En Ovo Alimentación de huevos de pollos de engorde comerciales: un método preciso y reproducible para afectar el desarrollo y el crecimiento muscular

Resumen

Se ha desarrollado una metodología robusta para llevar a cabo ensayos de investigación de alimentación en ovo utilizando huevos de pollos de engorde comerciales no incluidos para probar la capacidad de los compuestos naturales y sintéticos, en este caso, el ribósido de nicotinamida, para influir en el desarrollo y crecimiento muscular.

Resumen

En las últimas tres décadas, los científicos de carne roja y aves de corral se centraron en el desarrollo de estrategias y tecnologías para manipular el desarrollo muscular durante el desarrollo embrionario y fetal. Esta área continúa siendo un área de enfoque porque el número de fibras musculares se establece durante este tiempo y determina la base para todo el crecimiento futuro. En aves de corral, numerosos estudios demostraron que la alimentación con factores de crecimiento, vitaminas u otros nutrientes mejoró el desarrollo muscular embrionario e intestinal de los pollitos. Mejorar el desarrollo muscular ovo podría beneficiar a la industria avícola al influir posiblemente en el rendimiento de la carne, la tasa de crecimiento o las condiciones de miopatía. Durante los últimos cinco años, el Laboratorio González de la Universidad de Georgia desarrolló una metodología de nicotinamida ribósido in ovo feeding para embriones de pollo de engorde, lo que alteró el desarrollo muscular. Cuando se inyecta en el saco vitelino de un embrión en desarrollo, el ribósido de nicotinamida aumentó el peso muscular principal del pectoral y la densidad de la fibra muscular en la eclosión. Este protocolo demostrará una metodología para realizar de manera precisa y reproducible estudios de alimentación en ovo utilizando embriones comerciales de pollos de engorde estándar y de alto rendimiento. Estos datos y métodos permitirán a otros grupos de investigación realizar estudios de alimentación en ovo con mucho éxito y reproducibilidad.

Introducción

Desde 1960, el consumo per cápita de carne de aves de corral de los Estados Unidos ha aumentado a un ritmo asombroso, mientras que otras fuentes primarias de proteínas se han mantenido estancadas, disminuidas o mínimamente aumentadas. La industria avícola invirtió un tiempo considerable y esfuerzos de investigación optimizando la nutrición y la genética para producir un ave eficiente para mantenerse al día con la demanda. Debido a que el objetivo principal de la industria avícola es producir músculo para la conversión en carne, sus esfuerzos han cambiado drásticamente la masa muscular final del ave en la cosecha.

Como la mayoría de las especies, las aves de corral desarrollan músculo de manera bifásica. La miogénesis primaria utiliza células madre mesenquimales para producir fibras musculares primarias, que sirven como andamio para la segunda ola de desarrollo de fibras musculares¹. En las aves de corral, la miogénesis primaria ocurre durante los días embrionarios 3 a 8, y la miogénesis secundaria ocurre de los días 8 a 21². Una vez desarrolladas, las fibras musculares primarias y secundarias sirven como base para todo el crecimiento muscular futuro a través de la hipertrofia celular. Por lo tanto, los científicos y la industria dedicaron un esfuerzo considerable a intentar manipular la miogénesis primaria y secundaria en todas las especies productoras de carne para maximizar el rendimiento de la carne.

Una tecnología explorada en aves de corral, llamada alimentación en ovo, implica la alimentación de compuestos a través de la inyección. In ovo feeding, una tecnología empleada por la industria avícola durante casi 40 años, se desarrolló inicialmente para la administración de vacunas³. La literatura documenta que la alimentación in ovo de diversos compuestos y nutrientes en diferentes períodos de desarrollo y ubicaciones dentro del huevo afectó positivamente en el desarrollo y crecimiento muscular ovo ^4,5,6. Hasta la fecha, el Laboratorio González de la Universidad de Georgia es el pionero en la utilización de ribósido de nicotinamida en la alimentación ovo para manipular el desarrollo muscular de las aves de corral.

El ribósido de nicotinamida, un análogo piridina-nucleósido de la vitamina B3, produce NAD+ a través de la vía de rescate⁷. Dado que esta vía utiliza menos pasos enzimáticos para producir NAD +, la producción es la más eficiente⁸. González y Jackson⁹ demostraron que la suplementación del saco vitelino embrionario en desarrollo con ribósido de nicotinamida aumentó el peso muscular mayor del pollito eclosionado y la densidad de la fibra muscular. Esto fue confirmado más tarde por Xu et ^al.10, quienes encontraron que el aumento de la dosis de ribósido de nicotinamida aumentaba el peso muscular y aumentaba la densidad de la fibra muscular. Estos dos primeros estudios se realizaron en un pollo de engorde de rendimiento comercial. Debido a que los pollos de engorde de alto rendimiento poseen un potencial genético más significativo para el tamaño final de la masa muscular, el objetivo del estudio fue determinar los efectos de la dosis de ribósido de nicotinamida en el desarrollo muscular principal del pollito pectoral de alto rendimiento en la eclosión.

Protocolo

Todas las metodologías fueron aprobadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Georgia.

1. Incubación de huevos y administración de tratamiento

1. Asignación de obtención y tratamiento de óvulos
   1. Obtenga huevos de pollos de engorde de alto rendimiento no intervenidos y fertilizados y transpórtelos al laboratorio.
   2. Inspeccionar y desechar los huevos considerados de mala calidad.
      NOTA: Elimine los huevos deformes (redondos, alargados, de lado de losa), agrietados, sucios / manchados, de cáscara delgada y arrugados. Esto es importante para minimizar el riesgo de huevos podridos.
   3. Asigne números de huevos individuales, pese y registre números y pesos de huevos en un programa de software de hoja de cálculo.
   4. Utilice el programa de software de hoja de cálculo para clasificar los huevos por peso.
      1. Resalte las columnas de número de huevo y peso de huevo .
      2. Seleccione la pestaña Datos y luego Ordenar: ordene los datos por peso de huevo de menor a mayor.
         NOTA: Para obtener la mejor tasa de eclosión, use huevos que pesen entre 40 y 70 g.
      3. Según el diseño del experimento, asigne a los óvulos (numérica o alfabéticamente) un tratamiento de inyección y el día de la eutanasia. Ingrese el número de tratamiento y el día de la eutanasia en columnas separadas y asigne aleatoriamente estos factores dentro de cada estrato.
         NOTA: Para esta publicación, los tratamientos se asignaron al azar dentro de cada estrato de 8 huevos.
   5. Genere una tabla dinámica dentro del programa de software de hoja de cálculo para garantizar que cada tratamiento posea pesos de huevo iniciales similares.
      1. Resalte todos los datos dentro de la hoja de cálculo que se van a analizar.
      2. Seleccione la opción Tabla dinámica en la pestaña Insertar .
      3. Seleccione la variable independiente (columna Día de eutanasia ) dentro de la subventana Campos de tabla dinámica y arrastre hasta el campo Filas .
      4. Seleccione la variable independiente (columna Tratamiento ) dentro de la subventana B y arrastre al campo Filas , en Día de la eutanasia.
      5. Seleccione la variable de interés dependiente (Egg Weight) y arrástrela al campo Valores .
      6. Cambie la configuración del campo Valor haciendo clic en la variable dependiente y seleccionando Configuración del campo Valor.
         1. Cambie la configuración a Promedio.
2. Asignación de bandeja
   1. En el programa de software de hoja de cálculo, asigne huevos a una bandeja (numérica o alfabéticamente), de modo que los tratamientos se representen igualmente dentro de una bandeja.
      1. Asigne los primeros cuatro huevos con tratamientos asignados a la bandeja 1. Asigne los siguientes cuatro huevos a la bandeja 2 y continúe hasta que todos los huevos se asignen a una bandeja.
         NOTA: Este paso variará dependiendo del número de incubadoras y bandejas utilizadas en el experimento.
3. Asegúrese de que todos los tratamientos estén igualmente representados en una bandeja mediante la función de tabla dinámica .
   1. Resalte todos los datos dentro de la hoja de cálculo que se van a analizar.
   2. Seleccione la opción Tabla dinámica en la pestaña Insertar .
   3. Seleccione la variable independiente (columna Bandeja ) dentro de la subventana Campos de tabla dinámica y arrastre hasta el campo Filas .
   4. Seleccione la variable de interés dependiente (Egg Weight) y arrástrela al campo Valores .
   5. Cambie la configuración del campo Valor haciendo clic en la variable dependiente y seleccionando Configuración del campo Valor.
      1. Cambie la configuración a Contar.
4. Incubación
   1. Coloque los huevos en su bandeja de incubación adecuada y preincube a 26,6 °C con un 40% de ± un 4% de humedad relativa durante 6 h.
      NOTA: Algunas incubadoras tienen sistemas de autocontrol que pueden no ser del todo precisos. Utilice otros dispositivos de monitoreo de temperatura y humedad para controlar las condiciones.
   2. Aumentar la temperatura de la incubadora a 37 °C con un 40% de ± un 4% de humedad relativa y mantener estas condiciones hasta el día 18 de incubación.
      1. Para garantizar una temperatura adecuada de la incubadora, mida las temperaturas de la superficie de varios huevos en toda la incubadora dos veces al día con un termómetro térmico de la superficie para garantizar que las temperaturas de la superficie sean de 37 ° C.
   3. Gire los huevos cada hora para reposicionarlos.
   4. Registre el peso de los huevos diariamente para garantizar una pérdida de peso de huevo del 10% al 12.5% durante los primeros 18.5 días de incubación.
      NOTA: Si la pérdida de peso no está dentro del rango deseado, ajuste (aumente o disminuya) la humedad.
5. Día de incubación-10 en ovo inyecciones
   1. Calcule la cantidad de ribósido de nicotinamida necesaria para cada tratamiento utilizando el peso de la fórmula de 290,07 g/mol, con 100 μL de solución inyectada en el saco vitelino de cada huevo.
      NOTA: Se utilizará solución salina estéril (0,9%) como diluyente para todas las soluciones.
      Cálculo: 50 huevos × 100 μL = 5.000 μL (5 mL) de solución necesaria. Redondee hasta 6 ml para asegurarse de que hay suficiente solución disponible para inyección (Figura 1).
      1. Una vez hechas las soluciones, colócalas en un baño de agua a 37 °C para mantenerlas a la temperatura de los huevos.
   2. Retire los huevos de la incubadora una bandeja a la vez y cúbralos con una toalla tibia.
   3. Huevo de vela para localizar el saco vitelino y limpiar la zona de inyección con etanol al 70%.
   4. Inserte una aguja hipodérmica estéril de 20 G, 2,54 cm ~ 1 cm en la cáscara del huevo e inyecte la dosis asignada en el saco vitelino. Inyectar los óvulos del tratamiento con ribósido de nicotinamida 0 mM con 100 μL de solución salina estéril (0,9%).
   5. Inmediatamente, cubra el sitio de inyección con un pequeño trozo de cinta impermeable absoluta para evitar la pérdida excesiva de humedad.
   6. Una vez que todos los huevos hayan recibido su tratamiento, coloque la bandeja de nuevo en la incubadora.
   7. En el día 18 de incubación, retire los huevos de las bandejas y colóquelos en cajas para incubar de acuerdo con sus tratamientos.
   8. Coloque las cajas de incubación en la incubadora y aumente la humedad a 60 ± 2% hasta que todos los huevos eclosionen o hasta el día 23 de incubación.
      NOTA: Si los óvulos no contienen un embrión en el candling, deseche el huevo. Esto evitará la aparición de huevos podridos.

2. Eutanasia y recolección de muestras de músculo pectoral mayor

1. Eutanasia de pollitos
   1. En el día 18 de incubación, retire los huevos embrionarios de la incubadora y colóquelos a temperatura ambiente durante 1 h para detener el metabolismo. Retire los embriones de los huevos, pese sin el saco vitelino y luego decapite. 12 h después de la eclosión, sacrificar a los polluelos por exposición al CO₂ durante 10 minutos, pesar, recoger rápidamente la medición de la longitud de la corona a la grupa y luego decapitar.
      NOTA: El hecho de que el ave ya no tenga cabeza asegura la eutanasia.
   2. Considere las siguientes mediciones (pasos 2.1.2.1-2.1.2.4) utilizando pinzas digitales para embriones y pollitos.
      1. Para determinar la longitud de la corona a la grupa, coloque el polluelo de lado con la cabeza metida hacia abajo y las patas debajo de su cuerpo. Mide desde la parte superior de la cabeza hasta la cola.
      2. Para medir el ancho de la cabeza, mida de un orificio para la oreja al otro orificio para la oreja.
      3. Para determinar la longitud de la cabeza, mida desde la parte posterior del pico hasta la parte posterior del cráneo.
      4. Tome una cuerda no elástica y envuélvala alrededor del cráneo de un orificio de la oreja al otro para medir la circunferencia de la cabeza. Coloque la cadena en una regla métrica para obtener una medición.
   3. Recoge la circunferencia del pecho envolviendo una cuerda alrededor del pecho, debajo de donde las alas entran en contacto con el cuerpo y colocando la cuerda en una regla métrica para obtener la medición.
   4. Rocíe los senos con etanol al 70% y, con los dedos, tire de las plumas y la piel para revelar los músculos pectorales mayores y tome las medidas (pasos 2.1.4.1-2.1.4.2) con pinzas digitales.
      1. Para determinar el ancho del pecho, mida a través del pecho donde las alas entran en contacto con el cuerpo.
      2. Para determinar la longitud del pecho, mida desde la parte inferior de la clavícula hasta la parte superior de la almohadilla de grasa.
2. Extracción del músculo pectoral mayor , medición y recolección
   1. Usando tijeras quirúrgicas o bisturí y fórceps, retire el músculo pectoral mayor derecho cortando a lo largo del hueso de la quilla y liberando el músculo de la pared del cuerpo.
      NOTA: Asegúrese de no recolectar el músculo pectoral menor identificando visualmente que el músculo permanece en la caja torácica.
   2. Después de extirpar el músculo pectoral mayor , coloque el músculo plano sobre un palito de paleta y recoja las siguientes mediciones (pasos 2.2.2.1-2.2.2.3) utilizando pinzas digitales.
      1. Para determinar la longitud del músculo, mida desde el cráneo hasta la porción caudal del músculo.
      2. Para determinar el ancho muscular, mida en la porción más ancha de la parte craneal del músculo.
      3. Para determinar el grosor muscular, recoja el seno con fórceps y mida en la parte más gruesa de la parte craneal del músculo.
   3. Si lo desea, guarde este músculo y el músculo pectoral mayor izquierdo para análisis adicionales (como histología, expresión de proteínas y genes, etc.) a -80 ° C durante un máximo de un año.

3. Estadísticas

1. Analice los datos como un diseño completamente aleatorio con huevo / pollito como unidad experimental.
   NOTA: La dosis de ribósido de nicotinamida (DOS) sirvió como efecto fijo. Todos los datos se analizaron con un programa de software de análisis estadístico (ver Tabla de Materiales), y se calcularon las comparaciones por pares entre las medias de tratamiento menos cuadradas. Las diferencias se consideraron significativas en P < 0,05.

Resultados

No hubo efectos dos para el peso corporal de los embriones del día 18 y los pollitos eclosionados (P > 0,52; Figura 2). No hubo efectos del DOS para todas las mediciones musculares del embrión pectoral mayor del día 18 (P > 0,24; Figura 3). No hubo efectos del DOS para las mediciones de longitud y anchura muscular mayor del pollito eclosionado (P > 0,26); sin embargo, el DOS sí afectó el peso y la profun...

Discusión

Hasta la fecha, el Laboratorio González de la Universidad de Georgia es el único grupo que demuestra los efectos positivos del ribósido de nicotinamida en la alimentación de ovo en el desarrollo y crecimiento muscular mayor de la pectoral . El primer estudio encontró que en la alimentación ovo de nicotinamida de 250 mM ribósido aumentó el peso muscular y las dimensiones cuando se inyectó en el saco vitelino⁹. En el estudio de seguimiento, la inyección de dosis ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air-Tite™ Sterile Hypodermic Needles- 20 G; 1 inch	Fisher Scientific	14-817-208	https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-hypodermic-needles-32/p-7182916#?keyword=
Analytical Balance	VWR	VWR-214B2	https://us.vwr.com/store/product/20970740/vwr-b2-series-analytical-and-precision-balances
Complete Dissection Set	DOCAZON	DK1001	https://www.amazon.com/DOCAZON-Complete-Dissection-Set-Dissecting/dp/B07VBHKSW3
Fisherbrand™ Isotemp™ General Purpose Deluxe Water Baths	Fisher Scientific	FSGPD02	https://www.fishersci.com/shop/products/isotemp-general-purpose-water-baths/p-6448020
Fisherbrand™ Sterile Syringes for Single Use	Fisher Scientific	14-955-464	https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/p-7114739#?keyword=
HIGH INTENSITY EGG CANDLER	Titan Incubators	N/A	https://www.titanincubators.com/collections/egg-candlers/products/egg-candler-high-intensity
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SAS 9.4 for Windows	SAS Institute	N/A	https://www.sas.com/en_us/home.html
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