사이토카인 분화된 인간 일차 T 세포에서 미토콘드리아 호흡의 실시간 모니터링

요약

대사 적응은 분화, 지속성 및 세포 독성을 지시하기 때문에 T 세포의 기본입니다. 여기서, 생체외 사이토카인-분화된 인간 일차 T 세포에서 미토콘드리아 호흡을 모니터링하기 위한 최적화된 프로토콜이 제시된다.

초록

활성화하는 동안, T 세포의 신진 대사는 그들의 운명에 영향을 미치는 변화에 적응합니다. 미토콘드리아 산화 인산화의 증가는 T 세포 활성화에 필수적이며, 기억 T 세포의 생존은 미토콘드리아 리모델링에 의존한다. 결과적으로, 이것은 암 면역 요법의 장기적인 임상 결과에 영향을 미칩니다. T 세포 질의 변화는 종종 대사 상태에 의한 것이 아니라 잘 알려진 표면 마커를 사용하는 유세포 측정에 의해 연구됩니다. 이것은 세포외 플럭스 분석기와 T 세포 대사에 다르게 영향을 미치는 사이토카인 IL-2 및 IL-15를 사용하여 일차 인간 T 세포의 실시간 미토콘드리아 호흡을 측정하기 위한 최적화된 프로토콜입니다. T 세포의 대사 상태는 대사 경로에서 주요 복합체를 억제할 때 산소 소비량을 측정함으로써 명확하게 구별될 수 있으며, 이러한 측정의 정확도는 최적의 억제제 농도 및 억제제 주입 전략에 크게 의존한다는 것을 보여준다. 이 표준화 된 프로토콜은 암 면역 요법을 모니터링하고 연구하는 T 세포 적합성의 표준으로 미토콘드리아 호흡을 구현하는 데 도움이됩니다.

서문

정확한 T 세포 발달 및 기능은 면역계가 항원을 인식하고 반응하는 능력에 필수적입니다. 미토콘드리아 산화적 인산화(OxPhos)는 T 세포의 상태에 따라 변화한다. Naïve T 세포는 주로 OxPhos를 사용하여 ATP를 생산하는 반면, 활성화 된 T 세포는 글리코 분해가 지배적이되는 대사 전이를 겪습니다¹. 이펙터 단계 후에, 기억 T 세포의 작은 잔여 서브세트는 OxPhos2,3에 의해 지배되는 대사 상태로 되돌아간다. OxPhos의 변화는 T 세포의 서브세트조차도 그들의 특이적인 OxPhos 특성¹에 의해 분화될 수 있는 정도까지 T 세포의 분화를 따른다. 반대로, OxPos는 T 세포의 기능에 중요하며, OxPhos의 억제는 T 세포의 증식 및 사이토카인 생산을 차단하는 것으로 입증되었습니다⁴. 따라서, T 세포 OxPhos의 특성을 정확하고 재현 가능한 방식으로 정량화하는 능력은 T 세포로 작업하는 모든 사람들에게 강력한 도구입니다.

이 프로토콜에서, T 세포 OxPhos의 특성은 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 측정된다. 이 분석기의 핵심 기능은 분석하고자 하는 세포의 성장 배지의 산소 함량을 지속적으로 측정하는 것이다. 성장 배지로부터 제거된 산소는 세포에 의해 흡수되는 것으로 가정된다. 세포를 다양한 OxPhos 억제제 또는 개질제로 처리함으로써, 산소 흡수의 감소는 억제되거나 변조된 기능과 관련된다. 예를 들어, ATP 신타제의 억제는 산화적 인산화에 의해 ATP를 생산하는데 달리 사용될 산소의 감소된 세포 흡수를 야기할 것이다. Clark 전극 및 Oroboros 장비를 포함한 다른 장비는 유사한 기능을 제공하며 각 장비마다 다른 장점과 단점이 있습니다. 이러한 장치의 연구에 다양한 세포 유형을 사용할 수 있지만, 특히 도전적인 세포 유형 중 하나는 인간 원발성 T 림프구⁵입니다. 그들의 작은 크기, 열악한 생존 ex 생체 및 비-부착성 특성으로 인해, 인간 일차 T 세포는 연구하기가 어려울 수 있다.

이것은 세포외 분석기에 의한 인간 일차 T 세포의 미토콘드리아 호흡을 연구하기 위한 프로토콜이다. 프로토콜은 최적화 실행으로 나뉘며, 웰 당 세포 수의 최적 농도와 올리고 마이신 및 FCCP의 최적 농도가 결정됩니다. 또한 최적화된 조건이 사용되는 Assay가 실행됩니다.

혈액 유래 인간 PBMCs 및 생체외 일차 T 세포 배양물을 사용하여, 이 프로토콜은 민감한 세포 유형으로 작업할 때 미토콘드리아 억제제의 순차적 주사 대신에 별도의 사용의 최적 저해제 농도와 관련성의 중요성을 입증한다. 마지막으로, 이 검정이 사이토카인 IL-2 및 IL-15와의 분극시 미토콘드리아 호흡의 미묘한 차이를 견고하게 검출할 수 있음이 입증된다.

프로토콜

실험은 Herlev Hospital과 덴마크의 수도권의 지침에 따라 수행되었습니다.

참고: 이 프로토콜에는 최적화 실행과 분석 실행에 대한 지침이 포함되어 있습니다. 최적화 실행 또는 어세이 실행에 대한 지침이 있을 때 텍스트에 명확하게 기록됩니다. 분석 실행을 계속하기 전에 최적화 실행 실행

1. 버피 코트로부터의 인간 말초 혈액 단핵 (PBMC) 분리

1. PBMC 분리
   1. 적절한 기관에서 버피 코트를 수집하십시오 (혈액 수집 가방에 수집). 버피 코트는 건강한 기증자에게서 유래합니다. 최근에 진통제를 사용한 기증자는 제외하십시오.
   2. 버피 코트가 들어있는 혈액 수집 백을 층류 캐비닛으로 옮기기 전에 70 % 에탄올로 스프레이하십시오. 모든 단계에 대해 항상 멸균 기술과 멸균 하드웨어를 사용하십시오.
      참고: 인간 혈액 샘플의 취급에 대한 올바른 허가를 받았는지 확인하십시오.
   3. 혈액을 멸균된 50 mL 원심분리 튜브로 옮긴다.
   4. 보충되지 않은 RPMI 1640으로 혈액을 적어도 10 % 희석하십시오.
   5. 바람직한 밀도 구배 배지 20 mL를 50 mL 원심분리 튜브에 붓는다.
   6. 희석된 혈액 25 mL를 혈청학적 피펫에 흡인시킨다. 전기 피펫 컨트롤러를 최저 속도로 설정하십시오.
   7. 밀도 구배 배지가있는 튜브를 45 ° 각도로 잡고 혈청 학적 피펫 팁을 50 mL 원심분리 튜브의 안쪽에 놓습니다. 혈청학적 피펫으로부터 희석된 혈액 25 mL를 천천히 방출한다.
   8. 희석 된 혈액과 밀도 구배 배지가 혼합되지 않았는지 확인하십시오. 희석 된 혈액이 밀도 구배 배지 위에 놓여 있는지 확인하십시오.
   9. 희석 된 모든 혈액이 처리 될 때까지 후속 밀도 구배 배지 튜브로 이것을 반복하십시오.
   10. 튜브를 1000 x g 에서 30분 동안 원심분리기와 원심분리기로 조심스럽게 이동시키고 실온에서 스윙아웃 로터(RT)로 옮깁니다. 가속과 브레이크가 최소한인지 확인하십시오.
       참고 : 원심 분리 후 다양한 층이 표시되어야합니다. 상단의 투명한 분홍색에서 주황색까지의 층은 혈장과 혈소판으로 구성됩니다. 중간 백색 층은 PBMCs와 밀도 구배 매체로 구성된 명확한 층으로 구성되고, 마지막으로 적혈구가있는 바닥에 진한 적색 층으로 구성됩니다.
   11. 멸균된 파스퇴르 피펫을 사용하여, PBMC 함유 백색 층을 50 mL 원심분리 튜브에 조심스럽게 흡인시킨다.
       참고: 밀도 구배 매체를 전송하면 다운스트림 정화에 영향을 미치므로 전송하지 마십시오. 과도한 플라즈마는 결과에 영향을 미치지 않습니다.
   12. 수집된 모든 PBMC를 동일한 50 mL 원심분리 튜브에 풀링하고 RPMI 1640으로 최대 50 mL를 충전한다.
   13. 세포를 RT에서 5분 동안 500 x g 에서 원심분리한다(달리 명시되지 않는 한 이 설정에서 나머지 원심분리 단계를 수행함).
   14. 상청액을 흡인하고 세포를 RPMI 1640의 30 mL에 재현탁시킨다. 혈구측정기 또는 자동화된 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수하십시오.
   15. 냉동 보존을 위해, 동결 배지 1 mL당 최대 3천만 개의 세포를 재현탁한다.
   16. 세포를 냉동 튜브로 옮기고 속도 조절된 냉동 용기(분당 -1°C)를 사용하여 -80°C가 될 때까지 동결시킨다. 장기간 보관하려면 PBMC를 -140°C로 옮깁니다.
       참고: 셀이 RT에서 동결 배지에 있는 시간을 제한하십시오. RT에서 DMSO는 세포에 매우 독성이 있습니다.

2. 활성화된 인간 일차 T 림프구의 배양

1. 세포의 해동 (1 일째)
   1. 샘플 당 RPMI 1640 mL를 약 37°C로 미리 가온한다.
   2. 원하는 수의 세포 앰플을 가져 와서 드라이 아이스에 임시로 보관하십시오.
   3. 동결된 세포를 10 mL의 미리 가온된 RPMI 1640에 재현탁시킨다.
   4. 세포를 RT에서 500 x g 에서 5분 동안 원심분리한다.
   5. 상층액을 버리고 2.1.4에 기재된 바와 같이 RPMI 1640 및 원심분리기 10 mL에 재현탁하여 세포를 다시 세척한다.
   6. 상청액을 버리고 X-VIVO 15 배지 + 5% 인간 혈청 mL당 2 x ¹⁰⁶ 세포에서 세포를 재현탁시킨다 (이하: T 세포 배지).
   7. 세포를 웰 당 2 mL의 플레이트를 24-웰 세포 배양 플레이트에서 플레이트하고, 37°C 및 5% _CO2에서 밤새 인큐베이션한다.
2. 세포의 활성화 (Day 0)
   1. 1백만 세포당 12.5μL의 비드를 마이크로원심분리 튜브로 옮겨 CD3/CD28 비드를 세척한다. 비드 12.5 μL 당 PBS 12.5 μL를 첨가한다.
      참고 : 사용하기 전에 구슬의 바이알을 와류하는 것이 중요합니다.
   2. 마이크로원심분리 튜브를 1분 동안 적합한 자석 상에 놓는다.
   3. 완충액을 버리고, 비드를 T 세포 배지의 원래 부피 (비드의 원래 부피의 12.5 μL 당 12.5 μL의 T 세포 배지)에 재현탁시킨다.
   4. 1:2의 비율에 해당하는 세포 백만 개당 12.5 μL의 비드를 첨가한다(비드: 세포).
   5. 세포를 각각 약 5 백만 개의 세포가있는 두 가지 조건으로 나눕니다.
   6. 표 1에 언급된 바와 같은 조건에 정확한 부피의 사이토카인을 첨가한다.
   7. 세포를 37°C 및 5% _CO2에서 3일 동안 인큐베이션한다.
3. 세포 배양 (3 일과 5 일째)
   1. 세포를 재현탁시키고 각 웰에서 부피의 절반을 새로운 웰로 옮겨 세포를 나눕니다. 동일한 부피의 신선한 T 세포 배지를 각 웰에 첨가한다.
   2. 표 1에 언급된 바와 같이 각 조건에 새로운 사이토카인을 첨가한다.

3. 세포외 플럭스 분석

1. 센서 카트리지의 수화(0일차)
   1. 센서 카트리지의 포장을 풀고 유틸리티 플레이트에서 센서 카트리지를 조심스럽게 분리합니다.
   2. 센서 카트리지를 거꾸로 놓고 센서 프로브에 닿지 않도록 주의하십시오.
   3. 유틸리티 플레이트에 200μL의 교정제를 채우고(자세한 내용은 재료 표 참조) 센서 카트리지를 유틸리티 플레이트에 다시 조심스럽게 교체합니다.
   4. 대안적으로, 임의의 기포 형성을 제거하기 위해, 센서 카트리지를 밤새 멸균된 초순수에서 인큐베이션하고, 분석의 아침에 미리 예열된 교정제로 교체한다.
   5. 센서 카트리지 플레이트를 37°C에서 하룻밤 동안 _CO2 조절되지 않은 가열 캐비닛에서 인큐베이션합니다.
      참고: 과도한 _CO2 가 센서 카트리지에 영향을 미치므로 _CO2 규제가 적용되지 않는 캐비닛을 사용하는 것이 매우 중요합니다. Flux 분석기(자세한 내용은 재료 표 참조)가 37°C까지 예열되도록 사용 최소 하루 전에 켜져 있는지 확인하십시오.
2. 세포 코팅 및 미토콘드리아 억제제의 제조 (Day 1)
   1. NaHCO3 (pH _8.3, 0.1 M, 1128 μL), Cell-Tak (1 mg/mL, 48 μL) 및 NaOH (1.0 M, 24 μL)를 함유하는 코팅 용액 (표 참조)을 준비한다.
      참고 : 코팅 용액은 항상 신선하게 만들고 사용해야합니다.
   2. 신선한 XF 세포 배양 플레이트를 열고 새로 제조된 코팅 용액 12 μL를 각 웰에 첨가한다. 모든 웰의 바닥에 코팅 용액의 균일 한 분포를 보장하십시오.
   3. 뚜껑을 켠 상태에서 플레이트를 RT에서 30분 동안 인큐베이션하고 나머지 액체 용액을 모든 웰에서 버립니다.
   4. 플레이트를 멸균수 200 μL로 세척하고 액체를 버린다.
   5. 플레이트를 200 μL의 세포 배양 등급 멸균 PBS로 세척하고 액체를 버린다.
   6. 플레이트를 RT에 두고 적어도 30분 동안 건조시키십시오.
3. XF 세포 배양 플레이트 내의 플레이트 T 세포 (제1일)
   1. 실험 설정에 따라 적합한 XF RPMI 배지와 글루코스, 피루베이트 및 글루타민을 혼합하여 50mL의 분석 배지를 제조하였다(권장 수준: 4mM 글루코스, 1mM 피루베이트 및 3mM 글루타민).
   2. CO2 조절되지 않은 인큐베이터에서 37°C로 가열하고 pH를 7.4로 설정합니다. 세포를 도금하고 올리고마이신 및 FCCP 용액을 준비하기에 충분한 배지가 있는지 확인하십시오 (3.4 절).
   3. 최적화 실행 또는 분석 실행을 위해 웰당 셀 수가 증가함에 따라 플레이트 레이아웃을 설계합니다. 배경 측정을 위해 미디어로 채워지고 미디어로 주입 된 4 개의 웰을 사용하십시오.
   4. 섹션 2.3에서 제조된 T 세포를 계수하고(바람직한 방법에 의해) 플레이트 레이아웃에 따라 코팅 용액으로 코팅된 XF 세포 배양 플레이트의 각 웰에 정확한 수의 세포를 피펫한다.
      참고: 각 웰의 최종 부피는 다를 수 있지만 우물 바닥을 덮기에 충분해야 합니다.
   5. XF 세포 배양 플레이트를 10분 동안 RT에서 1000 x g 에서 원심분리하여 T 세포를 코팅된 표면에 부착시킨다.
   6. 세포를 200 μL의 분석 배지로 세척하고, 배지를 버리고, 180 μL의 분석 배지를 첨가한다.
      참고: 거꾸로 된 광학 현미경을 사용하여 웰을 육안으로 검사하여 세포가 부착되어 웰 표면에 고르게 분포되어 있는지 확인하십시오.
   7. XF 세포 배양 플레이트를 _CO2 조절되지 않은 가열 캐비닛에서 30분 동안 인큐베이션하여 플레이트의 온도가 37°C가 되도록 한다.
4. 최적화를 위해 올리고마이신 및 FCCP로 센서 카트리지 로딩(1일차)
   참고: 올리고마이신 및 FCCP 농도가 이미 최적화되었다면 섹션 3.5에서 계속하십시오.
   1. 단계 3.4.2 및 3.4.3에 기재된 바와 같이 분석 매질에서 올리고마이신 및 FCCP의 작동 용액을 제조한다 (단계 3.3.1에서 제조됨).
   2. 올리고마이신 작동 용액: 5 μM 용액 (2 mL의 분석 매질 + 1 mM 올리고마이신 스톡의 10 μL) 및 3 μM 용액 (8 mL의 분석 배지 + 24 μL의 1 mM 올리고마이신 스톡)을 준비한다.
   3. FCCP 작업 용액: 2 μM 용액 (2 mL의 분석 배지 + 300 μM FCCP 스톡의 13.2 μL) 및 1.3 μM 용액 (8 ml의 분석 배지 + 300 μM FCCP 스톡의 34.6 μL)을 준비합니다.
   4. 올리고마이신 또는 FCCP의 작동 용액을 센서 카트리지의 주입 포트에 로드합니다(표 2).
      메모. 주입 포트에는 공기만 포함되지 않는 것이 중요합니다. 어떤 이유로든 모든 주입 포트가 사용되지 않는 경우, 빈 포트는 분석 매질로 채워져야 합니다.
   5. 테이블 위의 플레이트 가장자리를 부드럽게 노크하여 주입 포트의 잠재적 인 거품을 제거하십시오.
5. 어세이 실행을 위한 올리고마이신, FCCP 및 안티마이신 A가 있는 로딩 센서 카트리지 로딩(Day 1)
   1. 이전 최적화 실행에서 확인된 최적 농도에 따라 분석 매질(단계 3.3.1에서 제조됨)에서 올리고마이신, FCCP의 용액을 준비한다. 또한, 20 μM 안티마이신 A 용액을 제조하였다.
   2. 20μL의 올리고마이신 또는 FCCP를 플레이트 레이아웃에 따라 센서 카트리지의 주입 포트 A에 로드합니다. 22μL의 20μM 안티마이신 A를 모든 웰의 주입 포트 B에 첨가한다. 일단 웰에 주입된 항마이신 A의 결과적인 농도는 2 μM이 될 것이다.
6. Flux 분석기 소프트웨어에서 실험 프로토콜 설정.
   1. 플레이트 레이아웃당 각 조건에 대해 그룹 및 플레이트 맵을 지정합니다.
   2. 주입 전략에 따라 프로토콜을 설계한다(표 3 및 그림 1).
      참고: Assay 실행을 실행할 때 주입 C 및 D를 생략할 수 있습니다.
   3. 분석 설정을 저장하고 분석에 포함시키는 데 필요한 정보를 입력한 다음 시작을 누릅니다.
   4. 플럭스 분석기는 섹션 3.5에서 준비된 센서 카트리지를 요청합니다. 뚜껑을 분리하고 분석기의 지시에 따라 센서 카트리지를 삽입합니다.
      참고: 이 분석은 체크 표시로 표시된 센서를 교정하고 검사합니다. 성공적인 교정 후에, 분석기는 섹션 3.3에서 제조된 XF 세포 배양 플레이트를 요청할 것이다. 유틸리티 플레이트는 분석기로부터 분출되고 XF 세포 배양 플레이트로 대체되어 분석을 시작한다.

결과

OxPhos 특성의 올바른 결정은 T 세포를 연구 할 때 없어서는 안될 도구입니다. 그러나 분석 조건이 최적화되지 않은 경우 오해의 소지가 있거나 잘못된 결과가 발생할 위험이 큽니다. 이 프로토콜에서, 사용되는 올리고마이신 및 FCCP의 웰 당 세포 수 및 농도의 최적화에 강한 초점이 있다. 설명된 셋업에서, 올리고마이신 및 FCCP는 동일한 웰에 증분적으로 첨가되어, 미토콘드리아 조절제의 농도를 증?...

토론

산화 인산화의 상세하고 정확한 정량화는 T 세포의 에너지 상태를 설명 할 때 없어서는 안될 도구입니다. 미토콘드리아 적합성의 상태는 T 세포 활성화 잠재력, 생존 및 분화와 직접적으로 관련될 수 있다^1,5. 이러한 프로토콜을 이용하면, 산화적 인산화의 다양한 특성을 확인할 수 있다(자세한 설명은 표 4 참조). 산화 인산화의 이러한 특성?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well tissue culture plate	Nunc	142485
Anti-CD3xCD28 beads	Gibco	11161D
Antimycin A	Merck	A8674
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
Cell-Tak	Corning	354240	For coating
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	D9170
Human Serum	Sigma Aldrich	H4522	Heat inactivated at 56 °C for 30 min
IL-15	Peprotech	200-02
IL-2	Peprotech	200-15
Lymphoprep	Stemcell Technologies	07801
Oligomycin	Merck	O4876
PBS	Thermo Fisher	10010023
RPMI 1640	Gibco-Thermo Fisher	61870036
Seahorse Calibrant	Agilent Technologies	102416-100
Seahorse XF 1.0 M glucose solution	Agilent Technologies	103577-100
Seahorse XF 100 mM pytuvate solution	Agilent Technologies	103578-100
Seahorse XF 200 mM glutamine solution	Agilent Technologies	103579-100
Seahorse XF RPMI medium, pH7.4	Agilent Technologies	103576-100	XF RPMI media
Seahorse XFe96 Analyser	Agilent Technologies		Flux analyzer
Seahorse XFe96 cell culture microplates	Agilent Technologies	102416-100	XF cell culture plate
Seahorse XFe96 sensor cartridge	Agilent Technologies	102416-100
Sodium Bicarbonate concentrate 0.1 M (NaHCO3)	Sigma Aldrich	36486
Sodium Hydroxide solution 1 N (NaOH)	Sigma Aldrich	S2770-100ML
X-VIVO 15	Lonza	BE02-060F
T cell beads magnet DynaMag-2 Magnet	Thermo Fisher	12321D
Seahorse wave			Flux analyzer software