Monitoreo en tiempo real de la respiración mitocondrial en células T primarias humanas diferenciadas por citoquinas

Resumen

La adaptación metabólica es fundamental para las células T, ya que dicta la diferenciación, la persistencia y la citotoxicidad. Aquí, se presenta un protocolo optimizado para monitorear la respiración mitocondrial en células T primarias humanas diferenciadas por citoquinas ex vivo .

Resumen

Durante la activación, el metabolismo de las células T se adapta a los cambios que afectan su destino. Un aumento en la fosforilación oxidativa mitocondrial es indispensable para la activación de las células T, y la supervivencia de las células T de memoria depende de la remodelación mitocondrial. En consecuencia, esto afecta el resultado clínico a largo plazo de las inmunoterapias contra el cáncer. Los cambios en la calidad de las células T a menudo se estudian mediante citometría de flujo utilizando marcadores de superficie bien conocidos y no directamente por su estado metabólico. Este es un protocolo optimizado para medir la respiración mitocondrial en tiempo real de las células T humanas primarias utilizando un analizador de flujo extracelular y las citoquinas IL-2 e IL-15, que afectan de manera diferente el metabolismo de las células T. Se ha demostrado que el estado metabólico de las células T se puede distinguir claramente midiendo el consumo de oxígeno al inhibir complejos clave en la vía metabólica y que la precisión de estas mediciones depende en gran medida de la concentración óptima de inhibidores y la estrategia de inyección de inhibidores. Este protocolo estandarizado ayudará a implementar la respiración mitocondrial como un estándar para la aptitud de las células T en el monitoreo y estudio de las inmunoterapias contra el cáncer.

Introducción

El correcto desarrollo y función de las células T son esenciales para la capacidad del sistema inmunitario de reconocer y responder a los antígenos. La fosforilación oxidativa mitocondrial (OxPhos) cambia según el estado de la célula T. Las células T naïve utilizan predominantemente OxPhos para producir ATP, mientras que las células T activadas experimentan una transición metabólica donde la glucólisis se vuelve ^dominante1. Después de la fase efectora, el pequeño subconjunto restante de células T de memoria vuelve a un estado metabólico dominado por ^OxPhos2,3. Los cambios de OxPhos sigu....

Protocolo

Los experimentos se llevaron a cabo bajo las directrices del Hospital Herlev y la Región Capital de Dinamarca.

Nota : este protocolo contiene instrucciones para una ejecución de optimización y una ejecución de ensayos. Está claramente escrito en el texto cuando las instrucciones son para una ejecución de optimización o una ejecución de ensayo. Ejecutar una ejecución de optimización antes de continuar con las ejecuciones de assay

1. Aislamiento mononuclear de sangre periférica humana (PBMC) de abrigos buffy

1. Aislamiento PBMC
   1. Recolecte abrigos buffy de la institución apropiada (rec....

Resultados

Una correcta determinación de las propiedades de OxPhos es una herramienta indispensable a la hora de estudiar las células T. Sin embargo, si las condiciones del ensayo no se han optimizado, existe un riesgo sustancial de resultados engañosos o erróneos. En este protocolo, hay un fuerte enfoque en la optimización del número de células por pozo y las concentraciones de oligomicina y FCCP a utilizar. En la configuración descrita, la oligomicina y la FCCP se agregan incrementalmente al mismo pozo, aumentando la conc.......

Discusión

La cuantificación detallada y correcta de la fosforilación oxidativa es una herramienta indispensable a la hora de describir los estados energéticos de las células T. El estado de aptitud mitocondrial puede estar directamente relacionado con el potencial de activación, supervivencia y diferenciación de las células ^T1,5. Con este protocolo, es posible determinar las diversas propiedades de la fosforilación oxidativa (ver Tabla 4 para una e.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well tissue culture plate	Nunc	142485
Anti-CD3xCD28 beads	Gibco	11161D
Antimycin A	Merck	A8674
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
Cell-Tak	Corning	354240	For coating
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	D9170
Human Serum	Sigma Aldrich	H4522	Heat inactivated at 56 °C for 30 min
IL-15	Peprotech	200-02
IL-2	Peprotech	200-15
Lymphoprep	Stemcell Technologies	07801
Oligomycin	Merck	O4876
PBS	Thermo Fisher	10010023
RPMI 1640	Gibco-Thermo Fisher	61870036
Seahorse Calibrant	Agilent Technologies	102416-100
Seahorse XF 1.0 M glucose solution	Agilent Technologies	103577-100
Seahorse XF 100 mM pytuvate solution	Agilent Technologies	103578-100
Seahorse XF 200 mM glutamine solution	Agilent Technologies	103579-100
Seahorse XF RPMI medium, pH7.4	Agilent Technologies	103576-100	XF RPMI media
Seahorse XFe96 Analyser	Agilent Technologies		Flux analyzer
Seahorse XFe96 cell culture microplates	Agilent Technologies	102416-100	XF cell culture plate
Seahorse XFe96 sensor cartridge	Agilent Technologies	102416-100
Sodium Bicarbonate concentrate 0.1 M (NaHCO3)	Sigma Aldrich	36486
Sodium Hydroxide solution 1 N (NaOH)	Sigma Aldrich	S2770-100ML
X-VIVO 15	Lonza	BE02-060F
T cell beads magnet DynaMag-2 Magnet	Thermo Fisher	12321D
Seahorse wave			Flux analyzer software