في أوفو تغذية بيض اللاحم التجاري: طريقة دقيقة وقابلة للتكرار للتأثير على نمو العضلات ونموها

Summary

تم تطوير منهجية قوية لإجراء تجارب أبحاث التغذية في البوفوات باستخدام بيض اللاحم التجاري غير المحتضن لاختبار قدرة المركبات الطبيعية والاصطناعية ، في هذه الحالة ، نيكوتيناميد ريبوسيد ، على التأثير على نمو العضلات ونموها.

Abstract

خلال العقود الثلاثة الماضية، ركز علماء اللحوم الحمراء والدواجن على تطوير استراتيجيات وتقنيات للتعامل مع نمو العضلات أثناء النمو الجنيني والجنيني. لا تزال هذه المنطقة منطقة تركيز لأن عدد ألياف العضلات يتم إنشاؤه خلال هذا الوقت ويحدد الأساس لجميع النمو المستقبلي. في الدواجن ، أظهرت العديد من الدراسات في التغذية البيضوية لعوامل النمو أو الفيتامينات أو العناصر الغذائية الأخرى تحسين العضلات الجنينية للكتكوت وتطور الأمعاء. يمكن أن يفيد التحسن في تطوير عضلات البيض صناعة الدواجن من خلال التأثير المحتمل على غلة اللحوم أو معدل النمو أو حالات الاعتلال العضلي. خلال السنوات الخمس الماضية ، طور مختبر غونزاليس في جامعة جورجيا ريبوسيد نيكوتيناميد في منهجية تغذية البوفو لأجنة الدجاج اللاحم ، مما غير نمو العضلات. عند حقنه في كيس صفار الجنين النامي ، زاد نيكوتيناميد ريبوسيد من وزن العضلات الصدرية الرئيسية وكثافة الألياف العضلية عند الفقس. سيوضح هذا البروتوكول منهجية لإجراء دراسات تغذية البويضة بدقة وتكرار باستخدام أجنة دجاج التسمين ذات المعايير التجارية وعالية الغلة. ستسمح هذه البيانات والأساليب لمجموعات بحثية أخرى بإجراء دراسات تغذية بويضية بنجاح كبير وقابلية للتكرار.

Introduction

منذ عام 1960، ارتفع نصيب الفرد من استهلاك الولايات المتحدة من اللحوم من الدواجن بمعدل مذهل، في حين ظلت مصادر البروتين الأولية الأخرى راكدة أو منخفضة أو زادت إلى الحد الأدنى. استثمرت صناعة الدواجن وقتا طويلا وجهودا بحثية لتحسين التغذية وعلم الوراثة لإنتاج طائر فعال لمواكبة الطلب. نظرا لأن الهدف الرئيسي لصناعة الدواجن هو إنتاج العضلات لتحويلها إلى لحوم ، فقد غيرت جهودهم بشكل كبير كتلة العضلات النهائية للطيور عند الحصاد.

مثل معظم الأنواع ، تطور الدواجن العضلات بطريقة ثنائية الطور. يستخدم تكوين العضلات الأولي الخلايا الجذعية الوسيطة لإنتاج ألياف العضلات الأولية ، والتي تعمل كسقالة للموجة الثانية من تطور ألياف العضلات¹. في الدواجن ، يحدث تكوين العضلات الأولي خلال الأيام الجنينية من 3 إلى 8 ، ويحدث تكوين العضلات الثانوي من الأيام 8 إلى 21². بمجرد تطويرها ، تعمل ألياف العضلات الأولية والثانوية كأساس لجميع نمو العضلات في المستقبل من خلال التضخم الخلوي. لذلك ، بذل العلماء والصناعة جهدا كبيرا في محاولة للتلاعب بتكوين العضلات الأولي والثانوي في جميع الأنواع المنتجة للحوم لزيادة إنتاجية اللحوم إلى أقصى حد.

تتضمن إحدى التقنيات التي تم استكشافها في الدواجن ، والتي تسمى التغذية البيضوية ، مركبات التغذية من خلال الحقن. في تغذية البويضة ، وهي تقنية تستخدمها صناعة الدواجن منذ ما يقرب من 40 عاما ، تم تطويرها في البداية لإدارة اللقاح³. توثق الأدبيات أنه في تغذية البيض من المركبات والمواد المغذية المختلفة في فترات ومواقع النمو المختلفة داخل البويضة أثرت بشكل إيجابي في نمو العضلات البيضاء ^{ونموها 4}،^5،6. حتى الآن ، يعد مختبر غونزاليس في جامعة جورجيا رائدا في استخدام نيكوتيناميد ريبوسيد في تغذية البوفوضة لمعالجة نمو عضلات الدواجن.

نيكوتيناميد ريبوسيد ، وهو نظير البيريدين والنيوكليوسيد من فيتامين B3 ، ينتج NAD + من خلال مسار الإنقاذ⁷. نظرا لأن هذا المسار يستخدم خطوات إنزيمية أقل لإنتاج NAD + ، فإن الإنتاج هو الأكثر كفاءة⁸. أظهر غونزاليس وجاكسون⁹ أن مكملات تطوير كيس صفار الأجنة اللاحم مع ريبوسيد نيكوتيناميد زادت من وزن العضلات الرئيسية للكتكوت الصدري وكثافة الألياف العضلية . تم تأكيد ذلك لاحقا من قبل Xu et ^al.10 ، الذي وجد أن زيادة جرعة ريبوسيد نيكوتيناميد زادت من وزن العضلات وزادت من كثافة الألياف العضلية. أجريت هاتان الدراستان الأوليان في دجاج التسمين التجاري. نظرا لأن دجاج التسمين عالي الغلة يمتلك إمكانات وراثية أكثر أهمية لحجم كتلة العضلات النهائي ، كان هدف الدراسة هو تحديد آثار جرعة ريبوسيد نيكوتيناميد على الفرخ الصدري عالي الغلة ، فإن نمو العضلات الرئيسية ونموها عند الفقس.

Protocol

تمت الموافقة على جميع المنهجيات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات بجامعة جورجيا.

1. حضانة البيض وإدارة العلاج

1. شراء البيض وتعيين العلاج
   1. الحصول على بيض دجاج التسمين عالي الغلة غير المحتضن والمخصب ونقله إلى المختبر.
   2. فحص والتخلص من البيض الذي يعتبر رديئا الجودة.
      ملاحظة: تخلص من البيض المشوه (مستدير ، ممدود ، على جانب البلاطة) ، متصدع ، قذر / ملطخ ، رقيق القشرة ، ومجعد. هذا مهم لتقليل خطر البيض الفاسد.
   3. قم بتعيين أرقام البيض الفردية ووزنها وتسجيل أرقام البيض وأوزانها في برنامج جداول البيانات.
   4. استخدم برنامج جداول البيانات لفرز البيض حسب الوزن.
      1. تسليط الضوء على عدد البيض وأعمدة وزن البيض .
      2. حدد علامة التبويب بيانات ، ثم فرز - فرز البيانات حسب وزن البيضة من الأصغر إلى الأكبر.
         ملاحظة: للحصول على أفضل معدل تفريخ ، استخدم البيض الذي يتراوح وزنه بين 40 و 70 جم.
      3. بناء على تصميم التجربة ، قم بتعيين البيض (عدديا أو أبجديا) علاجا بالحقن ويوم القتل الرحيم. أدخل رقم العلاج ويوم القتل الرحيم في أعمدة منفصلة وقم بتعيين هذه العوامل عشوائيا داخل كل طبقة.
         ملاحظة: بالنسبة لهذا المنشور ، تم تعيين العلاجات بشكل عشوائي داخل كل طبقات من 8 بويضات.
   5. قم بإنشاء PivotTable داخل برنامج جداول البيانات للتأكد من أن كل علاج يمتلك أوزان بيض بداية مماثلة.
      1. قم بتمييز جميع البيانات داخل جدول البيانات المراد تحليلها.
      2. حدد الخيار PivotTable ضمن علامة التبويب إدراج .
      3. حدد المتغير المستقل (عمود يوم القتل الرحيم ) داخل النافذة الفرعية حقول PivotTable واسحب إلى حقل الصفوف .
      4. حدد المتغير المستقل (عمود العلاج ) داخل النافذة الفرعية B واسحب إلى حقل الصفوف ، ضمن يوم القتل الرحيم.
      5. حدد المتغير التابع للاهتمام (وزن البيضة) واسحبه إلى حقل القيم .
      6. قم بتغيير إعدادات حقل القيمة بالنقر فوق المتغير التابع وتحديد إعدادات حقل القيمة.
         1. قم بتغيير الإعداد إلى متوسط.
2. تعيين الدرج
   1. في برنامج جداول البيانات ، قم بتعيين البيض إلى صينية (عدديا أو أبجديا) ، بحيث يتم تمثيل العلاجات بالتساوي داخل الدرج.
      1. قم بتعيين البيض الأربعة الأولى مع العلاجات المخصصة للصينية 1. قم بتعيين البيض الأربعة التالي إلى الدرج 2 واستمر حتى يتم تعيين جميع البيض في صينية.
         ملاحظة: ستختلف هذه الخطوة حسب عدد الحاضنات والصواني المستخدمة في التجربة.
3. تأكد من تمثيل جميع العلاجات بالتساوي على صينية باستخدام وظيفة PivotTable .
   1. قم بتمييز جميع البيانات داخل جدول البيانات المراد تحليلها.
   2. حدد الخيار PivotTable ضمن علامة التبويب إدراج .
   3. حدد المتغير المستقل (عمود الدرج ) داخل النافذة الفرعية حقول PivotTable واسحب إلى حقل الصفوف .
   4. حدد المتغير التابع للاهتمام (وزن البيضة) واسحبه إلى حقل القيم .
   5. قم بتغيير إعدادات حقل القيمة بالنقر فوق المتغير التابع وتحديد إعدادات حقل القيمة.
      1. قم بتغيير الإعداد إلى حساب.
4. حضانة المرض
   1. ضع البيض في صينية الحضانة المناسبة له واحتضنه مسبقا على درجة حرارة 26.6 درجة مئوية مع رطوبة نسبية بنسبة 40٪ ± 4٪ لمدة 6 ساعات.
      ملاحظة: تحتوي بعض الحاضنات على أنظمة مراقبة ذاتية قد لا تكون دقيقة تماما. استخدم أجهزة مراقبة درجة الحرارة والرطوبة الأخرى للتحكم في الظروف.
   2. زيادة درجة حرارة الحاضنة إلى 37 درجة مئوية مع 40٪ ± 4٪ رطوبة نسبية والحفاظ على هذه الظروف حتى يوم الحضانة 18.
      1. لضمان درجة حرارة الحاضنة المناسبة، قم بقياس درجات حرارة سطح العديد من البيض في جميع أنحاء الحاضنة مرتين يوميا باستخدام ميزان حرارة سطحي حراري لضمان أن تكون درجات حرارة السطح 37 درجة مئوية.
   3. قم بتدوير البيض كل ساعة لتغيير موضعه.
   4. سجل أوزان البيض يوميا لضمان فقدان وزن البيض بنسبة 10٪ -12.5٪ خلال أول 18.5 يوما من الحضانة.
      ملاحظة: إذا لم يكن فقدان الوزن ضمن النطاق المطلوب، فقم بضبط (زيادة أو نقصان) الرطوبة.
5. يوم الحضانة -10 في حقن البويضة
   1. احسب كمية النيكوتيناميد ريبوسيد اللازمة لكل علاج باستخدام وزن الصيغة البالغ 290.07 جم / مول ، مع حقن 100 ميكرولتر من المحلول في كيس صفار البيض لكل بيضة.
      ملاحظة: سيتم استخدام محلول ملحي معقم (0.9٪) كمخفف لجميع المحاليل.
      الحساب: 50 بيضة × 100 ميكرولتر = 5000 ميكرولتر (5 مل) من المحلول المطلوب. قم بتقريب ما يصل إلى 6 مل لضمان توفر محلول كاف للحقن (الشكل 1).
      1. بمجرد صنع المحاليل ، ضعها في حمام مائي 37 درجة مئوية لإبقائها في درجة حرارة البيض.
   2. قم بإزالة البيض من الحاضنة صينية واحدة في كل مرة وقم بتغطيتها بمنشفة دافئة.
   3. شمعة البيض لتحديد موقع كيس صفار البيض وتنظيف منطقة الحقن مع 70 ٪ من الإيثانول.
   4. أدخل إبرة معقمة 20 جم ، 2.54 سم تحت الجلد ~ 1 سم في قشر البيض وحقن الجرعة المخصصة في كيس صفار البيض. حقن البيض من علاج ريبوسيد نيكوتيناميد 0 mM مع 100 ميكرولتر من محلول ملحي معقم (0.9٪).
   5. على الفور ، قم بتغطية موقع الحقن بقطعة صغيرة من الشريط المقاوم للماء المطلق لتجنب فقدان الرطوبة المفرط.
   6. بمجرد أن يتلقى جميع البيض علاجه ، ضع الدرج مرة أخرى في الحاضنة.
   7. في يوم الحضانة 18 ، قم بإزالة البيض من الصواني ووضعه في صناديق الفقس وفقا لعلاجاتهم.
   8. ضع صناديق الفقس في الحاضنة وقم بزيادة الرطوبة إلى 60 ± 2٪ حتى يفقس كل البيض أو حتى يوم 23 من الحضانة.
      ملاحظة: إذا كان البيض لا يحتوي على جنين عند التشميع، تخلص من البويضة. هذا سيمنع حدوث البيض الفاسد.

2. القتل الرحيم والصدر جمع عينات العضلات الرئيسية

1. القتل الرحيم للكتاكيت
   1. في يوم الحضانة 18 ، قم بإزالة البيض الجنيني من الحاضنة ووضعه في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة لوقف التمثيل الغذائي. قم بإزالة الأجنة من البيض ، ووزنها بدون كيس صفار البيض ، ثم قطع الرأس. 12 ساعة بعد الفقس ، القتل الرحيم للكتاكيت عن طريق التعرض لثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 10 دقائق ، وزنها ، جمع قياس طول التاج إلى الردف بسرعة ، ثم قطع الرأس.
      ملاحظة: حقيقة أن الطائر لم يعد لديه رأسه يضمن القتل الرحيم.
   2. ضع في اعتبارك القياسات التالية (الخطوات 2.1.2.1-2-2-4) باستخدام الفرجار الرقمي للأجنة والكتاكيت.
      1. لتحديد طول التاج إلى الردف ، ضع الفرخ على جانبه مع رأسه مدسوس لأسفل وساقيه تحت جسمه. قياس من أعلى الرأس إلى الذيل.
      2. لقياس عرض الرأس، قم بالقياس من ثقب أذن إلى ثقب أذن آخر.
      3. لتحديد طول الرأس ، قم بالقياس من الجزء الخلفي من المنقار إلى الجزء الخلفي من الجمجمة.
      4. خذ خيطا غير مرن ولفه حول الجمجمة من ثقب أذن إلى آخر لقياس محيط الرأس. ضع سلسلة على مسطرة مترية للحصول على قياس.
   3. اجمع محيط الصدر عن طريق لف خيط حول الصدر ، تحت المكان الذي تتصل فيه الأجنحة بالجسم ووضع السلسلة على مسطرة مترية للحصول على القياس.
   4. رش الثديين بنسبة 70٪ من الإيثانول ، واستخدام الأصابع ، وسحب الريش والجلد للكشف عن العضلات الرئيسية الصدرية وأخذ القياسات (الخطوات 2.1.4.1-2.1.4.2) باستخدام الفرجار الرقمي.
      1. لتحديد عرض الصدر ، قم بالقياس عبر الصدر حيث تتصل الأجنحة بالجسم.
      2. لتحديد طول الصدر ، قم بالقياس من أسفل الترقوة إلى أعلى وسادة الدهون.
2. استخراج العضلات الصدرية الرئيسية وقياسها وجمعها
   1. باستخدام المقص الجراحي أو المشرط والملقط ، قم بإزالة العضلة الصدرية الرئيسية اليمنى عن طريق قطع عظم العارضة وإطلاق العضلات من جدار الجسم.
      ملاحظة: تأكد من عدم جمع العضلة الصدرية الصغيرة عن طريق تحديد بصريا أن العضلات تبقى في القفص الصدري.
   2. بعد إزالة العضلة الصدرية الرئيسية، ضع العضلة مسطحة على عصا المصاصة، واجمع القياسات التالية (الخطوات 2.2.2.1-2.2.2.3) باستخدام الفرجار الرقمي.
      1. لتحديد طول العضلات ، قم بالقياس من الجمجمة إلى الجزء الذيلي من العضلات.
      2. لتحديد عرض العضلات ، قم بالقياس على أوسع جزء من الجزء القحفي من العضلات.
      3. لتحديد سمك العضلات ، التقط الثدي باستخدام ملقط وقياس الجزء الأكثر سمكا من الجزء القحفي من العضلات.
   3. إذا رغبت في ذلك ، قم بتخزين هذه العضلة والعضلة الصدرية اليسرى الرئيسية لمزيد من التحليلات (مثل الأنسجة والبروتين والتعبير الجيني ، وما إلى ذلك) عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى عام.

3. الإحصائيات

1. تحليل البيانات كتصميم عشوائي تماما مع البيض / الفرخ كوحدة تجريبية.
   ملاحظة: جرعة نيكوتيناميد ريبوسيد (DOS) بمثابة التأثير الثابت. تم تحليل جميع البيانات باستخدام برنامج تحليل إحصائي (انظر جدول المواد) ، وتم حساب المقارنات الزوجية بين وسائل المعالجة الأقل مربعا. واعتبرت الفروق ذات دلالة إحصائية عند P < 0.05.

النتائج

لم تكن هناك آثار DOS على وزن الجسم للأجنة في اليوم 18 والفراخ الفقس (P > 0.52; الشكل 2). لم تكن هناك آثار DOS لجميع قياسات العضلات الرئيسية للأجنة الصدرية في اليوم 18 (P > 0.24; الشكل 3). لم تكن هناك آثار DOS لقياسات طول وعرض العضلات الرئيسية للكتكوت الصدري

Discussion

حتى الآن ، يعد مختبر غونزاليس في جامعة جورجيا هو المجموعة الوحيدة التي أظهرت آثارا إيجابية لريبوسيد نيكوتيناميد في تغذية البويضة على نمو العضلات الرئيسية الصدرية ونموها. وجدت الدراسة الأولى أنه في تغذية البويضة من 250 mM نيكوتيناميد ريبوسيد زيادة وزن العضلات والأبعاد عند حق?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air-Tite™ Sterile Hypodermic Needles- 20 G; 1 inch	Fisher Scientific	14-817-208	https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-hypodermic-needles-32/p-7182916#?keyword=
Analytical Balance	VWR	VWR-214B2	https://us.vwr.com/store/product/20970740/vwr-b2-series-analytical-and-precision-balances
Complete Dissection Set	DOCAZON	DK1001	https://www.amazon.com/DOCAZON-Complete-Dissection-Set-Dissecting/dp/B07VBHKSW3
Fisherbrand™ Isotemp™ General Purpose Deluxe Water Baths	Fisher Scientific	FSGPD02	https://www.fishersci.com/shop/products/isotemp-general-purpose-water-baths/p-6448020
Fisherbrand™ Sterile Syringes for Single Use	Fisher Scientific	14-955-464	https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/p-7114739#?keyword=
HIGH INTENSITY EGG CANDLER	Titan Incubators	N/A	https://www.titanincubators.com/collections/egg-candlers/products/egg-candler-high-intensity
Infrared Forehead Thermometer	HALIDODO	XZ-001
Microsoft Excel	Microsoft	N/A
Neiko Tools Digital Caliper	Neiko Tools	01408A	https://www.amazon.com/Neiko-01407A-Electronic-Digital-Stainless/dp/B000NEA0P8?th=1
Nexcare Absolute Waterproof Tape	Nexcare Brand	732	https://www.nexcare.com/3M/en_US/nexcare/products/catalog/~/Nexcare-Absolute-Waterproof-Tape/?N=4326+3294529207+3294631805 &rt=rud
Pen Size Temperature and Humidity USB Data Logger with Display	Omega	OM-HL-SP-TH	https://www.omega.com/en-us/temperature-measurement/temperature-and-humidity-data-loggers/p/OM-HL-SP-Series
SAS 9.4 for Windows	SAS Institute	N/A	https://www.sas.com/en_us/home.html
Sportsman 1502 Incubator	GQF Manufacturing	1502	https://www.gqfmfg.com/item/1502-digital-sportsman/
Tru Niagen (Nicotinamide riboside)	ChromaDex, Inc.	N/A	https://www.truniagen.com/truniagen-300mg/ - note, contact company for pure product
Wood Craft Sticks	Creatology	M20001547	https://www.michaels.com/wood-craft-sticks-by-creatology/M20001547.html