Monitoreo en tiempo real de la respiración mitocondrial en células T primarias humanas diferenciadas por citoquinas

Resumen

La adaptación metabólica es fundamental para las células T, ya que dicta la diferenciación, la persistencia y la citotoxicidad. Aquí, se presenta un protocolo optimizado para monitorear la respiración mitocondrial en células T primarias humanas diferenciadas por citoquinas ex vivo .

Resumen

Durante la activación, el metabolismo de las células T se adapta a los cambios que afectan su destino. Un aumento en la fosforilación oxidativa mitocondrial es indispensable para la activación de las células T, y la supervivencia de las células T de memoria depende de la remodelación mitocondrial. En consecuencia, esto afecta el resultado clínico a largo plazo de las inmunoterapias contra el cáncer. Los cambios en la calidad de las células T a menudo se estudian mediante citometría de flujo utilizando marcadores de superficie bien conocidos y no directamente por su estado metabólico. Este es un protocolo optimizado para medir la respiración mitocondrial en tiempo real de las células T humanas primarias utilizando un analizador de flujo extracelular y las citoquinas IL-2 e IL-15, que afectan de manera diferente el metabolismo de las células T. Se ha demostrado que el estado metabólico de las células T se puede distinguir claramente midiendo el consumo de oxígeno al inhibir complejos clave en la vía metabólica y que la precisión de estas mediciones depende en gran medida de la concentración óptima de inhibidores y la estrategia de inyección de inhibidores. Este protocolo estandarizado ayudará a implementar la respiración mitocondrial como un estándar para la aptitud de las células T en el monitoreo y estudio de las inmunoterapias contra el cáncer.

Introducción

El correcto desarrollo y función de las células T son esenciales para la capacidad del sistema inmunitario de reconocer y responder a los antígenos. La fosforilación oxidativa mitocondrial (OxPhos) cambia según el estado de la célula T. Las células T naïve utilizan predominantemente OxPhos para producir ATP, mientras que las células T activadas experimentan una transición metabólica donde la glucólisis se vuelve ^dominante1. Después de la fase efectora, el pequeño subconjunto restante de células T de memoria vuelve a un estado metabólico dominado por ^OxPhos2,3. Los cambios de OxPhos siguen la diferenciación de las células T a tal grado que incluso subconjuntos de células T pueden diferenciarse por sus propiedades específicas de ^OxPhos1. Por el contrario, OxPhos es importante para la función de las células T, y se ha demostrado que la inhibición de OxPhos bloquea la proliferación y la producción de citoquinas de las células ^T4. Por lo tanto, la capacidad de cuantificar las propiedades de oxPhos de células T de una manera precisa y reproducible es una herramienta poderosa para cualquier persona que trabaje con células T.

En este protocolo, las propiedades de oxPhos de células T se miden utilizando un analizador de flujo extracelular. La función principal de este analizador es medir continuamente el contenido de oxígeno de los medios de crecimiento de las células a analizar. Se supone que el oxígeno eliminado de los medios de crecimiento es absorbido por las células. Al tratar las células con una variedad de inhibidores o modificadores de OxPhos, una caída en la absorción de oxígeno se asocia con la función inhibida o modulada. Por ejemplo, la inhibición de la ATP sintasa conducirá a una absorción celular reducida de oxígeno que de otro modo se utilizaría para producir ATP por fosforilación oxidativa. Otros equipos, incluidos el electrodo Clark y el instrumento Oroboros, ofrecen una funcionalidad similar, y cada instrumento tiene diferentes ventajas y deficiencias. Se puede utilizar una amplia gama de tipos de células para estudios en estos dispositivos, pero un tipo de célula particularmente desafiante son los linfocitos T primarios ^humanos5. Debido a su pequeño tamaño, pobre supervivencia ex vivo y propiedades no adherentes, las células T primarias humanas pueden ser difíciles de estudiar.

Este es un protocolo para estudiar la respiración mitocondrial de las células T primarias humanas mediante un analizador extracelular. El protocolo se divide en una ejecución de optimización, donde se determinan las concentraciones óptimas de número de células por pozo, así como la concentración óptima de oligomicina y FCCP. Además, se ejecuta un ensayo, donde se utilizan las condiciones optimizadas.

Utilizando PBMC humanos derivados de la sangre y cultivos de células T primarias ex vivo , este protocolo demuestra la importancia de una concentración óptima de inhibidores y la relevancia de usar una inyección separada en lugar de una inyección secuencial de inhibidores mitocondriales cuando se trabaja con tipos de células sensibles. Finalmente, está demostrado que este ensayo puede detectar de manera robusta diferencias sutiles en la respiración mitocondrial tras la polarización con las citoquinas IL-2 e IL-15.

Protocolo

Los experimentos se llevaron a cabo bajo las directrices del Hospital Herlev y la Región Capital de Dinamarca.

Nota : este protocolo contiene instrucciones para una ejecución de optimización y una ejecución de ensayos. Está claramente escrito en el texto cuando las instrucciones son para una ejecución de optimización o una ejecución de ensayo. Ejecutar una ejecución de optimización antes de continuar con las ejecuciones de assay

1. Aislamiento mononuclear de sangre periférica humana (PBMC) de abrigos buffy

1. Aislamiento PBMC
   1. Recolecte abrigos buffy de la institución apropiada (recolectados en bolsas de recolección de sangre). Los abrigos Buffy se originan de donantes sanos. Excluya a los donantes que hayan usado analgésicos recientemente.
   2. Rocíe la bolsa de recolección de sangre que contiene la capa buffy con etanol al 70% antes de transferirla a un gabinete de flujo laminar. Utilice siempre técnicas estériles y hardware estéril para todos los pasos
      NOTA: Asegurar que se obtengan las autorizaciones correctas para el manejo de muestras de sangre humana.
   3. Transfiera la sangre a un tubo de centrífuga estéril de 50 ml.
   4. Diluya la sangre al menos al 10% con RPMI 1640 no suplementado.
   5. Vierta 20 ml del medio de gradiente de densidad preferido en un tubo centrífugo de 50 ml.
   6. Aspire 25 ml de la sangre diluida en una pipeta serológica. Ajuste el controlador de pipeta eléctrica a la velocidad más baja.
   7. Sostenga el tubo con medio de gradiente de densidad en un ángulo de 45° y apoye la punta de la pipeta serológica en el lado interior del tubo centrífugo de 50 ml. Libere lentamente 25 ml de la sangre diluida de la pipeta serológica.
   8. Asegúrese de que la sangre diluida y el medio de gradiente de densidad no se mezclen. Asegúrese de que la sangre diluida descanse sobre el medio de gradiente de densidad.
   9. Repita esto con tubos medios de gradiente de densidad posteriores hasta que se procese toda la sangre diluida.
   10. Mueva cuidadosamente los tubos a una centrífuga y centrífuga a 1000 x g durante 30 minutos en un rotor oscilante a temperatura ambiente (RT). Asegúrese de que la aceleración y la rotura sean mínimas.
       NOTA: Después de la centrifugación, varias capas deben ser visibles. La capa superior, clara de rosa a naranja consiste en el plasma sanguíneo y las plaquetas. La capa blanca media consiste en los PBMC seguidos de una capa transparente que consiste en el medio de gradiente de densidad, y finalmente una capa roja oscura en la parte inferior con glóbulos rojos.
   11. Usando una pipeta Pasteur estéril, aspire cuidadosamente la capa blanca que contiene PBMC a un tubo centrífugo de 50 ml.
       NOTA: Asegúrese de no transferir el medio de gradiente de densidad, ya que esto afectará la purificación aguas abajo. El exceso de plasma no afectará los resultados.
   12. Agrupe todos los PBMC recolectados en el mismo tubo centrífugo de 50 ml y recargue hasta 50 ml con RPMI 1640.
   13. Centrifugar las células a 500 x g durante 5 min a RT (realice los pasos de centrifugación restantes en este ajuste a menos que se especifique lo contrario).
   14. Aspirar el sobrenadante y resuspend las células en 30 mL de RPMI 1640. Cuente las células usando un hemocitómetro o un contador celular automatizado.
   15. Para la criopreservación, resuspenda un máximo de 30 millones de células por 1 ml de medio de congelación.
   16. Transfiera las células a criotubos y congele hasta -80 °C utilizando un recipiente de congelación de velocidad controlada (-1 °C por minuto). Para el almacenamiento a largo plazo, mueva los PBMC a -140 °C.
       NOTA: Limite el tiempo que las celdas están en el medio de congelación en RT. En RT, DMSO es altamente tóxico para las células.

2. Cultivo de linfocitos T primarios humanos activados

1. Descongelación de las células (Día 1)
   1. Precaliente 10 ml de RPMI 1640 por muestra a alrededor de 37 °C.
   2. Tome el número deseado de ampollas celulares y guárdelas temporalmente en hielo seco.
   3. Resuspend las células congeladas en 10 mL de RPMI 1640 precalentado.
   4. Centrifugar las células durante 5 min a 500 x g en RT.
   5. Deseche el sobrenadante y lave las células de nuevo resuspiendo en 10 ml de RPMI 1640 y centrifugando como se describe en 2.1.4.
   6. Deseche el sobrenadante y resuspenda las células a 2 x ¹⁰⁶ células por ml de X-VIVO 15 medio + 5% de suero humano (en adelante: medio de células T).
   7. Placa 2 ml de las células por pozo en una placa de cultivo celular de 24 pocillos e incubar durante la noche a 37 °C y 5% de _CO2.
2. Activación de las células (Día 0)
   1. Lave las perlas CD3/CD28 transfiriendo 12,5 μL de perlas por 1 millón de células a un tubo de microcentrífuga. Añadir 12,5 μL de PBS por 12,5 μL de perlas.
      NOTA: Es importante vórtice el vial de perlas antes de su uso.
   2. Coloque el tubo de la microcentrífuga en un imán adecuado durante 1 min.
   3. Deseche el tampón y vuelva a suspender las perlas en el volumen original del medio de células T (12,5 μL de medio de células T por 12,5 μL del volumen original de perlas).
   4. Añadir 12,5 μL de perlas por millón de células correspondiente a una proporción de 1:2 (perlas: células).
   5. Divida las células en dos condiciones con alrededor de 5 millones de células en cada una.
   6. Agregue el volumen correcto de citoquinas a las condiciones como se menciona en la Tabla 1.
   7. Incubar las células durante 3 días a 37 °C y 5% de _CO2.
3. Cultivo de células (Día 3 y 5)
   1. Resuspend las células y divídelas transfiriendo la mitad del volumen de cada pozo a un nuevo pozo. Agregue el mismo volumen de medio de células T frescas a cada pocillo.
   2. Agregue nuevas citoquinas a cada afección como se menciona en la Tabla 1.

3. Ensayo de flujo extracelular

1. Hidratación del cartucho del sensor (Día 0)
   1. Desembala el cartucho del sensor y retira cuidadosamente el cartucho del sensor de la placa de utilidad.
   2. Coloque el cartucho del sensor boca abajo, teniendo cuidado de no tocar las sondas del sensor.
   3. Llene la placa de utilidad con 200 μL de calibrante (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles) y reemplace cuidadosamente el cartucho del sensor de nuevo en la placa de utilidad.
   4. Alternativamente, para eliminar cualquier formación de burbujas, incube el cartucho del sensor en agua ultrapura estéril durante la noche y reemplácelo con un calibrante precalentado en la mañana del ensayo.
   5. Incube la placa del cartucho del sensor a 37 °C en un armario calefactor no regulado por _CO2 durante la noche.
      NOTA: Es muy importante utilizar un gabinete no regulado por _CO2 , ya que el exceso de _CO2 influirá en el cartucho del sensor. Asegúrese de que el analizador de flujo (consulte la Tabla de materiales para obtener más información) esté encendido al menos un día antes de su uso para permitir que se caliente hasta 37 °C.
2. Recubrimiento celular y preparación de inhibidores mitocondriales (Día 1)
   1. Preparar una solución de recubrimiento (ver Tabla de Materiales) que contenga NaHCO3 (pH 8.3, 0.1 M, 1128 μL), Cell-Tak (1 mg/mL, 48 μL) y NaOH (1.0 M, 24 μL).
      NOTA: La solución de recubrimiento siempre debe hacerse y usarse fresca.
   2. Abra una placa de cultivo celular XF fresca y agregue 12 μL de la solución de recubrimiento recién preparada a cada pozo. Asegurar una distribución uniforme de la solución de recubrimiento en el fondo de todos los pozos.
   3. Incubar la placa en RT con la tapa puesta durante 30 min y desechar la solución líquida restante de todos los pocillos.
   4. Lave la placa con 200 μL de agua estéril y deseche el líquido.
   5. Lavar la placa con 200 μL de PBS estéril de grado de cultivo celular y desechar el líquido.
   6. Deje la placa en RT y déjela secar durante al menos 30 min.
3. Placa T de células en la placa de cultivo de células XF (Día 1)
   1. Prepare 50 ml de medios de ensayo mezclando medios XF RPMI adecuados con glucosa, piruvato y glutamina de acuerdo con la configuración experimental (niveles recomendados: 4 mM de glucosa, 1 mM de piruvato y 3 mM de glutamina).
   2. Calentar a 37 °C en una incubadora no regulada por _CO2 y fijar el pH en 7,4. Asegúrese de que hay suficientes medios para el recubrimiento de las células y la preparación de soluciones de oligomicina y FCCP (sección 3.4).
   3. Diseñe un diseño de placa con un número creciente de celdas por pozo para la ejecución de optimización o la ejecución de ensayo. Use cuatro 4 pocillos, llenos de medios e inyectados con medios, para mediciones de fondo.
   4. Cuente las células T preparadas en la sección 2.3 (por el método preferido) y canalice el número correcto de células a cada pocillo de la placa de cultivo celular XF recubierta con la solución de recubrimiento, de acuerdo con el diseño de la placa.
      NOTA: El volumen final de cada pozo puede variar, pero debe ser suficiente para cubrir el fondo del pozo.
   5. Centrifugar la placa de cultivo celular XF a 1000 x g en RT durante 10 min para adherir la célula T a la superficie recubierta.
   6. Lave las células con 200 μL de medios de ensayo, deseche los medios y agregue 180 μL de medios de ensayo.
      NOTA: Inspeccione visualmente los pozos utilizando un microscopio de luz invertida para asegurarse de que las células estén unidas y distribuidas uniformemente a través de la superficie del pozo.
   7. Incubar la placa de cultivo celular XF en el armario calefactor no regulado por _CO2 durante 30 min para asegurar que la temperatura de la placa sea de 37 °C.
4. Cartucho de sensor de carga con oligomicina y FCCP para la ejecución de optimización (Día 1)
   NOTA: Si las concentraciones de oligomicina y FCCP ya estaban optimizadas, continúe en la sección 3.5.
   1. Preparar soluciones de trabajo de oligomicina y FCCP en medios de ensayo (preparados en la etapa 3.3.1) como se describe en las etapas 3.4.2 y 3.4.3.
   2. Soluciones de trabajo de oligomicina: preparar una solución de 5 μM (2 ml de medios de ensayo + 10 μL de 1 mM de cepa de oligomicina) y una solución de 3 μM (8 ml de medios de ensayo + 24 μL de existencias de oligomicina de 1 mM).
   3. Solución de trabajo FCCP: Preparar una solución de 2 μM (2 ml de medios de ensayo + 13,2 μL de 300 μM de material FCCP) y una solución de 1,3 μM (8 ml de medios de ensayo + 34,6 μL de 300 μM de material FCCP)
   4. Cargue las soluciones de trabajo de oligomicina o FCCP en los puertos de inyección del cartucho del sensor (Tabla 2).
      NOTA. Es importante que ningún puerto de inyección contenga solo aire. Si, por alguna razón, no se utilizan todos los puertos de inyección, los puertos vacíos deben llenarse con medios de ensayo.
   5. Golpee suavemente los bordes de la placa sobre la mesa para eliminar las burbujas potenciales en los puertos de inyección.
5. Cartucho de sensor de carga con oligomicina, FCCP y antimicina A para la ejecución del ensayo (Día 1)
   1. Preparar soluciones de oligomicina, FCCP en medios de ensayo (preparados en el paso 3.3.1) de acuerdo con las concentraciones óptimas identificadas en una ejecución de optimización anterior. Además, prepare una solución de antimicina A de 20 μM.
   2. Cargue 20 μL de oligomicina o FCCP en el puerto de inyección A del cartucho del sensor de acuerdo con el diseño de la placa. Añadir 22 μL de 20 μM de antimicina A al puerto de inyección B de todos los pocillos. La concentración resultante de antimicina A una vez inyectada en el pozo será de 2 μM.
6. Configuración del protocolo experimental en el software analizador Flux.
   1. Asigne los grupos y el mapa de placas para cada condición por diseño de placa.
   2. Diseñar el protocolo según la estrategia de inyección (Tabla 3 y Figura 1).
      NOTA: Al ejecutar ejecuciones de ensayo, se puede omitir la inyección C y D.
   3. Guarde la configuración del ensayo, complete la información necesaria para incluirla en el ensayo y pulse Inicio.
   4. El analizador de flujo solicitará el cartucho del sensor preparado en la sección 3.5. Retire la tapa e inserte el cartucho del sensor según las indicaciones del analizador.
      NOTA: El ensayo calibrará y comprobará los sensores indicados por las marcas de verificación. Después de una calibración exitosa, el analizador solicitará la placa de cultivo celular XF preparada en la sección 3.3. La placa de utilidad se expulsa del analizador y se reemplaza con la placa de cultivo celular XF para iniciar el ensayo.

Resultados

Una correcta determinación de las propiedades de OxPhos es una herramienta indispensable a la hora de estudiar las células T. Sin embargo, si las condiciones del ensayo no se han optimizado, existe un riesgo sustancial de resultados engañosos o erróneos. En este protocolo, hay un fuerte enfoque en la optimización del número de células por pozo y las concentraciones de oligomicina y FCCP a utilizar. En la configuración descrita, la oligomicina y la FCCP se agregan incrementalmente al mismo pozo, aumentando la conc...

Discusión

La cuantificación detallada y correcta de la fosforilación oxidativa es una herramienta indispensable a la hora de describir los estados energéticos de las células T. El estado de aptitud mitocondrial puede estar directamente relacionado con el potencial de activación, supervivencia y diferenciación de las células ^T1,5. Con este protocolo, es posible determinar las diversas propiedades de la fosforilación oxidativa (ver Tabla 4 para una e...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well tissue culture plate	Nunc	142485
Anti-CD3xCD28 beads	Gibco	11161D
Antimycin A	Merck	A8674
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
Cell-Tak	Corning	354240	For coating
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	D9170
Human Serum	Sigma Aldrich	H4522	Heat inactivated at 56 °C for 30 min
IL-15	Peprotech	200-02
IL-2	Peprotech	200-15
Lymphoprep	Stemcell Technologies	07801
Oligomycin	Merck	O4876
PBS	Thermo Fisher	10010023
RPMI 1640	Gibco-Thermo Fisher	61870036
Seahorse Calibrant	Agilent Technologies	102416-100
Seahorse XF 1.0 M glucose solution	Agilent Technologies	103577-100
Seahorse XF 100 mM pytuvate solution	Agilent Technologies	103578-100
Seahorse XF 200 mM glutamine solution	Agilent Technologies	103579-100
Seahorse XF RPMI medium, pH7.4	Agilent Technologies	103576-100	XF RPMI media
Seahorse XFe96 Analyser	Agilent Technologies		Flux analyzer
Seahorse XFe96 cell culture microplates	Agilent Technologies	102416-100	XF cell culture plate
Seahorse XFe96 sensor cartridge	Agilent Technologies	102416-100
Sodium Bicarbonate concentrate 0.1 M (NaHCO3)	Sigma Aldrich	36486
Sodium Hydroxide solution 1 N (NaOH)	Sigma Aldrich	S2770-100ML
X-VIVO 15	Lonza	BE02-060F
T cell beads magnet DynaMag-2 Magnet	Thermo Fisher	12321D
Seahorse wave			Flux analyzer software