Em Ovo Alimentação de ovos de frango comercial: um método preciso e reprodutível para afetar o desenvolvimento e o crescimento muscular

Resumo

Uma metodologia robusta foi desenvolvida para a realização de ensaios de pesquisa de alimentação ovo utilizando ovos de frango de corte comerciais não insusípidos para testar a capacidade de compostos naturais e sintéticos, neste caso, nicotinamida riboside, para influenciar o desenvolvimento e o crescimento muscular.

Resumo

Nas últimas três décadas, cientistas de carne vermelha e aves se concentraram no desenvolvimento de estratégias e tecnologias para manipular o desenvolvimento muscular durante o desenvolvimento embrionário e fetal. Esta área continua sendo uma área de foco porque o número de fibra muscular é estabelecido durante este tempo e determina a base para todo o crescimento futuro. Nas aves de capoeira, inúmeros estudos demonstraram na alimentação ovo de fatores de crescimento, vitaminas ou outros nutrientes melhorou o desenvolvimento do músculo embrionário e intestinal do filhote. Melhorar o desenvolvimento muscular de ovo poderia beneficiar a indústria avícola, possivelmente influenciando o rendimento da carne, a taxa de crescimento ou as condições de miopatia. Durante os últimos cinco anos, o Laboratório Gonzalez da Universidade da Geórgia desenvolveu um riboside de nicotinamida na metodologia de alimentação ovo para embriões de frango de corte, que alteraram o desenvolvimento muscular. Quando injetado no saco de gema de um embrião em desenvolvimento, a nicotinamida riboside aumentou o peso muscular e a densidade de fibra muscular na escotilha. Este protocolo demonstrará uma metodologia para conduzir com precisão e reprodução em estudos de alimentação ovo utilizando embriões comerciais padrão e de alto rendimento. Esses dados e métodos permitirão que outros grupos de pesquisa realizem estudos de alimentação com muito sucesso e reprodutibilidade.

Introdução

Desde 1960, o consumo per capita de carne de aves dos Estados Unidos aumentou a uma taxa surpreendente, enquanto outras fontes primárias de proteína permaneceram estagnadas, declinadas ou minimamente aumentadas. A indústria avícola investiu tempo considerável e esforços de pesquisa otimizando nutrição e genética para produzir uma ave eficiente para acompanhar a demanda. Como o principal objetivo da indústria avícola é produzir músculos para conversão à carne, seus esforços mudaram drasticamente a massa muscular final da ave na colheita.

Como a maioria das espécies, as aves desenvolvem músculos de forma bifásica. A miogênese primária utiliza células-tronco mesenquimais para produzir fibras musculares primárias, que servem como andaime para a segunda onda de desenvolvimento de fibras musculares¹. Nas aves, a miogênese primária ocorre durante os dias embrionários de 3 a 8 dias, e a miogênese secundária acontece dos dias 8 a²¹². Uma vez desenvolvidas, as fibras musculares primárias e secundárias servem de base para todo o crescimento muscular futuro através da hipertrofia celular. Portanto, cientistas e indústria gastaram um esforço considerável tentando manipular a miogênese primária e secundária em todas as espécies produtoras de carne para maximizar o rendimento da carne.

Uma tecnologia explorada em aves de capoeira, chamada de alimentação ovo, envolve alimentar compostos através da injeção. Na alimentação ovo, uma tecnologia empregada pela indústria avícola por quase 40 anos, foi inicialmente desenvolvida para a administração de^{vacinas 3}. A literatura documenta que na alimentação de vários compostos e nutrientes em diferentes períodos de desenvolvimento e locais dentro do ovo afetou positivamente no desenvolvimento muscular ovo e crescimento ^4,5,6. Até o momento, o Laboratório Gonzalez da Universidade da Geórgia é pioneiro na utilização da nicotinamida riboside na alimentação de ovo para manipular o desenvolvimento muscular avícola.

Nicotinamida riboside, um análogo piridina-nucleosídeo de vitamina B3, produz NAD+ através da via^{de salvamento 7}. Como essa via utiliza menos passos enzimáticos para produzir NAD+, a produção é a⁸ mais eficiente. Gonzalez e Jackson⁹ demonstraram que a suplementação do desenvolvimento de gema de embrião de frango com nicotinamida riboside aumentou o peso muscular e a densidade da fibra muscular. Isso foi mais tarde confirmado por Xu et ^al.10, que descobriram que o aumento da dose de nicotinamida riboside aumentou o peso muscular e aumentou a densidade de fibra muscular. Estes dois primeiros estudos foram realizados em um frango de corte de rendimento comercial. Como os frangos de alto rendimento possuem um potencial genético mais significativo para o tamanho final da massa muscular, o objetivo do estudo foi determinar os efeitos da dose riboside nicotinamida no frango de alta produtividade eclodido peitoral

Protocolo

Todas as metodologias foram aprovadas pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Geórgia.

1. Administração de incubação e tratamento de ovos

1. Aquisição de ovos e atribuição de tratamento
   1. Obtenha ovos de frango de corte de alto rendimento não insincubados e fertilizados e transporte-os para o laboratório.
   2. Inspecione e descarte ovos considerados de má qualidade.
      NOTA: Elimine os ovos defeituosos (redondos, alongados, de lado para a laje), rachados, sujos/manchados, de casca fina e enrugados. Isso é importante para minimizar o risco de ovos podres.
   3. Atribua números individuais de ovos, pese e regise números e pesos de ovos em um programa de software de planilha.
   4. Utilize o programa de software de planilha para classificar ovos em peso.
      1. Destaque o número do ovo e as colunas de peso do ovo .
      2. Selecione a guia Dados e, em seguida, Classifique dados por peso de ovo de menor para maior.
         NOTA: Para a melhor taxa de eclosão, use ovos pesando entre 40 e 70 g.
      3. Com base no desenho do experimento, atribua aos ovos (numericamente ou alfabeticamente) um tratamento de injeção e dia de eutanásia. Digite o número do tratamento e o dia da eutanásia em colunas separadas e atribua aleatoriamente esses fatores dentro de cada estrato.
         NOTA: Para esta publicação, os tratamentos foram atribuídos aleatoriamente dentro de cada estratos de 8 óvulos.
   5. Gere uma Tabela Dinâmica dentro do programa de software de planilha para garantir que cada tratamento possua pesos de ovos iniciais semelhantes.
      1. Destaque todos os dados dentro da planilha a serem analisados.
      2. Selecione a opção Tabela Dinâmica na guia Inserir .
      3. Selecione a variável independente (coluna Dia da Eutanásia ) dentro da subcesse de Campos de Tabela Dinâmica e arraste para o campo Rows .
      4. Selecione a variável independente (coluna tratamento ) dentro da sub-janela B e arraste para o campo Rows , sob o Dia da Eutanásia.
      5. Selecione a variável dependente de interesse (Peso do Ovo) e arraste-a para o campo Valores .
      6. Alterar as configurações do campo de valor clicando na variável dependente e selecionando Configurações de campo de valor.
         1. Altere a configuração para Média.
2. Atribuição de bandeja
   1. No programa de software de planilha, atribua ovos a uma bandeja (numericamente ou alfabeticamente), de modo que os tratamentos são igualmente representados dentro de uma bandeja.
      1. Atribua os primeiros quatro ovos com tratamentos atribuídos à bandeja 1. Atribua os próximos quatro ovos à bandeja 2 e continue até que todos os ovos sejam atribuídos a uma bandeja.
         NOTA: Esta etapa variará dependendo do número de incubadoras e bandejas utilizadas no experimento.
3. Certifique-se de que todos os tratamentos estejam igualmente representados em uma bandeja usando a função Deteira.
   1. Destaque todos os dados dentro da planilha a serem analisados.
   2. Selecione a opção Tabela dinâmica na guia Inserir .
   3. Selecione a variável independente (coluna Bandeja ) na sub-janela PivotTable Fields e arraste para o campo Linhas .
   4. Selecione a variável dependente de interesse (Peso do Ovo) e arraste-a para o campo Valores .
   5. Alterar as configurações do campo de valor clicando na variável dependente e selecionando Configurações de campo de valor.
      1. Altere a configuração para Contagem.
4. Incubação
   1. Coloque os ovos na bandeja de incubação apropriada e pré-incuba-os a 26,6 °C com 40% ± umidade relativa de 4% por 6h.
      NOTA: Algumas incubadoras possuem sistemas de automonitoramento que podem não ser inteiramente precisos. Use outros dispositivos de monitoramento de temperatura e umidade para controlar as condições.
   2. Aumente a temperatura da incubadora para 37 °C com 40% ± umidade relativa de 4% e mantenha essas condições até o dia da incubação 18.
      1. Para garantir a temperatura adequada da incubadora, meça as temperaturas da superfície de vários ovos em toda a incubadora duas vezes por dia com um termômetro de superfície térmica para garantir que as temperaturas da superfície sejam de 37 °C.
   3. Gire ovos de hora em hora para reposicionar.
   4. Recorde de pesos de ovos diariamente para garantir a perda de peso de 10%-12,5% dos ovos durante os primeiros 18,5 dias de incubação.
      NOTA: Se a perda de peso não estiver dentro da faixa desejada, ajuste (aumente ou diminua) a umidade.
5. Incubação dia 10 em injeções de ovo
   1. Calcule a quantidade de nicotinamida riboside necessária para cada tratamento usando o peso da fórmula de 290,07 g/mol, com 100 μL de solução injetada no saco de gema de cada ovo.
      NOTA: A solução de solução salina estéril (0,9%) será utilizada como diluente para todas as soluções.
      Cálculo: 50 ovos × 100 μL = 5.000 μL (5 mL) da solução necessária. Arredondar até 6 mL para garantir que a solução suficiente esteja disponível para injeção (Figura 1).
      1. Uma vez que as soluções sejam feitas, coloque-as em um banho de água de 37 °C para mantê-las à temperatura dos ovos.
   2. Retire os ovos da bandeja de uma bandeja de cada vez e cubra com uma toalha quente.
   3. Ovo de vela para localizar o saco de gema e limpar a área de injeção com 70% de etanol.
   4. Insira uma agulha hipodérmica estéril de 20 G, 2,54 cm ~1 cm na casca de ovo e injete a dose atribuída no saco de gema. Injete os ovos do tratamento riboside de nicotinamida de 0 mM com 100 μL de soro fisiológico estéril (0,9%).
   5. Imediatamente, cubra o local da injeção com um pequeno pedaço de fita impermeável absoluta para evitar perda excessiva de umidade.
   6. Uma vez que todos os ovos tenham recebido seu tratamento, coloque a bandeja de volta na incubadora.
   7. No dia 18 de incubação, retire os ovos das bandejas e coloque-os em caixas de eclosão de acordo com seus tratamentos.
   8. Coloque caixas de eclosão na incubadora e aumente a umidade para 60 ± 2% até que todos os ovos eclodam ou até o dia 23 de incubação.
      NOTA: Se os ovos não contiveram um embrião em candling, descarte o ovo. Isso evitará a ocorrência de ovos podres.

2. Eutanásia e coleta de amostras musculares principais

1. Eutanásia de pintinho
   1. No dia da incubação, dia 18, remova os ovos embrionários da incubadora e coloque-os em temperatura ambiente por 1h para cessar o metabolismo. Remova os embriões dos ovos, pese sem o saco de gema e, em seguida, decapite. 12 h pós-eclosão, eutanize os filhotes por exposição ao CO₂ por 10 minutos, pese, colete rapidamente a medição do comprimento da coroa à garupa e, em seguida, decapitar.
      NOTA: O fato de o pássaro não ter mais a cabeça garante a eutanásia.
   2. Considere as seguintes medidas (etapas 2.1.2.1-2.1.2.4) utilizando pinças digitais para embriões e filhotes.
      1. Para determinar o comprimento da coroa para a garupa, coloque o filhote de lado com a cabeça abaixada e as pernas sob seu corpo. Meça desde a parte superior da cabeça até a cauda.
      2. Para medir a largura da cabeça, meça de um orifício de ouvido para o outro orifício da orelha.
      3. Para determinar o comprimento da cabeça, meça desde a parte de trás do bico até a parte de trás do crânio.
      4. Pegue uma corda não elástica e enrole-a ao redor do crânio de um orifício de ouvido para o outro para medir a circunferência da cabeça. Coloque a corda em uma régua métrica para obter uma medição.
   3. Colete a circunferência torácica envolvendo uma corda ao redor do peito, sob onde as asas entram em contato com o corpo e colocando a corda em uma régua métrica para obter a medição.
   4. Pulverize os seios com 70% de etanol, e usando os dedos, puxe as penas e a pele para revelar os músculos peitoral e faça as medidas (etapas 2.1.4.1-2.1.4.2) com pinças digitais.
      1. Para determinar a largura do peito, meça através do peito onde as asas entram em contato com o corpo.
      2. Para determinar o comprimento do peito, meça da parte inferior da clavícula até o topo da almofada de gordura.
2. Extração de peitoral maior músculo, medição e coleta
   1. Usando tesoura cirúrgica ou bisturi e fórceps, remova o músculo peitoral direito cortando ao longo do osso da quilha e liberando o músculo da parede do corpo.
      NOTA: Certifique-se de não coletar o músculo peitoral menor , identificando visualmente que o músculo permanece na caixa torácica.
   2. Depois de remover o músculo peitoral principal , coloque o músculo plano em uma vara de picolé e colete as seguintes medidas (etapas 2.2.2.1-2.2.2.3) usando pinças digitais.
      1. Para determinar o comprimento muscular, meça desde o craniano até a porção caudal do músculo.
      2. Para determinar a largura muscular, meça na porção mais larga da parte craniana do músculo.
      3. Para determinar a espessura muscular, pegue o peito com fórceps e meça na porção mais grossa da parte craniana do músculo.
   3. Se desejar, armazene este músculo e o músculo peitoral esquerdo para novas análises (como histologia, proteína e expressão genética, etc.) a -80 °C por até um ano.

3. Estatísticas

1. Analise os dados como um desenho completamente randomizado com ovo/pintinho como unidade experimental.
   NOTA: A dose riboside de nicotinamida (DOS) serviu como efeito fixo. Todos os dados foram analisados com um programa de análise estatística (ver Tabela de Materiais), e comparações em pares entre meios menos quadrados de tratamentos foram computadas. As diferenças foram consideradas significativas em P < 0,05.

Resultados

Não houve efeitos DOS para o peso corporal de embriões do dia-18 e filhotes eclodidos (P > 0,52; Figura 2). Não houve efeitos DOS para todas as medidas musculares do embrião do dia 18 (P > 0,24; Figura 3). Não houve efeitos DOS para peitoral de filhote eclodido principais medidas de comprimento e largura muscular (P > 0,26); no entanto, os DOS afetaram o peso e a profundidade muscular (P < 0,03;

Discussão

Até o momento, o Laboratório Gonzalez da Universidade da Geórgia é o único grupo a demonstrar efeitos positivos da nicotinamida riboside no ovo alimentando-se de peitoral grande desenvolvimento muscular e crescimento. O primeiro estudo descobriu que na alimentação ovo de 250 mM nicotinamida riboside aumentou o peso muscular e as dimensões quando injetado no saco de gema⁹. No estudo de acompanhamento, a injeção de dose de nicotinamida ribosídeo na gema, semelha...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air-Tite™ Sterile Hypodermic Needles- 20 G; 1 inch	Fisher Scientific	14-817-208	https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-hypodermic-needles-32/p-7182916#?keyword=
Analytical Balance	VWR	VWR-214B2	https://us.vwr.com/store/product/20970740/vwr-b2-series-analytical-and-precision-balances
Complete Dissection Set	DOCAZON	DK1001	https://www.amazon.com/DOCAZON-Complete-Dissection-Set-Dissecting/dp/B07VBHKSW3
Fisherbrand™ Isotemp™ General Purpose Deluxe Water Baths	Fisher Scientific	FSGPD02	https://www.fishersci.com/shop/products/isotemp-general-purpose-water-baths/p-6448020
Fisherbrand™ Sterile Syringes for Single Use	Fisher Scientific	14-955-464	https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/p-7114739#?keyword=
HIGH INTENSITY EGG CANDLER	Titan Incubators	N/A	https://www.titanincubators.com/collections/egg-candlers/products/egg-candler-high-intensity
Infrared Forehead Thermometer	HALIDODO	XZ-001
Microsoft Excel	Microsoft	N/A
Neiko Tools Digital Caliper	Neiko Tools	01408A	https://www.amazon.com/Neiko-01407A-Electronic-Digital-Stainless/dp/B000NEA0P8?th=1
Nexcare Absolute Waterproof Tape	Nexcare Brand	732	https://www.nexcare.com/3M/en_US/nexcare/products/catalog/~/Nexcare-Absolute-Waterproof-Tape/?N=4326+3294529207+3294631805 &rt=rud
Pen Size Temperature and Humidity USB Data Logger with Display	Omega	OM-HL-SP-TH	https://www.omega.com/en-us/temperature-measurement/temperature-and-humidity-data-loggers/p/OM-HL-SP-Series
SAS 9.4 for Windows	SAS Institute	N/A	https://www.sas.com/en_us/home.html
Sportsman 1502 Incubator	GQF Manufacturing	1502	https://www.gqfmfg.com/item/1502-digital-sportsman/
Tru Niagen (Nicotinamide riboside)	ChromaDex, Inc.	N/A	https://www.truniagen.com/truniagen-300mg/ - note, contact company for pure product
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