Мониторинг митохондриального дыхания в цитокин-дифференцированных первичных Т-клетках человека в режиме реального времени

Резюме

Метаболическая адаптация имеет основополагающее значение для Т-клеток, поскольку она диктует дифференцировку, персистенцию и цитотоксичность. Здесь представлен оптимизированный протокол мониторинга митохондриального дыхания в ex vivo цитокин-дифференцированных первичных Т-клетках человека.

Аннотация

Во время активации метаболизм Т-клеток приспосабливается к изменениям, которые влияют на их судьбу. Увеличение митохондриального окислительного фосфорилирования необходимо для активации Т-клеток, а выживание Т-клеток памяти зависит от ремоделирования митохондрий. Следовательно, это влияет на долгосрочный клинический исход иммунотерапии рака. Изменения качества Т-клеток часто изучаются с помощью проточной цитометрии с использованием хорошо известных поверхностных маркеров, а не непосредственно их метаболического состояния. Это оптимизированный протокол для измерения митохондриального дыхания первичных Т-клеток человека в режиме реального времени с использованием анализатора внеклеточного потока и цитокинов IL-2 и IL-15, которые по-разному влияют на метаболизм Т-клеток. Показано, что метаболическое состояние Т-клеток можно четко различить путем измерения потребления кислорода при ингибировании ключевых комплексов в метаболическом пути и что точность этих измерений сильно зависит от оптимальной концентрации ингибитора и стратегии инъекции ингибитора. Этот стандартизированный протокол поможет внедрить митохондриальное дыхание в качестве стандарта для пригодности Т-клеток при мониторинге и изучении иммунотерапии рака.

Введение

Правильное развитие и функционирование Т-клеток необходимы для способности иммунной системы распознавать и реагировать на антигены. Митохондриальное окислительное фосфорилирование (OxPhos) изменяется в зависимости от состояния Т-клетки. Наивные Т-клетки преимущественно используют OxPhos для производства АТФ, тогда как активированные Т-клетки подвергаются метаболическому переходу, когда гликолиз становится ^{доминирующим1}. После эффекторной фазы небольшое оставшееся подмножество Т-клеток памяти возвращается к метаболическому состоянию, в котором доминирует ^OxPhos2,3. Изменения OxPhos следуют за дифференцировкой Т-клеток до такой степени, что даже подмножества Т-клеток могут быть дифференцированы по их специфическим свойствам OxPhos1. И наоборот, OxPhos важен для функции Т-клеток, и было продемонстрировано, что ингибирование OxPhos блокирует пролиферацию и выработку цитокинов Т-клеток4. Таким образом, способность количественно оценивать свойства Т-клеток OxPhos точным и воспроизводимым образом является мощным инструментом для всех, кто работает с Т-клетками.

В этом протоколе свойства Т-клеток OxPhos измеряются с помощью внеклеточного анализатора потока. Основная функция этого анализатора заключается в непрерывном измерении содержания кислорода в питательных средах анализируемых клеток. Предполагается, что кислород, удаленный из среды роста, поглощается клетками. При обработке клеток различными ингибиторами или модификаторами OxPhos падение поглощения кислорода связано с ингибированной или модулированной функцией. Например, ингибирование АТФ-синтазы приведет к снижению клеточного поглощения кислорода, который в противном случае использовался бы для производства АТФ путем окислительного фосфорилирования. Другое оборудование, включая электрод Кларка и инструмент Oroboros, предлагает аналогичную функциональность, и каждый инструмент имеет разные преимущества и недостатки. Широкий спектр типов клеток может быть использован для исследований в этих устройствах, но одним из особенно сложных типов клеток являются первичные Т-лимфоциты ^{человека5}. Из-за их небольшого размера, плохой выживаемости ex vivo и неадгезивных свойств первичные Т-клетки человека могут быть сложными для изучения.

Это протокол для изучения митохондриального дыхания первичных Т-клеток человека с помощью внеклеточного анализатора. Протокол разделен на оптимизационный прогон, где определяются оптимальные концентрации клеточного числа на лунку, а также оптимальная концентрация олигомицина и FCCP. Кроме того, проводится анализ, в котором используются оптимизированные условия.

Используя полученные из крови человеческие PBMCs и ex vivo первичные Т-клеточные культуры, этот протокол демонстрирует важность оптимальной концентрации ингибиторов и актуальность использования отдельных вместо последовательной инъекции митохондриальных ингибиторов при работе с чувствительными типами клеток. Наконец, показано, что этот анализ может надежно обнаруживать тонкие различия в митохондриальном дыхании при поляризации цитокинами IL-2 и IL-15.

протокол

Эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами больницы Херлев и столичного региона Дании.

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол содержит инструкции как для запуска оптимизации, так и для запуска анализа. Это четко написано в тексте, когда инструкции предназначены для запуска оптимизации или прогона анализа. Выполнение выполнения оптимизации перед продолжением прогонов анализа

1. Выделение мононуклеарной (PBMC) периферической крови человека из пышной шерсти

1. Изоляция PBMC
   1. Соберите пальто из соответствующего учреждения (собранные в пакеты для сбора крови). Пальто Баффи происходит от здоровых доноров. Исключить доноров, которые недавно использовали обезболивающие препараты.
   2. Распылите мешок для сбора крови, содержащий пушистый слой с 70% этанолом, перед переносом в ламинарный шкаф. Всегда используйте стерильные методы и стерильное оборудование для всех этапов
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь в получении надлежащих разрешений на обращение с образцами человеческой крови.
   3. Перенесите кровь в стерильную центрифужную трубку объемом 50 мл.
   4. Разбавляют кровь не менее чем на 10% недополняемым RPMI 1640.
   5. Залейте 20 мл предпочтительной среды градиента плотности в центрифужную трубку объемом 50 мл.
   6. Аспират 25 мл разбавленной крови в серологическую пипетку. Установите контроллер электрической пипетки на самую низкую скорость.
   7. Держите трубку с градиентной средой плотности под углом 45° и положите серологический наконечник пипетки на внутреннюю сторону трубы центрифуги объемом 50 мл. Медленно высвобождают 25 мл разбавленной крови из серологической пипетки.
   8. Убедитесь, что разбавленная кровь и среда градиента плотности не смешиваются. Убедитесь, что разбавленная кровь покоится поверх среды градиента плотности.
   9. Повторяйте это с последующим градиентом плотности средних пробирок до тех пор, пока вся разбавленная кровь не будет обработана.
   10. Осторожно переместите трубки в центрифугу и центрифугу при 1000 х г в течение 30 мин в откидном роторе при комнатной температуре (RT). Убедитесь, что ускорение и разрыв сведены к минимуму.
       ПРИМЕЧАНИЕ: После центрифугирования должны быть видны различные слои. Верхний, прозрачный розово-оранжевый слой состоит из плазмы крови и тромбоцитов. Средний белый слой состоит из PBMCs, за которым следует прозрачный слой, который состоит из среды градиента плотности, и, наконец, темно-красный слой внизу с красными кровяными клетками.
   11. Используя стерильную пипетку Пастера, аккуратно аспирируйте белый слой, содержащий PBMC, до трубки центрифуги объемом 50 мл.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что вы не переносите среду градиента плотности, так как это повлияет на последующую очистку. Избыток плазмы не повлияет на результаты.
   12. Пул всех собранных НБМК в одной 50 мл центрифужной трубке и долив до 50 мл с RPMI 1640.
   13. Центрифугируйте ячейки при 500 х г в течение 5 мин при РТ (выполняйте оставшиеся этапы центрифугирования в этой настройке, если не указано иное).
   14. Аспирировать супернатант и повторно суспендировать клетки в 30 мл RPMI 1640. Подсчитывайте клетки с помощью гемоцитометра или автоматизированного счетчика клеток.
   15. Для криоконсервации повторно суспендируйте максимум 30 миллионов клеток на 1 мл морозильной среды.
   16. Перенесите ячейки в криотрубки и заморозьте до -80 °C с помощью морозильного контейнера с контролируемой скоростью (-1 °C в минуту). Для длительного хранения переместите НБК до -140 °C.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Ограничение временных ячеек находится в морозильной среде при RT. При РТ ДМСО очень токсичен для клеток.

2. Культивирование активированных первичных Т-лимфоцитов человека

1. Оттаивание клеток (День 1)
   1. Предварительно прогрейте 10 мл RPMI 1640 на образец примерно до 37 °C.
   2. Возьмите нужное количество ампул клеток и временно храните их на сухом льду.
   3. Повторно суспендировать замороженные клетки в 10 мл предварительно нагретого RPMI 1640.
   4. Центрифугируйте ячейки в течение 5 мин при 500 х г при РТ.
   5. Выбросьте супернатант и снова промыте клетки путем повторного использования в 10 мл RPMI 1640 и центрифуги, как описано в 2.1.4.
   6. Отбросьте супернатант и повторно суспендируйте клетки при 2 х ¹⁰⁶ клетках на мл среды X-VIVO 15 + 5% сыворотки человека (далее: Т-клеточная среда).
   7. Пластина 2 мл клеток на лунку в 24-луночной клеточной культуральной пластине и инкубируют в течение ночи при 37 °C и 5% _CO2.
2. Активация клеток (День 0)
   1. Промывайте шарики CD3/CD28 путем переноса 12,5 мкл бусин на 1 миллион клеток в микроцентрифужную трубку. Добавьте 12,5 мкл PBS на 12,5 мкл бусин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием важно вихрь флакона с бусинами.
   2. Поместите трубку микроцентрифуги на подходящий магнит на 1 мин.
   3. Отбросьте буфер и повторно суспендируйте шарики в исходном объеме Т-клеточной среды (12,5 мкл Т-клеточной среды на 12,5 мкл исходного объема шариков).
   4. Добавьте 12,5 мкл бусин на миллион клеток, что соответствует соотношению 1:2 (шарики: клетки).
   5. Разделите клетки на два состояния, в каждом из которых будет около 5 миллионов клеток.
   6. Добавьте правильный объем цитокинов к условиям, указанным в таблице 1.
   7. Инкубировать клетки в течение 3 дней при 37 °C и 5% _CO2.
3. Культивирование клеток (День 3 и 5)
   1. Повторно суспендируйте клетки и разделите их, перенеся половину объема из каждой лунки в новую лунку. Добавьте в каждую лунку одинаковый объем свежей Т-клеточной среды.
   2. Добавляйте новые цитокины к каждому состоянию, как указано в таблице 1.

3. Внеклеточный анализ потока

1. Гидратация картриджа датчика (День 0)
   1. Распакуйте картридж датчика и осторожно извлеките его из вспомогательной пластины.
   2. Поместите картридж датчика вверх ногами, следя за тем, чтобы не коснуться датчиков.
   3. Заполните полезную пластину калибром 200 мкл (подробности см. в Таблице материалов ) и аккуратно замените картридж датчика обратно в полезную пластину.
   4. В качестве альтернативы, чтобы устранить образование пузырьков, инкубируйте картридж датчика в стерильной сверхчистой воде в течение ночи и замените его предварительно нагретым калибрантом утром после анализа.
   5. Инкубируйте пластину картриджа датчика при 37 °C в нагревательном шкафу без регулирования _CO2 в течение ночи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно использовать шкаф, не регулируемый _CO2 , так как избыток _CO2 будет влиять на картридж датчика. Убедитесь, что анализатор Flux (подробнее см. в Таблице материалов ) включен по крайней мере за сутки до использования, чтобы он мог прогреться до 37 °C.
2. Клеточное покрытие и получение митохондриальных ингибиторов (День 1)
   1. Готовят раствор для покрытия (см. Таблицу материалов), содержащий NaHCO3 (рН 8,3, 0,1 М, 1128 мкл), Cell-Tak (1 мг/мл, 48 мкл) и NaOH (1,0 М, 24 мкл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор для покрытия всегда должен быть изготовлен и использован свежим.
   2. Откройте свежую пластину для культивирования клеток XF и добавьте 12 мкл свежеприготовленного раствора покрытия в каждую лунку. Обеспечьте равномерное распределение раствора покрытия на дне всех скважин.
   3. Инкубируйте пластину в RT с крышкой в течение 30 мин и выбросьте оставшийся жидкий раствор из всех лунок.
   4. Вымойте пластину 200 мкл стерильной воды и выбросьте жидкость.
   5. Вымойте пластину с 200 мкл стерильной PBS клеточной культуры и выбросьте жидкость.
   6. Оставьте пластину на RT и дайте ей высохнуть не менее 30 минут.
3. Пластинчатые Т-клетки в пластине культуры клеток XF (День 1)
   1. Подготовьте 50 мл пробирной среды путем смешивания подходящей среды XF RPMI с глюкозой, пируватом и глютамином в соответствии с экспериментальной установкой (рекомендуемые уровни: глюкоза 4 мМ, пируват 1 мМ и 3 мМ глутамина).
   2. Нагрейте до 37 °C в инкубаторе, не регулируемом _CO2 , и установите pH на уровне 7,4. Убедитесь, что имеется достаточное количество сред для покрытия клеток и приготовления растворов олигомицина и FCCP (раздел 3.4).
   3. Разработайте макет пластины с увеличением количества ячеек на скважину для выполнения оптимизации или анализа. Используйте четыре 4 скважины, заполненные средой и закачанные средой, для фоновых измерений.
   4. Подсчитайте Т-клетки, приготовленные в разделе 2.3 (предпочтительным способом) и пипеткой правильное количество клеток к каждой лунке XF-клеток культуральной пластины, покрытой раствором покрытия, согласно макету пластины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конечный объем каждой скважины может варьироваться, но должен быть достаточным, чтобы покрыть дно скважины.
   5. Центрифугируйте пластину культивирования клеток XF при 1000 х г на RT в течение 10 мин, чтобы приклеить Т-клетку к покрытой поверхности.
   6. Промыть клетки 200 мкл пробирной среды, отбросить среду и добавить 180 мкл пробирной среды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Визуально осмотрите скважины с помощью инвертированного светового микроскопа, чтобы убедиться, что ячейки прикреплены и равномерно распределены по поверхности скважины.
   7. Инкубируйте пластину для культивирования клеток XF в нагревательном шкафу без регулирования _CO2 в течение 30 минут, чтобы температура пластины составляла 37 °C.
4. Картридж с датчиком загрузки с олигомицином и FCCP для оптимизации пробега (День 1)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если концентрации олигомицина и FCCP уже были оптимизированы, продолжайте в разделе 3.5.
   1. Подготовка рабочих растворов олигомицина и FCCP в пробирных средах (подготовленных на этапе 3.3.1), как описано на этапах 3.4.2 и 3.4.3.
   2. Рабочие растворы олигомицина: готовят раствор 5 мкМ (2 мл пробирной среды + 10 мкл запаса олигомицина 1 мМ) и 3 мкМ раствора (8 мл пробирной среды + 24 мкл запаса олигомицина 1 мМ).
   3. Рабочий раствор FCCP: Подготовьте раствор 2 мкМ (2 мл пробирной среды + 13,2 мкл запаса FCCP 300 мкМ) и раствор 1,3 мкМ (8 мл пробирной среды + 34,6 мкл запаса FCCP 300 мкМ)
   4. Загрузите рабочие растворы олигомицина или FCCP в отверстия для инъекций картриджа датчика (таблица 2).
      ЗАМЕТКА. Важно, чтобы ни одно инжекционное отверстие не содержало только воздух. Если по какой-либо причине используются не все инжекционные порты, пустые порты должны быть заполнены пробирными носителями.
   5. Аккуратно постучите по краям пластины на столе, чтобы удалить потенциальные пузырьки в отверстиях для инъекций.
5. Картридж с датчиком загрузки с олигомицином, FCCP и антимицином А для проведения анализа (День 1)
   1. Готовят растворы олигомицина, FCCP в пробирных средах (приготовленных на стадии 3.3.1) в соответствии с оптимальными концентрациями, выявленными в предыдущем оптимизационном цикле. Также приготовьте раствор антимицина А 20 мкМ.
   2. Загрузите 20 мкл олигомицина или FCCP в инъекционный порт A картриджа датчика в соответствии с расположением пластины. Добавьте 22 мкл 20 мкМ антимицина А в инъекционный порт В всех скважин. Результирующая концентрация антимицина А после введения в скважину составит 2 мкМ.
6. Настройка экспериментального протокола в анализаторе Flux.
   1. Назначьте группы и карту пластин для каждого условия для каждого макета пластины.
   2. Спроектируйте протокол в соответствии со стратегией внедрения (таблица 3 и рисунок 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: При выполнении прогонов анализа инъекции C и D могут быть опущены.
   3. Сохраните настройки анализа, заполните сведения, необходимые для анализа, и нажмите кнопку Пуск.
   4. Анализатор потока запросит картридж датчика, подготовленный в разделе 3.5. Снимите крышку и вставьте картридж датчика в соответствии с указаниями анализатора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ будет калибровать и проверять датчики, отмеченные галочками. После успешной калибровки анализатор запросит пластину для культивирования клеток XF, подготовленную в разделе 3.3. Полезная пластина извлекается из анализатора и заменяется пластиной культуры клеток XF для начала анализа.

Результаты

Правильное определение свойств OxPhos является незаменимым инструментом при изучении Т-клеток. Однако, если условия анализа не были оптимизированы, существует значительный риск введения в заблуждение или ошибочных результатов. В этом протоколе основное внимание уделяется оптимизации к...

Обсуждение

Детальная и правильная количественная оценка окислительного фосфорилирования является незаменимым инструментом при описании энергетических состояний Т-клеток. Состояние митохондриальной приспособленности может быть напрямую связано с потенциалом активации Т-клеток, выживаемость...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well tissue culture plate	Nunc	142485
Anti-CD3xCD28 beads	Gibco	11161D
Antimycin A	Merck	A8674
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
Cell-Tak	Corning	354240	For coating
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	D9170
Human Serum	Sigma Aldrich	H4522	Heat inactivated at 56 °C for 30 min
IL-15	Peprotech	200-02
IL-2	Peprotech	200-15
Lymphoprep	Stemcell Technologies	07801
Oligomycin	Merck	O4876
PBS	Thermo Fisher	10010023
RPMI 1640	Gibco-Thermo Fisher	61870036
Seahorse Calibrant	Agilent Technologies	102416-100
Seahorse XF 1.0 M glucose solution	Agilent Technologies	103577-100
Seahorse XF 100 mM pytuvate solution	Agilent Technologies	103578-100
Seahorse XF 200 mM glutamine solution	Agilent Technologies	103579-100
Seahorse XF RPMI medium, pH7.4	Agilent Technologies	103576-100	XF RPMI media
Seahorse XFe96 Analyser	Agilent Technologies		Flux analyzer
Seahorse XFe96 cell culture microplates	Agilent Technologies	102416-100	XF cell culture plate
Seahorse XFe96 sensor cartridge	Agilent Technologies	102416-100
Sodium Bicarbonate concentrate 0.1 M (NaHCO3)	Sigma Aldrich	36486
Sodium Hydroxide solution 1 N (NaOH)	Sigma Aldrich	S2770-100ML
X-VIVO 15	Lonza	BE02-060F
T cell beads magnet DynaMag-2 Magnet	Thermo Fisher	12321D
Seahorse wave			Flux analyzer software