ניטור בזמן אמת של נשימה מיטוכונדריאלית בתאי T ראשוניים אנושיים מובחנים בציטוקינים

Summary

הסתגלות מטבולית היא בסיסית עבור תאי T כפי שהיא מכתיבה בידול, התמדה, וציטוטוקסיות. כאן, פרוטוקול ממוטב לניטור נשימה מיטוכונדריאלית בתאי T ראשוניים אנושיים מובחנים ex vivo .

Abstract

במהלך ההפעלה, חילוף החומרים של תאי T מסתגל לשינויים המשפיעים על גורלם. עלייה בזרחן חמצוני מיטוכונדריאלי היא הכרחית להפעלת תאי T, והישרדותם של תאי T זיכרון T תלויה בשיפוץ מיטוכונדריאלי. כתוצאה מכך, זה משפיע על התוצאה הקלינית ארוכת הטווח של אימונותרפיות סרטן. שינויים באיכות תאי T נחקרים לעתים קרובות על ידי ציטומטריית זרימה באמצעות סמני שטח ידועים ולא ישירות על ידי מצבם המטבולי. זהו פרוטוקול ממוטב למדידת נשימה מיטוכונדריאלית בזמן אמת של תאי T אנושיים ראשוניים באמצעות מנתח שטף חוץ-תאי והציטוקינים IL-2 ו- IL-15, המשפיעים באופן שונה על חילוף החומרים של תאי T. הוכח כי המצב המטבולי של תאי T ניתן להבחין בבירור על ידי מדידת צריכת החמצן בעת עיכוב מתחמי מפתח במסלול המטבולי וכי הדיוק של מדידות אלה תלוי מאוד בריכוז מעכב אופטימלי ואסטרטגיית הזרקת מעכבים. פרוטוקול מתוקנן זה יסייע ליישם נשימה מיטוכונדריאלית כסטנדרט לכושר תאי T בניטור ולמידה של חיסונים לסרטן.

Introduction

התפתחות ותפקוד תקינים של תאי T חיוניים ליכולתה של מערכת החיסון לזהות ולהגיב לאנטיגנים. זרחן חמצוני מיטוכונדריאלי (OxPhos) משתנה בהתאם למצב תא ה- T. תאי T נאיביים משתמשים בעיקר באוקספוס כדי לייצר ATP, בעוד שתאי T מופעלים עוברים מעבר מטבולי שבו הגליקוליזה הופכת דומיננטית1. לאחר שלב המשפיע, תת-קבוצה קטנה שנותרה של תאי T זיכרון חוזרת למצב מטבולי הנשלט על ידי OxPhos2,3. השינויים של OxPhos בצע את ההבחנה של תאי T עד כדי כך שאפילו תת קבוצות של תאי T ניתן להבדיל על ידי הספציפי שלהם הוא תכונות ^OxPhos1. לעומת זאת, OxPhos חשוב לתפקוד תאי T, ועיכוב של OxPhos הוכח לחסום התפשטות וייצור ציטוקינים של תאי ^T4. לכן, היכולת לכמת את המאפיינים של תא T OxPhos באופן מדויק וניתן לשחזור היא כלי רב עוצמה עבור כל מי שעובד עם תאי T.

בפרוטוקול זה, מאפיינים של תא T OxPhos נמדדים באמצעות מנתח שטף חוץ תאי. תפקיד הליבה של מנתח זה הוא למדוד ברציפות את תכולת החמצן של מדיית הצמיחה של התאים שיש לנתח. חמצן שהוסר ממדיית הצמיחה הוא הניח להיות נלקח על ידי התאים. על ידי טיפול בתאים עם מגוון של מעכבי OxPhos או מכפילים, ירידה בספיגת חמצן קשורה לתפקוד המעכב או המווסת. לדוגמה, עיכוב של סינתאז ATP יוביל לספיגה תאית מופחתת של חמצן שאחרת היה משמש לייצור ATP על ידי זרחן חמצוני. ציוד אחר, כולל האלקטרודה קלארק ומכשיר Oroboros, מציע פונקציונליות דומה, ולכל מכשיר יש יתרונות וחסרונות שונים. מגוון רחב של סוגי תאים יכול לשמש למחקרים במכשירים אלה, אך סוג תא אחד מאתגר במיוחד הוא לימפוציטים T ראשוני ^{אנושיים5}. בשל גודלם הקטן, ex vivo הישרדות ירודה, ומאפיינים שאינם חסידים, תאי T ראשוניים אנושיים יכולים להיות מאתגרים ללמוד.

זהו פרוטוקול לחקר הנשימה המיטוכונדריאלית של תאי T ראשוניים אנושיים על ידי מנתח חוץ-תאי. הפרוטוקול מחולק לרוץ אופטימיזציה, שבו ריכוזים אופטימליים של מספר תא לכל באר, כמו גם את הריכוז האופטימלי של oligomycin ו FCCP, נקבעים. יתר על כן, ריצה Assay, שבו התנאים הממוטבים משמשים.

באמצעות PBMCs אנושיים שמקורם בדם ותרביות תאי T ראשיות ex vivo , פרוטוקול זה מדגים את החשיבות של ריכוז מעכב אופטימלי ואת הרלוונטיות של שימוש נפרד במקום הזרקה רציפה של מעכבי מיטוכונדריה בעת עבודה עם סוגי תאים רגישים. לבסוף, הוא הוכיח כי בדיקה זו יכולה לזהות היטב הבדלים עדינים בנשימה מיטוכונדריאלית על קיטוב עם ציטוקינים IL-2 ו IL-15.

Protocol

הניסויים בוצעו תחת ההנחיות של בית החולים הרלב ואזור הבירה של דנמרק.

הערה: פרוטוקול זה מכיל הוראות הן עבור הפעלת מיטוב והן עבור הפעלת Assays. הוא כתוב בבירור בטקסט כאשר ההוראות הן עבור הפעלת מיטוב או הפעלת Assay. הפעל הפעלת מיטוב לפני שתמשיך בהפעלות Assay

1. בידוד חד-גרעיני של דם היקפי אנושי (PBMC) ממעילי באפי

1. בידוד PBMC
   1. לאסוף מעילי באפי מהמוסד המתאים (שנאסף בשקיות איסוף דם). מעילי באפי מקורם בתורמים בריאים. אל תכלול תורמים שהשתמשו לאחרונה במשככי כאבים.
   2. יש לרסס את שקית איסוף הדם המכילה את מעיל הבאפי ב-70% אתנול לפני המעבר לארון זרימה למינארי. השתמש תמיד בטכניקות סטריליות ובחומרה סטרילית לכל השלבים
      הערה: ודא כי האישורים הנכונים לטיפול בדגימות דם אנושיות מתקבלים.
   3. מעבירים את הדם לצינור צנטריפוגה סטרילי של 50 מ"ל.
   4. לדלל את הדם לפחות 10% עם RPMI 1640 ללא תוספת.
   5. יוצקים 20 מ"ל של מדיום שיפוע הצפיפות המועדף בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל.
   6. שאפו 25 מ"ל של הדם המדולל לתוך פיפטה סרולוגית. הגדר את בקר הפיפטה החשמלית למהירות הנמוכה ביותר.
   7. החזק את הצינור עם מדיום שיפוע צפיפות בזווית של 45° והנח את קצה פיפטה סרולוגי בצד הפנימי של צינור צנטריפוגה 50 מ"ל. שחרר לאט 25 מ"ל של הדם המדולל מהפיפטה הסרולוגית.
   8. ודא שהדם המדולל ומדיום שיפוע הצפיפות אינם מתערבבים. ודא שהדם המדולל מונח על גבי מדיום שיפוע הצפיפות.
   9. חזור על זה עם צינורות בינוניים שיפוע צפיפות הבאים עד כל הדם המדולל מעובד.
   10. בזהירות להעביר את הצינורות לצנטריפוגה וצנטריפוגה ב 1000 x g במשך 30 דקות ברוטור מתנדנד החוצה בטמפרטורת החדר (RT). ודא כי ההאצה וההפסקה הם לכל הפחות.
       הערה: לאחר צנטריפוגה, שכבות שונות צריכות להיות גלויות. השכבה העליונה, הוורוד-כתומה הצלולה, מורכבת מפלזמת הדם וטסיות הדם. השכבה הלבנה האמצעית מורכבת מ- PBMCs ואחריה שכבה ברורה המורכבת ממדיום שיפוע הצפיפות, ולבסוף שכבה אדומה כהה בתחתית עם תאי דם אדומים.
   11. באמצעות פיפטת פסטר סטרילית, שאפו בזהירות את השכבה הלבנה המכילה PBMC לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל.
       הערה: הקפד לא להעביר את מדיום שיפוע הצפיפות מכיוון שהדבר ישפיע על טיהור במורד הזרם. עודף פלזמה לא ישפיע על התוצאות.
   12. מאגר כל PBMCs שנאסף באותו צינור צנטריפוגה 50 מ"ל ומעל עד 50 מ"ל עם RPMI 1640.
   13. צנטריפוגה התאים ב 500 x g במשך 5 דקות ב RT (לבצע את שלבי צנטריפוגה הנותרים בהגדרה זו, אלא אם צוין אחרת).
   14. שאפו את העל-טבעי והגדילו מחדש את התאים ב-30 מ"ל של RPMI 1640. ספור את התאים באמצעות hemocytometer או מונה תאים אוטומטי.
   15. עבור cryopreservation, resuspend מקסימום של 30 מיליון תאים לכל 1 מ"ל של בינוני מקפיא.
   16. מעבירים את התאים להקפאות ומקפיאים עד למינוס 80 מעלות צלזיוס באמצעות מיכל הקפאה מבוקר קצב (-1 מעלות צלזיוס לדקה). לאחסון לטווח ארוך, העבר את מחשבי ה- PBMCs למינוס 140 °C (65 °F).
       הערה: הגבל את הזמן שבו תאים נמצאים במדיום ההקפאה ב- RT. ב RT, DMSO הוא רעיל מאוד לתאים.

2. פולחן של לימפוציטים T ראשוניים אנושיים מופעלים

1. הפשרת תאים (יום 1)
   1. טרום חם 10 מ"ל של RPMI 1640 לכל מדגם סביב 37 °C (50 °F).
   2. קח את המספר הרצוי של אמפולות תאים ולאחסן אותם באופן זמני על קרח יבש.
   3. resuspend התאים הקפואים ב 10 מ"ל של RPMI 1640 שחומם מראש.
   4. צנטריפוגה התאים במשך 5 דקות ב 500 x g ב RT.
   5. להשליך את supernatant ולשטוף את התאים שוב על ידי resuspending ב 10 מ"ל של RPMI 1640 וצנטריפוגה כמתואר 2.1.4.
   6. להשליך את supernatant ו resuspend התאים ב 2 x ¹⁰⁶ תאים למ"ל של X-VIVO 15 בינוני + 5% סרום אנושי (להלן: תא T בינוני).
   7. צלחת 2 מ"ל של התאים לבאר בצלחת תרבית תאים 24-well ודגר לילה ב 37 °C (5 ° C ) ו 5% _CO2.
2. הפעלת תאים (יום 0)
   1. לשטוף חרוזים CD3 / CD28 על ידי העברת 12.5 μL של חרוזים לכל 1 מיליון תאים לצינור microcentrifuge. הוסף 12.5 μL של PBS לכל 12.5 μL של חרוזים.
      הערה: חשוב לערבב את הבקבוקון של חרוזים לפני השימוש.
   2. מניחים את צינור microcentrifuge על מגנט מתאים במשך 1 דקה.
   3. להשליך את המאגר מחדש את החרוזים בנפח המקורי של מדיום תא T (12.5 μL של מדיום תא T לכל 12.5 μL של הנפח המקורי של חרוזים).
   4. הוסף 12.5 μL של חרוזים למיליון תאים המתאימים ליחס של 1:2 (חרוזים: תאים).
   5. חלק את התאים לשני תנאים עם כ-5 מיליון תאים בכל אחד מהם.
   6. הוסף את הנפח הנכון של ציטוקינים לתנאים כאמור בטבלה 1.
   7. לדגור על התאים במשך 3 ימים ב 37 °C (5° פרנהייט) ו 5% _CO2.
3. פולחן של תאים (יום 3 ו -5)
   1. לנפח מחדש את התאים ולפצל אותם על ידי העברת מחצית הנפח מכל באר לבאר חדשה. הוסף את אותו נפח של מדיום תא T טרי לכל באר.
   2. הוסף ציטוקינים חדשים לכל תנאי כאמור בטבלה 1.

3. בדיקת שטף חוץ-תאית

1. הידרציה של מחסנית החיישן (יום 0)
   1. פרק את מחסנית החיישן והסר בזהירות את מחסנית החיישן מלוחית השירות.
   2. הנח את מחסנית החיישן הפוכה, והקפיד לא לגעת בבדיקות החיישן.
   3. מלא את צלחת השירות עם 200 μL של calibrant (ראה טבלת חומרים לפרטים) ולהחליף בזהירות את מחסנית החיישן בחזרה לתוך צלחת השירות.
   4. לחלופין, כדי לחסל כל היווצרות בועה, לדגור מחסנית החיישן במים אולטרה-פוריים סטריליים בן לילה ולהחליף אותו עם calibrant שחומם מראש בבוקר של הבדיקה.
   5. דגור על צלחת מחסנית החיישן ב 37 °C (37 °F) בארון חימום שאינו מוסדר _CO2 בן לילה.
      הערה: חשוב מאוד להשתמש בארון מוסדר שאינו _CO2 מאז עודף _{CO2 2} ישפיע על מחסנית החיישן. ודא כי מנתח השטף (ראה טבלת חומרים לקבלת פרטים) מופעל לפחות יום לפני השימוש כדי לאפשר לו להתחמם עד 37 °C (60 °F).
2. ציפוי תאים והכנת מעכבי מיטוכונדריה (יום 1)
   1. הכן פתרון ציפוי (ראה טבלת חומרים) המכיל NaHCO3 (pH 8.3, 0.1 M, 1128 μL), Cell-Tak (1 מ"ג / מ"ל, 48 μL) ו NaOH (1.0 M, 24 μL).
      הערה: פתרון ציפוי תמיד צריך להיעשות ולהשתמש טרי.
   2. פתחו צלחת תרבית תאים XF טרייה והוסיפו 12 μL של פתרון הציפוי הטרי לכל באר. להבטיח אפילו הפצה של פתרון ציפוי בתחתית כל הבארות.
   3. לדגור על הצלחת ב RT עם המכסה על במשך 30 דקות ולהשליך את הפתרון הנוזלי הנותר מכל הבארות.
   4. לשטוף את הצלחת עם 200 μL של מים סטריליים ולהשליך את הנוזל.
   5. לשטוף את הצלחת עם 200 μL של PBS סטרילי כיתה תרבית התא ולהשליך את הנוזל.
   6. השאירו את הצלחת ב RT ולתת לו להתייבש לפחות 30 דקות.
3. תאי T צלחת בלוח תרבית התא XF (יום 1)
   1. הכינו 50 מ"ל של מדיה לבדיקה על ידי ערבוב מדיה מתאימה של XF RPMI עם גלוקוז, פירובט וגלוטמין על פי התקנה ניסיונית (רמות מומלצות: 4 מ"מ גלוקוז, 1 מ"מ פירובט ו 3 מ"מ גלוטמין).
   2. מחממים ל-37 מעלות צלזיוס בחממה מוסדרת שאינה _CO2 ומגדירים את רמת החומציות ב-7.4. ודא שיש מספיק מדיה לציפוי תאים ולהכנת פתרונות אוליגומיטיצין ו- FCCP (סעיף 3.4).
   3. עצב פריסת לוח עם מספר גדל והולך של תאים לבאר עבור הפעלת מיטוב או הפעלת Assay. השתמש בארבע בארות 4, מלא מדיה מוזרק עם מדיה, למדידות רקע.
   4. ספירת תאי T שהוכנו בסעיף 2.3 (בשיטה המועדפת) ופיפטה את המספר הנכון של תאים לכל באר של צלחת תרבית התא XF מצופה בתמיסת הציפוי, על פי פריסת הלוח.
      הערה: הכרך הסופי של כל באר עשוי להשתנות אך חייב להספיק כדי לכסות את תחתית הבאר.
   5. צנטריפוגה צלחת תרבית התא XF ב 1000 x g ב RT במשך 10 דקות כדי לדבוק את תא T למשטח מצופה.
   6. לשטוף את התאים עם 200 μL של מדיה לבדיקה, להשליך את המדיה ולהוסיף 180 μL של מדיה בדיקה.
      הערה: בדוק באופן חזותי את הבארות באמצעות מיקרוסקופ אור הפוך כדי לוודא שהתאים מחוברים ומופצים באופן שווה על פני השטח של הבאר.
   7. דגירה על צלחת תרבית התא XF בארון החימום המוסדר שאינו _CO2 במשך 30 דקות כדי להבטיח שטמפרטורת הצלחת היא 37 מעלות צלזיוס.
4. טעינת מחסנית חיישן עם אוליגומיצין ו FCCP עבור אופטימיזציה לרוץ (יום 1)
   הערה: אם אוליגומיצין וריכוזים FCCP כבר היו ממוטבים, להמשיך בסעיף 3.5.
   1. הכן פתרונות עבודה של אוליגומיצין ו- FCCP במדיה assay (מוכן בשלב 3.3.1) כמתואר בשלבים 3.4.2 ו 3.4.3.
   2. פתרונות עבודה Oligomycin: להכין פתרון 5 μM (2 מ"ל של מדיה assay + 10 μL של 1 mM מלאי oligomycin) ו 3 μM פתרון (8 מ"ל של מדיה assay + 24 μL של 1 mM מלאי אוליגומיצין).
   3. פתרון עבודה FCCP: הכן פתרון 2 מיקרומטר (2 מ"ל של מדיה assay + 13.2 μL של 300 μM FCCP מניות) ופתרון 1.3 μM (8 מ"ל של מדיה assay + 34.6 μL של 300 μM FCCP מניות)
   4. טען את פתרונות העבודה של אוליגומיצין או FCCP ליציאות ההזרקה של מחסנית החיישן (טבלה 2).
      הערה. חשוב כי אין יציאות הזרקה להכיל אוויר בלבד. אם, מכל סיבה שהיא, לא כל יציאות ההזרקה משמשות, יש למלא יציאות ריקות במדיה של Assay.
   5. לדפוק בעדינות את הקצוות של הצלחת על השולחן כדי להסיר בועות פוטנציאליות ביציאות ההזרקה.
5. מחסנית חיישן טעינה עם אוליגומיצין, FCCP, ו antimycin A עבור הפעלת Assay (יום 1)
   1. הכן פתרונות של אוליגומיצין, FCCP במדיה assay (מוכן בשלב 3.3.1) על פי הריכוזים האופטימליים שזוהו בהפעלת אופטימיזציה קודמת. כמו כן, להכין 20 μM אנטימיצין A פתרון.
   2. טען 20 μL של או oligomycin או FCCP לתוך יציאת הזרקה A של מחסנית החיישן על פי פריסת צלחת. הוסף 22 μL של 20 μM אנטימיצין A ליציאת הזרקה B של כל הבארות. הריכוז המתקבל של אנטימיצין A פעם מוזרק לתוך הבאר יהיה 2 מיקרומטר.
6. הגדרת פרוטוקול ניסיוני בתוכנת מנתח Flux.
   1. הקצה את הקבוצות ומפת הלוחות עבור כל תנאי לכל פריסת צלחת.
   2. עצבו את הפרוטוקול בהתאם לאסטרטגיית ההזרקה (טבלה 3 ואיור 1).
      הערה: בעת הפעלת אסאי פועל פועל, הזרקה C ו- D ניתן להשמיט.
   3. שמור את הגדרת הבדיקה, מלא את המידע הדרוש להיכלל עבור הבדיקה ולחץ על התחל.
   4. מנתח השטף יבקש את מחסנית החיישן שהוכנה בסעיף 3.5. הסר את המכסה והכנס את מחסנית החיישן לפי הוראות המנתח.
      הערה: הבדיקה תכייל ותבדוק חיישנים המצוינים על-ידי סימני ביקורת. לאחר כיול מוצלח, המנתח יבקש את לוח תרבית התא XF שהוכן בסעיף 3.3. לוח השירות נפלט מהמנתח ומוחלף בלוח תרבית התא XF כדי להתחיל את הבדיקה.

תוצאות

קביעה נכונה של תכונות OxPhos היא כלי הכרחי בעת לימוד תאי T. עם זאת, אם תנאי הבדיקה לא עברו אופטימיזציה, קיים סיכון משמעותי לתוצאות מטעות או שגויות. בפרוטוקול זה, יש דגש חזק על אופטימיזציה של מספר תא לכל באר וריכוזים של oligomycin ו FCCP לשמש. בהתקנה המתוארת, אוליגומיצין ו- FCCP מתווספים בהדרגה לאותה באר, מ...

Discussion

כימות מפורט ונכון של זרחן חמצוני הוא כלי הכרחי כאשר מתארים את מצבי האנרגיה של תאי T. מצב הכושר המיטוכונדריאלי יכול להיות קשור ישירות לפוטנציאל הפעלת תאי T, הישרדות ^{ובידול1,5}. עם פרוטוקול זה, ניתן לקבוע את המאפיינים השונים של זרחן חמצוני (ראה טבלה 4 להס?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well tissue culture plate	Nunc	142485
Anti-CD3xCD28 beads	Gibco	11161D
Antimycin A	Merck	A8674
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
Cell-Tak	Corning	354240	For coating
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	D9170
Human Serum	Sigma Aldrich	H4522	Heat inactivated at 56 °C for 30 min
IL-15	Peprotech	200-02
IL-2	Peprotech	200-15
Lymphoprep	Stemcell Technologies	07801
Oligomycin	Merck	O4876
PBS	Thermo Fisher	10010023
RPMI 1640	Gibco-Thermo Fisher	61870036
Seahorse Calibrant	Agilent Technologies	102416-100
Seahorse XF 1.0 M glucose solution	Agilent Technologies	103577-100
Seahorse XF 100 mM pytuvate solution	Agilent Technologies	103578-100
Seahorse XF 200 mM glutamine solution	Agilent Technologies	103579-100
Seahorse XF RPMI medium, pH7.4	Agilent Technologies	103576-100	XF RPMI media
Seahorse XFe96 Analyser	Agilent Technologies		Flux analyzer
Seahorse XFe96 cell culture microplates	Agilent Technologies	102416-100	XF cell culture plate
Seahorse XFe96 sensor cartridge	Agilent Technologies	102416-100
Sodium Bicarbonate concentrate 0.1 M (NaHCO3)	Sigma Aldrich	36486
Sodium Hydroxide solution 1 N (NaOH)	Sigma Aldrich	S2770-100ML
X-VIVO 15	Lonza	BE02-060F
T cell beads magnet DynaMag-2 Magnet	Thermo Fisher	12321D
Seahorse wave			Flux analyzer software