Sitokin Diferansiye İnsan Primer T Hücrelerinde Mitokondriyal Solunumun Gerçek Zamanlı İzlenmesi

Özet

Metabolik adaptasyon, farklılaşmayı, kalıcılığı ve sitotoksisiteyi belirlediği için T hücreleri için temeldir. Burada, ex vivo sitokin farklılaşmış insan primer T hücrelerinde mitokondriyal solunumu izlemek için optimize edilmiş bir protokol sunulmaktadır.

Özet

Aktivasyon sırasında, T hücrelerinin metabolizması, kaderlerini etkileyen değişikliklere adapte olur. Mitokondriyal oksidatif fosforilasyondaki artış, T hücresi aktivasyonu için vazgeçilmezdir ve hafıza T hücrelerinin hayatta kalması mitokondriyal yeniden şekillenmeye bağlıdır. Sonuç olarak, bu kanser immünoterapilerinin uzun vadeli klinik sonuçlarını etkiler. T hücre kalitesindeki değişiklikler genellikle doğrudan metabolik durumlarıyla değil, iyi bilinen yüzey belirteçleri kullanılarak akış sitometrisi ile incelenir. Bu, bir Hücre Dışı Akı Analizörü ve T hücresi metabolizmasını farklı şekilde etkileyen sitokinler IL-2 ve IL-15 kullanarak birincil insan T hücrelerinin gerçek zamanlı mitokondriyal solunumunu ölçmek için optimize edilmiş bir protokoldür. T hücrelerinin metabolik durumunun, metabolik yolaktaki anahtar kompleksleri inhibe ederken oksijen tüketiminin ölçülmesiyle açıkça ayırt edilebileceği ve bu ölçümlerin doğruluğunun optimal inhibitör konsantrasyonuna ve inhibitör enjeksiyon stratejisine büyük ölçüde bağlı olduğu gösterilmiştir. Bu standartlaştırılmış protokol, mitokondriyal solunumun kanser immünoterapilerinin izlenmesinde ve incelenmesinde T hücresi uygunluğu için bir standart olarak uygulanmasına yardımcı olacaktır.

Giriş

Doğru T hücresi gelişimi ve fonksiyonu, bağışıklık sisteminin antijenleri tanıma ve bunlara yanıt verme yeteneği için gereklidir. Mitokondriyal oksidatif fosforilasyon (OxPhos), T hücresinin durumuna göre değişir. Naif T hücreleri ağırlıklı olarak ATP üretmek için OxPhos kullanırken, aktive olmuş T hücreleri glikolizin baskın hale geldiği metabolik bir geçişe ^uğrar1. Efektör fazından sonra, bellek T hücrelerinin kalan küçük alt kümesi, ^{OxPhos2,3'ün} hakim olduğu metabolik bir duruma geri döner. OxPhos'un değişiklikleri, T hücrelerinin farklılaşmasını öyle bir dereceye kadar takip eder ki, T hücrelerinin alt kümeleri bile spesifik OxPhos özellikleri ile ayırt ^edilebilir1. Tersine, OxPhos, T hücrelerinin işlevi için önemlidir ve OxPhos'un inhibisyonunun, T hücrelerinin proliferasyonunu ve sitokin üretimini bloke ettiği ^{gösterilmiştir4}. Bu nedenle, T hücresi OxPhos'un özelliklerini kesin ve tekrarlanabilir bir şekilde ölçme yeteneği, T hücreleri ile çalışan herkes için güçlü bir araçtır.

Bu protokolde, T hücresi OxPhos'un özellikleri, hücre dışı bir akı analizörü kullanılarak ölçülür. Bu analizörün temel işlevi, analiz edilecek hücrelerin büyüme ortamının oksijen içeriğini sürekli olarak ölçmektir. Büyüme ortamından çıkarılan oksijenin hücreler tarafından alındığı varsayılır. Hücreleri çeşitli OxPhos inhibitörleri veya modifiye edicileri ile tedavi ederek, oksijen alımındaki bir düşüş, inhibe edilmiş veya modüle edilmiş fonksiyon ile ilişkilidir. Örneğin, ATP sentazının inhibisyonu, aksi takdirde oksidatif fosforilasyon yoluyla ATP üretmek için kullanılacak olan hücresel oksijen alımının azalmasına yol açacaktır. Clark elektrodu ve Oroboros enstrümanı da dahil olmak üzere diğer ekipmanlar benzer işlevsellik sunar ve her enstrümanın farklı avantajları ve eksiklikleri vardır. Bu cihazlardaki çalışmalar için çok çeşitli hücre tipleri kullanılabilir, ancak özellikle zorlu bir hücre tipi insan primer T lenfositleridir5. Küçük boyutları, zayıf sağkalım ex vivo ve yapışkan olmayan özellikleri nedeniyle, insan birincil T hücrelerinin incelenmesi zor olabilir.

Bu, insan birincil T hücrelerinin mitokondriyal solunumunu hücre dışı bir analizör tarafından incelemek için bir protokoldür. Protokol, kuyu başına optimal hücre sayısı konsantrasyonlarının yanı sıra optimal oligomisin ve FCCP konsantrasyonunun belirlendiği bir Optimizasyon çalışmasına bölünmüştür. Ayrıca, optimize edilmiş koşulların kullanıldığı bir Tahlil çalışması.

Kan kaynaklı insan PBMC'lerini ve ex vivo primer T hücre kültürlerini kullanan bu protokol, optimal inhibitör konsantrasyonunun önemini ve hassas hücre tipleriyle çalışırken mitokondriyal inhibitörlerin sıralı enjeksiyonu yerine ayrı ayrı kullanılmasının önemini göstermektedir. Son olarak, bu tahlilin IL-2 ve IL-15 sitokinleri ile polarizasyon üzerine mitokondriyal solunumdaki ince farklılıkları sağlam bir şekilde tespit edebileceği gösterilmiştir.

Protokol

Deneyler, Herlev Hastanesi ve Danimarka'nın Başkent Bölgesi'nin yönergeleri altında gerçekleştirildi.

NOT: Bu protokol hem Optimizasyon çalıştırması hem de Tahliller çalıştırması için yönergeler içerir. Talimatlar bir Optimizasyon çalıştırması veya bir Tahlil çalıştırması için olduğunda metinde açıkça yazılır. Tahlil çalıştırmalarına devam etmeden önce bir Optimizasyon çalıştırması çalıştırın

1. Buffy paltolardan insan periferik kan mononükleer (PBMC) izolasyonu

1. PBMC yalıtımı
   1. Buffy paltoları uygun kurumdan toplayın (kan toplama torbalarında toplanır). Buffy paltolar sağlıklı donörlerden kaynaklanır. Son zamanlarda ağrı kesici kullanan bağışçıları hariç tutun.
   2. Laminer akış kabinine aktarmadan önce buffy ceketi içeren kan toplama torbasına% 70 etanol püskürtün. Tüm adımlar için her zaman steril teknikler ve steril donanım kullanın
      NOT: İnsan kan örneklerinin işlenmesi için doğru izinlerin alındığından emin olun.
   3. Kanı steril bir 50 mL santrifüj tüpüne aktarın.
   4. Kanı takviye edilmemiş RPMI 1640 ile en az% 10 seyreltin.
   5. Tercih edilen yoğunluk gradyanı ortamının 20 mL'sini 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne dökün.
   6. Seyreltilmiş kanın 25 mL'sini serolojik bir pipete aspire edin. Elektrikli pipet kontrol cihazını en düşük hıza ayarlayın.
   7. Yoğunluk gradyanı ortamına sahip tüpü 45° açıyla tutun ve serolojik pipet ucunu 50 mL santrifüj tüpünün iç tarafına yerleştirin. Seyreltilmiş kanın 25 mL'sini serolojik pipetten yavaşça serbest bırakın.
   8. Seyreltilmiş kanın ve yoğunluk gradyanı ortamının karışmadığından emin olun. Seyreltilmiş kanın yoğunluk gradyanı ortamının üstünde durduğundan emin olun.
   9. Tüm seyreltilmiş kan işlenene kadar bunu sonraki yoğunluk gradyanı orta tüplerle tekrarlayın.
   10. Tüpleri, oda sıcaklığında (RT) bir salınımlı rotorda 30 dakika boyunca 1000 x g'de bir santrifüje ve santrifüje dikkatlice hareket ettirin. Hızlanma ve kırılmanın minimumda olduğundan emin olun.
       NOT: Santrifüjlemeden sonra, çeşitli katmanlar görünür olmalıdır. Üstteki, berrak pembe-turuncu tabaka kan plazması ve trombositlerden oluşur. Orta beyaz tabaka, PBMC'lerden oluşur, ardından yoğunluk gradyanı ortamından oluşan berrak bir tabaka ve son olarak altta kırmızı kan hücreleri ile koyu kırmızı bir tabaka oluşur.
   11. Steril bir Pasteur pipet kullanarak, PBMC içeren beyaz tabakayı 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne dikkatlice aspire edin.
       NOT: Yoğunluk gradyanı ortamını aktarmadığınızdan emin olun, çünkü bu aşağı akış arıtmasını etkileyecektir. Aşırı plazma sonuçları etkilemeyecektir.
   12. Toplanan tüm PBMC'leri aynı 50 mL santrifüj tüpünde toplayın ve RPMI 1640 ile 50 mL'ye kadar doldurun.
   13. RT'de 5 dakika boyunca hücreleri 500 x g'de santrifüj yapın (aksi belirtilmedikçe kalan santrifüjleme adımlarını bu ayarda gerçekleştirin).
   14. Süpernatantı aspire edin ve hücreleri RPMI 1640'ın 30 mL'sinde yeniden askıya alın. Bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın.
   15. Kriyoprezervasyon için, 1 mL donma ortamı başına maksimum 30 milyon hücreyi yeniden askıya alın.
   16. Hücreleri kriyotüplere aktarın ve hız kontrollü bir dondurma kabı (dakikada -1 ° C) kullanarak -80 ° C'ye kadar dondurun. Uzun süreli depolama için PBMC'leri -140 °C'ye taşıyın.
       NOT: RT'de hücrelerin donma ortamında olduğu süreyi sınırlayın. RT'de, DMSO hücreler için oldukça toksiktir.

2. Aktif insan primer T lenfositlerinin kültürlenmesi

1. Hücrelerin çözülmesi (1. Gün)
   1. Numune başına yaklaşık 37 ° C'ye kadar önceden ısıtılmış 10 mL RPMI 1640.
   2. İstenilen sayıda hücre ampulünü alın ve geçici olarak kuru buz üzerinde saklayın.
   3. Dondurulmuş hücreleri 10 mL önceden ısıtılmış RPMI 1640'ta yeniden askıya alın.
   4. RT'de 500 x g'de hücreleri 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
   5. Süpernatantı atın ve 2.1.4'te açıklandığı gibi 10 mL RPMI 1640 ve santrifüjde yeniden askıya alarak hücreleri tekrar yıkayın.
   6. Süpernatantı atın ve hücreleri mL başına 2 x ¹⁰⁶ hücrede X-VIVO 15 ortamı +% 5 insan serumunda (bundan böyle: T hücre ortamı) yeniden askıya alın.
   7. 24 kuyucuklu bir hücre kültürü plakasında kuyu başına hücrelerin 2 mL'sini plakalayın ve gece boyunca 37 ° C'de ve% 5 _CO2'de inkübe edin.
2. Hücrelerin aktivasyonu (Gün 0)
   1. CD3/CD28 boncuklarını, 1 milyon hücre başına 12,5 μL boncukları bir mikrosantrifüj tüpüne aktararak yıkayın. 12,5 μL boncuk başına 12,5 μL PBS ekleyin.
      NOT: Kullanmadan önce boncuk şişesini vortekse etmek önemlidir.
   2. Mikrosantrifüj tüpünü 1 dakika boyunca uygun bir mıknatıs üzerine yerleştirin.
   3. Arabelleği atın ve boncukları orijinal T hücresi ortamı hacminde yeniden askıya alın (orijinal boncuk hacminin 12,5 μL'si başına 12,5 μL T hücre ortamı).
   4. 1: 2 oranına karşılık gelen milyonlarca hücre başına 12,5 μL boncuk ekleyin (boncuklar: hücreler).
   5. Hücreleri, her birinde yaklaşık 5 milyon hücre bulunan iki koşula bölün.
   6. Tablo 1'de belirtildiği gibi koşullara doğru miktarda sitokin ekleyin.
   7. Hücreleri 37 ° C'de ve% 5 _CO2'de 3 gün boyunca inkübe edin.
3. Hücrelerin kültürlenmesi (Gün 3 ve 5)
   1. Hücreleri yeniden askıya alın ve hacmin yarısını her kuyudan yeni bir kuyuya aktararak bölün. Her bir kuyucuğa aynı miktarda taze T hücresi ortamı ekleyin.
   2. Tablo 1'de belirtildiği gibi her duruma yeni sitokinler ekleyin.

3. Hücre dışı akı testi

1. Sensör kartuşunun hidrasyonu (Gün 0)
   1. Sensör kartuşunu ambalajından çıkarın ve sensör kartuşunu yardımcı plakadan dikkatlice çıkarın.
   2. Sensör kartuşunu baş aşağı yerleştirin ve sensör problarına dokunmamaya dikkat edin.
   3. Yardımcı plakayı 200 μL kalibrant ile doldurun (ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın) ve sensör kartuşunu dikkatlice tekrar yardımcı plakaya yerleştirin.
   4. Alternatif olarak, herhangi bir kabarcık oluşumunu ortadan kaldırmak için, sensör kartuşunu gece boyunca steril ultra saf suda inkübe edin ve tahlil sabahı önceden ısıtılmış bir kalibrent ile değiştirin.
   5. Sensör kartuş plakasını gece boyunca _CO2 ayarlı olmayan bir ısıtma kabininde 37 °C'de inkübe edin.
      NOT: Fazla CO2 sensör kartuşunu etkileyeceğinden, _CO2 düzenlemeli olmayan bir kabin kullanmak çok önemlidir. Akı analizörünün (ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın) 37 °C'ye kadar ısınmasını sağlamak için kullanımdan en az bir gün önce açık olduğundan emin olun.
2. Hücre kaplaması ve mitokondriyal inhibitörlerin hazırlanması (Gün 1)
   1. NaHCO3 (pH _8.3, 0.1 M, 1128 μL), Cell-Tak (1 mg/mL, 48 μL) ve NaOH (1.0 M, 24 μL) içeren bir kaplama çözeltisi hazırlayın (bkz.
      NOT: Kaplama çözeltisi her zaman taze yapılmalı ve kullanılmalıdır.
   2. Taze bir XF hücre kültürü plakası açın ve her bir oyuğa taze hazırlanmış kaplama çözeltisinden 12 μL ekleyin. Kaplama çözeltisinin tüm kuyucukların dibinde eşit dağılımını sağlayın.
   3. RT'deki plakayı kapağı açık olarak 30 dakika boyunca inkübe edin ve kalan sıvı çözeltiyi tüm kuyucuklardan atın.
   4. Plakayı 200 μL steril suyla yıkayın ve sıvıyı atın.
   5. Plakayı 200 μL hücre kültürü sınıfı steril PBS ile yıkayın ve sıvıyı atın.
   6. Plakayı RT'de bırakın ve en az 30 dakika kurumaya bırakın.
3. XF hücre kültürü plakasındaki plaka T hücreleri (Gün 1)
   1. Uygun XF RPMI ortamını deneysel düzeneğe göre glikoz, piruvat ve glutamin ile karıştırarak 50 mL tahlil ortamı hazırlayın (Önerilen seviyeler: 4 mM glikoz, 1 mM piruvat ve 3 mM glutamin).
   2. CO2 düzenlemeli olmayan bir inkübatörde 37 °_C'ye ısıtın ve pH'ı 7,4'e ayarlayın. Hücreleri kaplamak ve oligomisin ve FCCP çözeltileri hazırlamak için yeterli ortam olduğundan emin olun (bölüm 3.4).
   3. Optimizasyon çalıştırması veya Tahlil çalıştırması için kuyu başına artan sayıda hücreye sahip bir plaka düzeni tasarlayın. Arka plan ölçümleri için medya ile doldurulmuş ve medya enjekte edilmiş dört adet 4 kuyucuk kullanın.
   4. Bölüm 2.3'te hazırlanan T hücrelerini (tercih edilen yöntemle) sayın ve plaka düzenine göre kaplama çözeltisi ile kaplanmış XF hücre kültürü plakasının her bir kuyucuğuna doğru sayıda hücreyi pipetleyin.
      NOT: Her bir kuyunun son hacmi değişebilir, ancak kuyunun dibini örtmek için yeterli olmalıdır.
   5. XF hücre kültürü plakasını RT'de 1000 x g'de santrifüj yaparak T hücresini kaplanmış yüzeye yapıştırmak için 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
   6. Hücreleri 200 μL tahlil ortamı ile yıkayın, ortamı atın ve 180 μL tahlil ortamı ekleyin.
      NOT: Hücrelerin kuyu yüzeyine tutturulmuş ve eşit olarak dağılmış olduğundan emin olmak için ters çevrilmiş bir ışık mikroskobu kullanarak kuyuları görsel olarak inceleyin.
   7. Plakanın sıcaklığının 37 °C olmasını sağlamak için XF hücre kültürü plakasını _CO2 ayarlı olmayan ısıtma kabininde 30 dakika boyunca inkübe edin.
4. Optimizasyon çalışması için oligomisin ve FCCP ile sensör kartuşu yükleme (1. Gün)
   NOT: Oligomisin ve FCCP konsantrasyonları zaten optimize edilmişse, bölüm 3.5'te devam edin.
   1. Oligomisin ve FCCP'nin çalışma çözeltilerini, adım 3.4.2 ve 3.4.3'te açıklandığı gibi tahlil ortamında (adım 3.3.1'de hazırlanan) hazırlayın.
   2. Oligomisin çalışma çözeltileri: 5 μM çözelti (2 mL tahlil ortamı + 10 μL 1 mM oligomisin stoğu) ve 3 μM çözelti (8 mL tahlil ortamı + 24 μL 1 mM oligomisin stoğu) hazırlayın.
   3. FCCP çalışma çözümü: 2 μM çözelti (2 mL tahlil ortamı + 13,2 μL 300 μM FCCP stoğu) ve 1,3 μM çözelti (8 ml tahlil ortamı + 34,6 μL 300 μM FCCP stoğu) hazırlayın
   4. Oligomisin veya FCCP'nin çalışma çözeltilerini sensör kartuşunun enjeksiyon portlarına yükleyin (Tablo 2).
      NOT. Hiçbir enjeksiyon portunun sadece hava içermemesi önemlidir. Herhangi bir nedenle, tüm enjeksiyon portları kullanılmıyorsa, boş portların tahlil ortamıyla doldurulması gerekir.
   5. Enjeksiyon portlarındaki potansiyel kabarcıkları gidermek için plakanın kenarlarını masanın üzerine yavaşça vurun.
5. Tahlil çalışması için oligomisin, FCCP ve antimisin A içeren sensör kartuşu yükleme (1. Gün)
   1. Önceki bir Optimizasyon çalışmasında tanımlanan optimum konsantrasyonlara göre tahlil ortamında oligomisin, FCCP çözeltileri hazırlayın (adım 3.3.1'de hazırlanmıştır). Ayrıca, 20 μM'lik bir antimisin A çözeltisi hazırlayın.
   2. Plaka düzenine göre sensör kartuşunun A enjeksiyon portuna 20 μL oligomisin veya FCCP yükleyin. Tüm kuyucukların B enjeksiyon portuna 22 μL 20 μM antimisin A ekleyin. Kuyuya enjekte edildikten sonra ortaya çıkan antimisin A konsantrasyonu 2 μM olacaktır.
6. Flux analizör yazılımında deneysel protokolün kurulması.
   1. Plaka düzeni başına her koşul için grupları ve plaka haritasını atayın.
   2. Protokolü enjeksiyon stratejisine göre tasarlayın (Tablo 3 ve Şekil 1).
      NOT: Tahlil çalışmalarını çalıştırırken, C ve D enjeksiyonları atlanabilir.
   3. Tahlil kurulumunu kaydedin, tahlil için dahil edilmesi gereken bilgileri doldurun ve Başlat'a basın.
   4. Akı analizörü, bölüm 3.5'te hazırlanan sensör kartuşunu isteyecektir. Kapağı çıkarın ve sensör kartuşunu analizörün yönlendirdiği şekilde takın.
      NOT: Tahlil, onay işaretleriyle belirtilen sensörleri kalibre edecek ve kontrol edecektir. Başarılı kalibrasyondan sonra, analizör bölüm 3.3'te hazırlanan XF hücre kültürü plakasını talep edecektir. Yardımcı plaka analizörden çıkarılır ve tahlili başlatmak için XF hücre kültürü plakası ile değiştirilir.

Sonuçlar

OxPhos özelliklerinin doğru belirlenmesi, T hücrelerini incelerken vazgeçilmez bir araçtır. Bununla birlikte, tahlil koşulları optimize edilmemişse, yanıltıcı veya hatalı sonuçlar elde etme riski vardır. Bu protokolde, kuyu başına hücre sayısının optimizasyonuna ve kullanılacak oligomisin ve FCCP konsantrasyonlarına güçlü bir odaklanma vardır. Tarif edilen kurulumda, oligomisin ve FCCP aynı kuyuya kademeli olarak eklenir ve mitokondriyal modülatörlerin konsantrasyonu arttırılır. Oligomisi...

Tartışmalar

Oksidatif fosforilasyonun ayrıntılı ve doğru bir şekilde ölçülmesi, T hücrelerinin enerji durumlarını tanımlarken vazgeçilmez bir araçtır. Mitokondriyal uygunluk durumu, T hücresi aktivasyon potansiyeli, sağkalım ve farklılaşma ile doğrudan ilişkili ^olabilir1,5. Bu protokolle, oksidatif fosforilasyonun çeşitli özelliklerini belirlemek mümkündür (ayrıntılı bir açıklama için Tablo 4'e bakınız). Oksidatif fosforil...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well tissue culture plate	Nunc	142485
Anti-CD3xCD28 beads	Gibco	11161D
Antimycin A	Merck	A8674
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
Cell-Tak	Corning	354240	For coating
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	D9170
Human Serum	Sigma Aldrich	H4522	Heat inactivated at 56 °C for 30 min
IL-15	Peprotech	200-02
IL-2	Peprotech	200-15
Lymphoprep	Stemcell Technologies	07801
Oligomycin	Merck	O4876
PBS	Thermo Fisher	10010023
RPMI 1640	Gibco-Thermo Fisher	61870036
Seahorse Calibrant	Agilent Technologies	102416-100
Seahorse XF 1.0 M glucose solution	Agilent Technologies	103577-100
Seahorse XF 100 mM pytuvate solution	Agilent Technologies	103578-100
Seahorse XF 200 mM glutamine solution	Agilent Technologies	103579-100
Seahorse XF RPMI medium, pH7.4	Agilent Technologies	103576-100	XF RPMI media
Seahorse XFe96 Analyser	Agilent Technologies		Flux analyzer
Seahorse XFe96 cell culture microplates	Agilent Technologies	102416-100	XF cell culture plate
Seahorse XFe96 sensor cartridge	Agilent Technologies	102416-100
Sodium Bicarbonate concentrate 0.1 M (NaHCO3)	Sigma Aldrich	36486
Sodium Hydroxide solution 1 N (NaOH)	Sigma Aldrich	S2770-100ML
X-VIVO 15	Lonza	BE02-060F
T cell beads magnet DynaMag-2 Magnet	Thermo Fisher	12321D
Seahorse wave			Flux analyzer software