في الخطوة 3.3.1) وفقا للتركيزات المثلى المحددة في تشغيل التحسين السابق. أيضا ، قم بإعداد محلول مضاد للمايسين A بحجم 20 ميكرومتر.
   2. قم بتحميل 20 ميكرولتر من oligomycin أو FCCP في منفذ الحقن A من خرطوشة المستشعر وفقا لتخطيط اللوحة. أضف 22 ميكرولتر من 20 ميكرومتر مضاد للمايسين A إلى منفذ الحقن B لجميع الآبار. سيكون التركيز الناتج من antimycin A بمجرد حقنه في البئر 2 ميكرومتر.
6. إعداد بروتوكول تجريبي في برنامج محلل Flux.
   1. قم بتعيين المجموعات وخريطة اللوحة لكل شرط لكل تخطيط لوحة.
   2. تصميم البروتوكول وفقا لاستراتيجية الحقن (الجدول 3 والشكل 1).
      ملاحظة: عند تشغيل الفحص، يمكن حذف الحقن C وD.
   3. احفظ إعداد المقايسة، واملأ المعلومات المطلوب تضمينها للفحص، ثم اضغط على زر البدء.
   4. سيطلب محلل التدفق خرطوشة المستشعر المعدة في القسم 3.5. قم بإزالة الغطاء وأدخل خرطوشة المستشعر وفقا لتوجيهات المحلل.
      ملاحظة: سيقوم الفحص بمعايرة أجهزة الاستشعار المشار إليها بعلامات الاختيار والتحقق منها. بعد المعايرة الناجحة، سيطلب المحلل لوحة زراعة الخلايا XF المعدة في القسم 3.3. يتم إخراج لوحة الأداة المساعدة من المحلل واستبدالها بلوحة زراعة الخلايا XF لبدء الفحص.

النتائج

يعد التحديد الصحيح لخصائص OxPhos أداة لا غنى عنها عند دراسة الخلايا التائية. ومع ذلك ، إذا لم يتم تحسين شروط الفحص ، فهناك خطر كبير من النتائج المضللة أو الخاطئة. في هذا البروتوكول ، هناك تركيز قوي على تحسين عدد الخلايا لكل بئر وتركيزات oligomycin و FCCP لاستخدامها. في الإعداد الموصوف ، تتم إضافة oligomyc...

Discussion

يعد التحديد الكمي المفصل والصحيح للفسفرة التأكسدية أداة لا غنى عنها عند وصف حالات الطاقة للخلايا التائية. يمكن أن ترتبط حالة لياقة الميتوكوندريا ارتباطا مباشرا بإمكانات تنشيط الخلايا التائية والبقاء على قيد الحياة ^{والتمايز1,5}. باستخدام هذا البروتوكول ، من...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well tissue culture plate	Nunc	142485
Anti-CD3xCD28 beads	Gibco	11161D
Antimycin A	Merck	A8674
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
Cell-Tak	Corning	354240	For coating
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	D9170
Human Serum	Sigma Aldrich	H4522	Heat inactivated at 56 °C for 30 min
IL-15	Peprotech	200-02
IL-2	Peprotech	200-15
Lymphoprep	Stemcell Technologies	07801
Oligomycin	Merck	O4876
PBS	Thermo Fisher	10010023
RPMI 1640	Gibco-Thermo Fisher	61870036
Seahorse Calibrant	Agilent Technologies	102416-100
Seahorse XF 1.0 M glucose solution	Agilent Technologies	103577-100
Seahorse XF 100 mM pytuvate solution	Agilent Technologies	103578-100
Seahorse XF 200 mM glutamine solution	Agilent Technologies	103579-100
Seahorse XF RPMI medium, pH7.4	Agilent Technologies	103576-100	XF RPMI media
Seahorse XFe96 Analyser	Agilent Technologies		Flux analyzer
Seahorse XFe96 cell culture microplates	Agilent Technologies	102416-100	XF cell culture plate
Seahorse XFe96 sensor cartridge	Agilent Technologies	102416-100
Sodium Bicarbonate concentrate 0.1 M (NaHCO3)	Sigma Aldrich	36486
Sodium Hydroxide solution 1 N (NaOH)	Sigma Aldrich	S2770-100ML
X-VIVO 15	Lonza	BE02-060F
T cell beads magnet DynaMag-2 Magnet	Thermo Fisher	12321D
Seahorse wave			Flux analyzer software