Surveillance en temps réel de la respiration mitochondriale dans les cellules T primaires humaines différenciées par cytokines

Résumé

L’adaptation métabolique est fondamentale pour les lymphocytes T car elle dicte la différenciation, la persistance et la cytotoxicité. Ici, un protocole optimisé pour surveiller la respiration mitochondriale dans les cellules T primaires humaines différenciées par cytokines ex vivo est présenté.

Résumé

Lors de l’activation, le métabolisme des lymphocytes T s’adapte aux changements qui ont un impact sur leur devenir. Une augmentation de la phosphorylation oxydative mitochondriale est indispensable pour l’activation des lymphocytes T, et la survie des lymphocytes T mémoire dépend du remodelage mitochondrial. Par conséquent, cela affecte le résultat clinique à long terme des immunothérapies anticancéreuses. Les changements dans la qualité des lymphocytes T sont souvent étudiés par cytométrie en flux à l’aide de marqueurs de surface bien connus et non directement par leur état métabolique. Il s’agit d’un protocole optimisé pour mesurer la respiration mitochondriale en temps réel des cellules T humaines primaires à l’aide d’un analyseur de flux extracellulaire et des cytokines IL-2 et IL-15, qui affectent différemment le métabolisme des cellules T. Il est démontré que l’état métabolique des lymphocytes T peut être clairement distingué en mesurant la consommation d’oxygène lors de l’inhibition de complexes clés dans la voie métabolique et que la précision de ces mesures dépend fortement de la concentration optimale d’inhibiteurs et de la stratégie d’injection d’inhibiteurs. Ce protocole normalisé aidera à mettre en œuvre la respiration mitochondriale en tant que norme pour l’aptitude des lymphocytes T dans la surveillance et l’étude des immunothérapies contre le cancer.

Introduction

Le développement et la fonction corrects des lymphocytes T sont essentiels à la capacité du système immunitaire à reconnaître les antigènes et à y répondre. La phosphorylation oxydative mitochondriale (OxPhos) change en fonction de l’état de la cellule T. Les lymphocytes T naïfs utilisent principalement OxPhos pour produire de l’ATP, tandis que les lymphocytes T activés subissent une transition métabolique où la glycolyse devient ^dominante1. Après la phase effectrice, le petit sous-ensemble restant de lymphocytes T mémoire revient à un état métabolique dominé par ^OxPhos2,3. Les changements d’OxPhos suivent la différenciation des lymphocytes T à un tel degré que même des sous-ensembles de lymphocytes T peuvent être différenciés par leurs propriétés spécifiques d’OxPhos1. Inversement, OxPhos est important pour le fonctionnement des lymphocytes T, et il a été démontré que l’inhibition d’OxPhos bloque la prolifération et la production de cytokines des lymphocytes ^T4. Par conséquent, la capacité de quantifier les propriétés des lymphocytes T OxPhos de manière précise et reproductible est un outil puissant pour quiconque travaille avec des lymphocytes T.

Dans ce protocole, les propriétés des lymphocytes T OxPhos sont mesurées à l’aide d’un analyseur de flux extracellulaire. La fonction principale de cet analyseur est de mesurer en continu la teneur en oxygène des milieux de croissance des cellules à analyser. L’oxygène retiré du milieu de croissance est supposé être absorbé par les cellules. En traitant les cellules avec une variété d’inhibiteurs ou de modificateurs d’OxPhos, une baisse de l’absorption d’oxygène est associée à la fonction inhibée ou modulée. Par exemple, l’inhibition de l’ATP synthase entraînera une réduction de l’absorption cellulaire de l’oxygène qui serait autrement utilisé pour produire de l’ATP par phosphorylation oxydative. D’autres équipements, y compris l’électrode Clark et l’instrument Oroboros, offrent des fonctionnalités similaires, et chaque instrument présente des avantages et des inconvénients différents. Un large éventail de types de cellules peut être utilisé pour des études dans ces dispositifs, mais un type de cellule particulièrement difficile est les lymphocytes T primaires ^humains5. En raison de leur petite taille, de leur faible survie ex vivo et de leurs propriétés non adhérentes, les cellules T primaires humaines peuvent être difficiles à étudier.

Il s’agit d’un protocole pour étudier la respiration mitochondriale des cellules T primaires humaines par un analyseur extracellulaire. Le protocole est divisé en une série d’optimisation, où les concentrations optimales du nombre de cellules par puits, ainsi que la concentration optimale d’olligomycine et de FCCP, sont déterminées. En outre, une exécution d’essai, où les conditions optimisées sont utilisées.

En utilisant des PBMC humains d’origine sanguine et des cultures de lymphocytes T primaires ex vivo , ce protocole démontre l’importance d’une concentration optimale d’inhibiteurs et la pertinence d’utiliser une injection séparée au lieu d’une injection séquentielle d’inhibiteurs mitochondriaux lorsque vous travaillez avec des types de cellules sensibles. Enfin, il est démontré que ce test peut détecter de manière robuste des différences subtiles dans la respiration mitochondriale lors de la polarisation avec les cytokines IL-2 et IL-15.

Protocole

Les expériences ont été menées selon les directives de l’hôpital Herlev et de la région de la capitale du Danemark.

Remarque : Ce protocole contient des instructions pour une exécution d’optimisation et une exécution de tests. Il est clairement écrit dans le texte lorsque les instructions concernent une exécution d’optimisation ou une exécution de test. Exécuter une exécution d’optimisation avant de poursuivre les exécutions d’assay

1. Isolement mononucléaire du sang périphérique humain (PBMC) des pelages bouffants

1. Isolation PBMC
   1. Prélever les manteaux bouffants de l’établissement approprié (recueillis dans des poches de collecte de sang). Les manteaux Buffy proviennent de donneurs sains. Exclure les donneurs qui ont récemment utilisé des analgésiques.
   2. Vaporisez la poche de prélèvement sanguin contenant le manteau bouffant avec de l’éthanol à 70% avant de la transférer dans une armoire à flux laminaire. Utilisez toujours des techniques stériles et du matériel stérile pour toutes les étapes
      REMARQUE : S’assurer que les autorisations correctes pour la manipulation des échantillons de sang humain sont obtenues.
   3. Transférer le sang dans un tube de centrifugeuse stérile de 50 mL.
   4. Diluer le sang au moins 10% avec RPMI 1640 non supplémenté.
   5. Versez 20 mL du milieu de gradient de densité préféré dans un tube de centrifugeuse de 50 mL.
   6. Aspirer 25 mL du sang dilué dans une pipette sérologique. Réglez le contrôleur de pipette électrique à la vitesse la plus basse.
   7. Maintenez le tube avec un milieu de gradient de densité à un angle de 45° et posez la pointe de la pipette sérologique sur la face interne du tube de centrifugeuse de 50 mL. Libérer lentement 25 mL de sang dilué de la pipette sérologique.
   8. Assurez-vous que le sang dilué et le milieu de gradient de densité ne se mélangent pas. Assurez-vous que le sang dilué repose sur le milieu de gradient de densité.
   9. Répétez cette opération avec les tubes de milieu à gradient de densité suivants jusqu’à ce que tout le sang dilué soit traité.
   10. Déplacez soigneusement les tubes vers une centrifugeuse et centrifugez à 1000 x g pendant 30 min dans un rotor oscillant à température ambiante (RT). Assurez-vous que l’accélération et la pause sont au minimum.
       REMARQUE: Après la centrifugation, différentes couches doivent être visibles. La couche supérieure, rose à orange claire, se compose du plasma sanguin et des plaquettes. La couche blanche moyenne se compose des PBMC suivis d’une couche claire qui se compose du milieu de gradient de densité, et enfin d’une couche rouge foncé au fond avec des globules rouges.
   11. À l’aide d’une pipette Pasteur stérile, aspirer soigneusement la couche blanche contenant du PBMC dans un tube de centrifugeuse de 50 mL.
       REMARQUE: Assurez-vous de ne pas transférer le milieu de gradient de densité car cela affectera la purification en aval. L’excès de plasma n’affectera pas les résultats.
   12. Regroupez tous les PBMC collectés dans le même tube de centrifugeuse de 50 mL et rechargez jusqu’à 50 mL avec RPMI 1640.
   13. Centrifugez les cellules à 500 x g pendant 5 min à TA (effectuez les étapes de centrifugation restantes à ce réglage, sauf indication contraire).
   14. Aspirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 30 mL de RPMI 1640. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur cellulaire automatisé.
   15. Pour la cryoconservation, remettre en suspension un maximum de 30 millions de cellules par 1 mL de milieu de congélation.
   16. Transférer les cellules dans des cryotubes et congeler jusqu’à -80 °C à l’aide d’un récipient de congélation à vitesse contrôlée (-1 °C par minute). Pour un stockage à long terme, déplacez les PBMC à -140 °C.
       REMARQUE: Limitez la durée pendant laquelle les cellules sont dans le milieu de congélation à RT. À RT, le DMSO est très toxique pour les cellules.

2. Culture de lymphocytes T primaires humains activés

1. Décongélation des cellules (Jour 1)
   1. Préchauffer 10 mL de RPMI 1640 par échantillon à environ 37 °C.
   2. Prenez le nombre souhaité d’ampoules cellulaires et stockez-les temporairement sur de la glace carbonique.
   3. Remettre en suspension les cellules congelées dans 10 mL de RPMI 1640 préchauffé.
   4. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 500 x g à TA.
   5. Jeter le surnageant et laver à nouveau les cellules en les remettant en suspension dans 10 mL de RPMI 1640 et en centrifugeuse comme décrit au point 2.1.4.
   6. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules à 2 x ¹⁰⁶ cellules par mL de milieu X-VIVO 15 + 5% de sérum humain (ci-après : milieu cellulaire T).
   7. Plaque 2 mL des cellules par puits dans une plaque de culture cellulaire de 24 puits et incuber pendant la nuit à 37 °C et 5 % de _CO2.
2. Activation des cellules (Jour 0)
   1. Laver les billes CD3/CD28 en transférant 12,5 μL de billes par 1 million de cellules dans un tube de microcentrifugation. Ajouter 12,5 μL de PBS par 12,5 μL de billes.
      REMARQUE: Il est important de vortexer le flacon de perles avant utilisation.
   2. Placez le tube de microcentrifugation sur un aimant approprié pendant 1 min.
   3. Jeter le tampon et remettre les billes en suspension dans le volume d’origine du milieu cellulaire T (12,5 μL de milieu cellulaire T pour 12,5 μL du volume original de perles).
   4. Ajouter 12,5 μL de billes par million de cellules correspondant à un rapport de 1:2 (perles : cellules).
   5. Divisez les cellules en deux conditions avec environ 5 millions de cellules dans chacune.
   6. Ajouter le volume correct de cytokines aux conditions mentionnées dans le tableau 1.
   7. Incuber les cellules pendant 3 jours à 37 °C et 5 % de _CO2.
3. Culture de cellules (Jours 3 et 5)
   1. Resuspendez les cellules et divisez-les en transférant la moitié du volume de chaque puits dans un nouveau puits. Ajouter le même volume de milieu cellulaire T frais à chaque puits.
   2. Ajouter de nouvelles cytokines à chaque condition comme mentionné dans le tableau 1.

3. Test de flux extracellulaire

1. Hydratation de la cartouche du capteur (Jour 0)
   1. Déballez la cartouche du capteur et retirez-la soigneusement de la plaque de l’utilitaire.
   2. Placez la cartouche du capteur à l’envers, en prenant soin de ne pas toucher les sondes du capteur.
   3. Remplissez la plaque utilitaire avec 200 μL d’étrier (voir la table des matériaux pour plus de détails) et replacez soigneusement la cartouche du capteur dans la plaque utilitaire.
   4. Alternativement, pour éliminer toute formation de bulles, incuber la cartouche du capteur dans de l’eau ultrapure stérile pendant la nuit et remplacez-la par un calibrant préchauffé le matin du test.
   5. Incuber la plaque de la cartouche du capteur à 37 °C dans une armoire chauffante non régulée au _CO2 pendant la nuit.
      REMARQUE: Il est très important d’utiliser une armoire non régulée en _CO2 car un excès de _CO2 influencera la cartouche du capteur. Assurez-vous que l’analyseur de flux (voir tableau des matériaux pour plus de détails) est allumé au moins un jour avant utilisation pour lui permettre de se réchauffer à 37 °C.
2. Revêtement cellulaire et préparation d’inhibiteurs mitochondriaux (Jour 1)
   1. Préparer une solution de revêtement (voir tableau des matériaux) contenant du NaHCO3 (pH 8,3, 0,1 M, 1128 μL), du Cell-Tak (1 mg/mL, 48 μL) et du NaOH (1,0 M, 24 μL).
      REMARQUE: La solution de revêtement doit toujours être faite et utilisée fraîche.
   2. Ouvrez une plaque de culture cellulaire XF fraîche et ajoutez 12 μL de la solution de revêtement fraîchement préparée à chaque puits. Assurer une distribution uniforme de la solution de revêtement dans le fond de tous les puits.
   3. Incuber la plaque à RT avec le couvercle pendant 30 min et jeter la solution liquide restante de tous les puits.
   4. Lavez la plaque avec 200 μL d’eau stérile et jetez le liquide.
   5. Lavez la plaque avec 200 μL de PBS stérile de qualité de culture cellulaire et jetez le liquide.
   6. Laissez la plaque à TA et laissez-la sécher pendant au moins 30 min.
3. Cellules T de la plaque dans la plaque de culture cellulaire XF (Jour 1)
   1. Préparer 50 mL de milieux d’essai en mélangeant des milieux XF RPMI appropriés avec du glucose, du pyruvate et de la glutamine selon la configuration expérimentale (niveaux recommandés : 4 mM de glucose, 1 mM de pyruvate et 3 mM de glutamine).
   2. Chauffer à 37 °C dans un incubateur _non corégulé et fixer le pH à 7,4. S’assurer qu’il y a suffisamment de milieu pour le placage des cellules et la préparation des solutions d’oligomycine et de FCCP (rubrique 3.4).
   3. Concevez une disposition de plaque avec un nombre croissant de cellules par puits pour l’exécution de l’optimisation ou de l’essai. Utilisez quatre puits 4, remplis de milieux et injectés de milieux, pour les mesures de fond.
   4. Compter les lymphocytes T préparés à la section 2.3 (selon la méthode préférée) et pipeter le nombre correct de cellules dans chaque puits de la plaque de culture cellulaire XF recouverte de la solution de revêtement, selon la disposition de la plaque.
      REMARQUE: Le volume final de chaque puits peut varier, mais doit être suffisant pour couvrir le fond du puits.
   5. Centrifugez la plaque de culture cellulaire XF à 1000 x g à RT pendant 10 min pour faire adhérer la cellule T à la surface revêtue.
   6. Lavez les cellules avec 200 μL de milieu d’essai, jetez-les et ajoutez 180 μL de milieu d’essai.
      REMARQUE: Inspectez visuellement les puits à l’aide d’un microscope à lumière inversée pour vous assurer que les cellules sont attachées et réparties uniformément sur la surface du puits.
   7. Incuber la plaque de culture cellulaire XF dans l’armoire chauffante non régulée au _CO2 pendant 30 minutes pour s’assurer que la température de la plaque est de 37 °C.
4. Chargement de la cartouche de capteur avec oligomycine et FCCP pour l’optimisation (Jour 1)
   REMARQUE : Si les concentrations d’oligomycine et de FCCP étaient déjà optimisées, continuer à la rubrique 3.5.
   1. Préparer des solutions de travail d’oligomycine et de FCCP dans des milieux d’essai (préparés à l’étape 3.3.1) comme décrit aux étapes 3.4.2 et 3.4.3.
   2. Solutions de travail à l’oligomycine : préparer une solution de 5 μM (2 mL de milieu d’essai + 10 μL de 1 mM de stock d’oligomycine) et une solution de 3 μM (8 mL de milieu d’essai + 24 μL de 1 mM de stock d’oligomycine).
   3. Solution de travail FCCP : Préparer une solution de 2 μM (2 mL de milieu d’essai + 13,2 μL de 300 μM de papier FCCP) et une solution de 1,3 μM (8 ml de milieu d’essai + 34,6 μL de 300 μM de papier FCCP)
   4. Chargez les solutions de travail d’oligomycine ou de FCCP dans les orifices d’injection de la cartouche du capteur (tableau 2).
      NOTE. Il est important qu’aucun orifice d’injection ne contienne uniquement de l’air. Si, pour une raison quelconque, tous les ports d’injection ne sont pas utilisés, les ports vides doivent être remplis de supports de dosage.
   5. Frappez doucement les bords de la plaque sur la table pour éliminer les bulles potentielles dans les orifices d’injection.
5. Cartouche de capteur de chargement avec oligomycine, FCCP et antimycine A pour l’exécution du test (Jour 1)
   1. Préparer des solutions d’oligomycine, FCCP dans des milieux d’essai (préparés à l’étape 3.3.1) en fonction des concentrations optimales identifiées lors d’une précédente exécution d’optimisation. Préparez également une solution d’antimycine A de 20 μM.
   2. Chargez 20 μL d’oligomycine ou de FCCP dans l’orifice d’injection A de la cartouche du capteur selon la disposition de la plaque. Ajouter 22 μL de 20 μM d’antimycine A au port d’injection B de tous les puits. La concentration résultante d’antimycine A une fois injectée dans le puits sera de 2 μM.
6. Configuration d’un protocole expérimental dans le logiciel d’analyse de flux.
   1. Affectez les groupes et la carte de plaque pour chaque condition par disposition de plaque.
   2. Concevoir le protocole en fonction de la stratégie d’injection (tableau 3 et figure 1).
      REMARQUE: Lors de l’exécution d’Assay, les injections C et D peuvent être omises.
   3. Enregistrez la configuration du test, remplissez les informations requises pour être inclus pour le test et appuyez sur Démarrer.
   4. L’analyseur de flux demandera la cartouche de capteur préparée à la section 3.5. Retirez le couvercle et insérez la cartouche du capteur selon les instructions de l’analyseur.
      REMARQUE: Le test étalonnera et vérifiera les capteurs indiqués par des coches. Après un étalonnage réussi, l’analyseur demandera la plaque de culture cellulaire XF préparée à la section 3.3. La plaque utilitaire est éjectée de l’analyseur et remplacée par la plaque de culture cellulaire XF pour démarrer le test.

Résultats

Une détermination correcte des propriétés d’OxPhos est un outil indispensable lors de l’étude des lymphocytes T. Toutefois, si les conditions d’essai n’ont pas été optimisées, il existe un risque important de résultats trompeurs ou erronés. Dans ce protocole, l’accent est mis sur l’optimisation du nombre de cellules par puits et des concentrations d’oligomycine et de FCCP à utiliser. Dans la configuration décrite, l’oligomycine et le FCCP sont ajoutés progressivement au même puits, ce qui aug...

Discussion

La quantification détaillée et correcte de la phosphorylation oxydative est un outil indispensable pour décrire les états énergétiques des lymphocytes T. L’état de la condition mitochondriale peut être directement lié au potentiel d’activation, à la survie et à la différenciation des lymphocytes ^T1,5. Avec ce protocole, il est possible de déterminer les différentes propriétés de la phosphorylation oxydative (voir tableau 4 pou...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well tissue culture plate	Nunc	142485
Anti-CD3xCD28 beads	Gibco	11161D
Antimycin A	Merck	A8674
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
Cell-Tak	Corning	354240	For coating
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	D9170
Human Serum	Sigma Aldrich	H4522	Heat inactivated at 56 °C for 30 min
IL-15	Peprotech	200-02
IL-2	Peprotech	200-15
Lymphoprep	Stemcell Technologies	07801
Oligomycin	Merck	O4876
PBS	Thermo Fisher	10010023
RPMI 1640	Gibco-Thermo Fisher	61870036
Seahorse Calibrant	Agilent Technologies	102416-100
Seahorse XF 1.0 M glucose solution	Agilent Technologies	103577-100
Seahorse XF 100 mM pytuvate solution	Agilent Technologies	103578-100
Seahorse XF 200 mM glutamine solution	Agilent Technologies	103579-100
Seahorse XF RPMI medium, pH7.4	Agilent Technologies	103576-100	XF RPMI media
Seahorse XFe96 Analyser	Agilent Technologies		Flux analyzer
Seahorse XFe96 cell culture microplates	Agilent Technologies	102416-100	XF cell culture plate
Seahorse XFe96 sensor cartridge	Agilent Technologies	102416-100
Sodium Bicarbonate concentrate 0.1 M (NaHCO3)	Sigma Aldrich	36486
Sodium Hydroxide solution 1 N (NaOH)	Sigma Aldrich	S2770-100ML
X-VIVO 15	Lonza	BE02-060F
T cell beads magnet DynaMag-2 Magnet	Thermo Fisher	12321D
Seahorse wave			Flux analyzer software