В городе Ово Кормление коммерческими яйцами бройлеров: точный и воспроизводимый метод воздействия на развитие и рост мышц

Резюме

Была разработана надежная методология для проведения исследований в ово-кормлении с использованием некубированных коммерческих яиц бройлеров для проверки способности природных и синтетических соединений, в данном случае никотинамид рибозида, влиять на развитие и рост мышц.

Аннотация

В течение последних трех десятилетий ученые из красного мяса и птицы сосредоточились на разработке стратегий и технологий для манипулирования развитием мышц во время эмбрионального и внутриутробного развития. Эта область продолжает оставаться областью внимания, потому что количество мышечных волокон устанавливается в течение этого времени и определяет основу для всего будущего роста. На птицеводстве многочисленные исследования продемонстрировали в ово-кормлении факторы роста, витамины или другие питательные вещества, улучшающие эмбриональное развитие мышц и кишечника цыплят. Улучшение развития ово-мышц может принести пользу птицеводческой промышленности, возможно, влияя на выход мяса, скорость роста или условия миопатии. В течение последних пяти лет лаборатория Гонсалеса в Университете Джорджии разработала методологию никотинамидного рибозида в ово-кормлении эмбрионов бройлеров-цыплят, которая изменила развитие мышц. При введении в желточный мешок развивающегося эмбриона никотинамид рибозид увеличивал массу большой мышечной массы грудной клетки и плотность мышечных волокон при вылуплении. Этот протокол продемонстрирует методологию точного и воспроизводимого проведения исследований в ово-кормлении с использованием коммерческих стандартных и высокопродуктивных эмбрионов бройлеров. Эти данные и методы позволят другим исследовательским группам выполнять исследования кормления ово с большим успехом и воспроизводимостью.

Введение

С 1960 года потребление мяса птицы на душу населения в Соединенных Штатах росло с поразительной скоростью, в то время как другие первичные источники белка оставались на прежнем уровне, снижались или минимально увеличивались. Птицеводческая промышленность вложила значительное время и исследовательские усилия в оптимизацию питания и генетики, чтобы произвести эффективную птицу, чтобы не отставать от спроса. Поскольку основной целью птицеводческой промышленности является производство мышц для преобразования в мясо, их усилия резко изменили конечную мышечную массу птицы при сборе урожая.

Как и большинство видов, домашняя птица развивает мышцы двухфазным образом. Первичный миогенез использует мезенхимальные стволовые клетки для производства первичных мышечных волокон, которые служат каркасом для второй волны развития мышечных волокон¹. У домашней птицы первичный миогенез происходит в период эмбриональных дней с 3 по 8, а вторичный миогенез происходит с 8 по 21^{2 день}. После развития первичные и вторичные мышечные волокна служат основой для всего будущего роста мышц посредством клеточной гипертрофии. Поэтому ученые и промышленность потратили значительные усилия, пытаясь манипулировать первичным и вторичным миогенезом у всех видов, производящих мясо, чтобы максимизировать выход мяса.

Одна из технологий, исследованных в птицеводстве, называемая ово-кормлением, включает в себя кормление соединений через инъекции. В ово-кормлении, технология, используемая птицеводческой промышленностью в течение почти 40 лет, была первоначально разработана для введения^{вакцины 3}. В литературе зафиксировано, что при ово-питании различными соединениями и питательными веществами в разные периоды развития и локализации внутри яйца положительно влияют на развитие и рост ово мышц ^4,5,6. На сегодняшний день лаборатория Гонсалеса в Университете Джорджии является пионером в использовании никотинамид рибозида в ово-кормлении для манипулирования развитием мышц птицы.

Никотинамид рибозид, пиридин-нуклеозидный аналог витамина B3, продуцирует NAD+ через путь спасения⁷. Поскольку этот путь использует меньше ферментативных стадий для производства NAD+, производство является наиболее эффективным⁸. Гонсалес и Джексон⁹ продемонстрировали, что добавление развивающегося желтка эмбриона бройлера с никотинамидным рибозидом увеличивает вылупившегося цыпленка грудной клетки большую мышечную массу и плотность мышечных волокон. Позже это было подтверждено Xu et ^al.10, которые обнаружили, что увеличение дозы никотинамида рибозида увеличивает мышечную массу и увеличивает плотность мышечных волокон. Эти первые два исследования были проведены на коммерческом бройлере. Поскольку высокопродуктивные бройлеры обладают более значительным генетическим потенциалом для конечного размера мышечной массы, целью исследования было определение влияния дозы никотинамида рибозида на высокопродуктивного бройлера, вылупившегося цыпленка грудной клетки, основное развитие мышц и рост при вылуплении.

протокол

Все методологии были одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Университета Джорджии.

1. Инкубация яйцеклеток и назначение лечения

1. Закупка и обработка яиц
   1. Получите некульбированные, оплодотворенные высокопродуктивные яйца бройлеров и транспортируйте их в лабораторию.
   2. Осматривайте и выбрасывайте яйца, считающиеся некачественными.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Исключите деформированные яйца (круглые, удлиненные, плитчатые), потрескавшиеся, грязные / окрашенные, тонкой скорлупой и морщинистые. Это важно для минимизации риска тухлых яиц.
   3. Назначайте отдельные номера яиц, взвешивайте и записывайте номера и веса яиц в программном обеспечении для работы с электронными таблицами.
   4. Используйте программное обеспечение для работы с электронными таблицами для сортировки яиц по весу.
      1. Выделите столбцы количество яиц и вес яйца .
      2. Выберите вкладку Данные , а затем Сортировка - сортировка данных по весу яйца от самого маленького до самого большого.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Для наилучшей скорости вылупления используйте яйца весом от 40 до 70 г.
      3. Исходя из конструкции эксперимента, назначают яйцеклеткам (в числовом или алфавитном порядке) инъекционное лечение и день эвтаназии. Введите количество лечения и день эвтаназии в отдельные столбцы и случайным образом назначьте эти факторы в пределах каждого слоя.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Для этой публикации методы лечения были случайным образом распределены в пределах каждого 8-яичного слоя.
   5. Создайте сводную таблицу в программном обеспечении для работы с электронными таблицами, чтобы убедиться, что каждая обработка имеет одинаковый начальный вес яйцеклеток.
      1. Выделите все данные в электронной таблице для анализа.
      2. Выберите параметр Сводная таблица на вкладке Вставка .
      3. Выберите независимую переменную (столбец «День эвтаназии ») в подокне «Поля сводной таблицы» и перетащите его в поле «Строки ».
      4. Выберите независимую переменную (столбец «Лечение ») в подокне B и перетащите его в поле «Строки» в разделе «День эвтаназии».
      5. Выберите интересующую зависимую переменную (Вес яйца) и перетащите ее в поле «Значения ».
      6. Измените параметры поля «Значение », щелкнув зависимую переменную и выбрав Параметры поля значения.
         1. Измените значение параметра на Среднее.
2. Назначение лотка
   1. В программном обеспечении для работы с электронными таблицами назначайте яйца в лоток (в числовом или алфавитном порядке), чтобы обработки были одинаково представлены в лотке.
      1. Назначают первые четыре яйца с назначенными процедурами на лоток 1. Назначьте следующие четыре яйца в лоток 2 и продолжайте до тех пор, пока все яйца не будут назначены на лоток.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг будет варьироваться в зависимости от количества инкубаторов и лотков, используемых в эксперименте.
3. Убедитесь, что все обработки одинаково представлены на панели задач с помощью функции сводной таблицы .
   1. Выделите все данные в электронной таблице для анализа.
   2. Выберите параметр Сводная таблица на вкладке Вставка .
   3. Выберите независимую переменную (столбец области уведомлений ) во вложенном окне Поля сводной таблицы и перетащите его в поле Строки .
   4. Выберите интересующую зависимую переменную (Вес яйца) и перетащите ее в поле «Значения ».
   5. Измените параметры поля «Значение », щелкнув зависимую переменную и выбрав Параметры поля значения.
      1. Измените параметр на Счетчик.
4. Инкубация
   1. Поместите яйца в соответствующий инкубационный лоток и предварительно инкубируйте их при 26,6 °C с 40% ± 4% относительной влажности в течение 6 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые инкубаторы имеют системы самоконтроля, которые могут быть не совсем точными. Используйте другие устройства контроля температуры и влажности для контроля условий.
   2. Увеличьте температуру инкубатора до 37 °C с 40% ± 4% относительной влажности и поддерживайте эти условия до 18-го дня инкубации.
      1. Чтобы обеспечить надлежащую температуру инкубатора, измеряйте температуру поверхности нескольких яиц по всему инкубатору два раза в день с помощью термометра тепловой поверхности, чтобы убедиться, что температура поверхности составляет 37 ° C.
   3. Поворачивайте яйца ежечасно, чтобы изменить положение.
   4. Регистрируйте вес яиц ежедневно, чтобы обеспечить потерю веса яиц на 10-12,5% в течение первых 18,5 дней инкубации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если потеря веса не находится в нужном диапазоне, отрегулируйте (увеличьте или уменьшите) влажность.
5. Инкубационный день-10 в ово инъекциях
   1. Рассчитайте количество никотинамида рибозида, необходимого для каждого лечения, используя вес формулы 290,07 г / моль, с 100 мкл раствора, введенного в желточный мешок каждого яйца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стерильный физиологический раствор (0,9%) раствор будет использоваться в качестве разбавителя для всех растворов.
      Расчет: 50 яиц × 100 мкл = 5000 мкл (5 мл) необходимого раствора. Округлите до 6 мл, чтобы обеспечить наличие достаточного количества раствора для инъекций (рисунок 1).
      1. После того, как растворы сделаны, поместите их в водяную баню 37 ° C, чтобы сохранить их при температуре яиц.
   2. Вынимайте яйца из инкубатора по одному лотку за раз и накрывайте теплым полотенцем.
   3. Свечное яйцо для расположения желточного мешочка и очистки области инъекции 70% этанолом.
   4. Вводят стерильную 20 г, 2,54 см подкожную иглу ~1 см в яичную скорлупу и вводят назначенную дозу в желточный мешок. Вводят яйца из 0 мМ никотинамида рибозида со 100 мкл стерильного физиологического раствора (0,9%).
   5. Немедленно накройте место инъекции небольшим кусочком абсолютной водонепроницаемой ленты, чтобы избежать чрезмерной потери влаги.
   6. После того, как все яйца прошли обработку, поместите лоток обратно в инкубатор.
   7. На 18-й день инкубации извлеките яйца из лотков и поместите их в инкубационные ящики в соответствии с их обработкой.
   8. Поместите инкубатор в инкубатор и увеличьте влажность до 60 ± 2% до тех пор, пока не вылупятся все яйца или до 23-го дня инкубации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если яйца не содержат эмбриона при ковырянии, выбросьте яйцо. Это предотвратит возникновение тухлых яиц.

2. Забор образцов основных мышц эвтаназии и грудной клетки

1. Эвтаназия цыплят
   1. На 18-й день инкубации вынимают эмбриональные яйца из инкубатора и помещают их при комнатной температуре на 1 ч, чтобы прекратился метаболизм. Извлеките эмбрионы из яиц, взвесьте без желточного мешка, а затем обезглавливайте. Через 12 часов после вылупления усыпните птенцов под воздействием CO₂ в течение 10 мин, взвесьте, быстро соберите размер кроны до крестца, а затем обезглавливайте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тот факт, что у птицы больше нет головы, обеспечивает эвтаназию.
   2. Рассмотрим следующие измерения (этапы 2.1.2.1-2.1.2.4) с использованием цифровых суппортов для эмбрионов и цыплят.
      1. Для определения длины от кроны до крестца уложите птенца на бок с заправленной вниз головой и ногами под телом. Измерьте от макушки головы до хвоста.
      2. Чтобы измерить ширину головы, измерьте от одного ушного отверстия до другого ушного отверстия.
      3. Для определения длины головы измеряйте от задней части клюва до задней части черепа.
      4. Возьмите неэластичную веревку и оберните ее вокруг черепа от одного отверстия уха до другого, чтобы измерить окружность головы. Поместите строку на метрическую линейку, чтобы получить измерение.
   3. Соберите окружность груди, обернув веревку вокруг груди, под которой крылья соприкасаются с телом и поместив струну на метрическую линейку, чтобы получить измерение.
   4. Опрыскивайте грудь 70% этанолом и пальцами потяните перья и кожу, чтобы выявить основные грудные мышцы и проведите измерения (шаги 2.1.4.1-2.1.4.2) цифровыми суппортами.
      1. Чтобы определить ширину груди, измерьте поперек груди, где крылья соприкасаются с телом.
      2. Для определения длины груди измеряют от нижней части ключицы до верхней части жировой подушки.
2. Экстракция большой грудной мышцы, измерение и сбор
   1. С помощью хирургических ножниц или скальпеля и щипцов удалите правую большую грудную мышцу, разрезав вдоль килевой кости и освободив мышцу от стенки тела.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что вы не собираете малую грудную мышцу, визуально определяя, что мышца остается на грудной клетке.
   2. После удаления большой грудной мышцы положите мышцу плоско на палочку эскимо и соберите следующие измерения (шаги 2.2.2.1-2.2.2.3) с помощью цифровых суппортов.
      1. Для определения длины мышцы измерьте от черепной до каудальной части мышцы.
      2. Для определения ширины мышцы измеряют в самой широкой части черепной части мышцы.
      3. Для определения толщины мышц подберите грудь щипцами и отмерьте на самом толстом участке черепной части мышцы.
   3. При желании храните эту мышцу и левую большую грудную мышцу для дальнейших анализов (таких как гистология, экспрессия белка и генов и т. Д.) При -80 ° C в течение года.

3. Статистика

1. Анализируйте данные как полностью рандомизированный дизайн с яйцом / цыпленком в качестве экспериментальной единицы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Доза никотинамида рибозида (DOS) служила фиксированным эффектом. Все данные анализировались с помощью программного обеспечения для статистического анализа (см. Таблицу материалов) и вычислялись попарные сравнения между наименьшими квадратными средствами обработки. Различия были признаны значительными при P < 0,05.

Результаты

Не было выявлено эффектов DOS для массы тела эмбрионов 18-го дня и вылупившихся цыплят (P > 0,52; Рисунок 2). Не было никаких эффектов DOS для всех измерений основных мышц грудной клетки эмбриона на 18-й день (P > 0,24; Рисунок 3). Не было выявлено эффектов D...

Обсуждение

На сегодняшний день лаборатория Гонсалеса в Университете Джорджии является единственной группой, которая продемонстрировала положительное влияние никотинамид рибозида в ово , питаясь грудными мышцами, на развитие и рост основных мышц грудной клетки . Первое исследование по...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air-Tite™ Sterile Hypodermic Needles- 20 G; 1 inch	Fisher Scientific	14-817-208	https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-hypodermic-needles-32/p-7182916#?keyword=
Analytical Balance	VWR	VWR-214B2	https://us.vwr.com/store/product/20970740/vwr-b2-series-analytical-and-precision-balances
Complete Dissection Set	DOCAZON	DK1001	https://www.amazon.com/DOCAZON-Complete-Dissection-Set-Dissecting/dp/B07VBHKSW3
Fisherbrand™ Isotemp™ General Purpose Deluxe Water Baths	Fisher Scientific	FSGPD02	https://www.fishersci.com/shop/products/isotemp-general-purpose-water-baths/p-6448020
Fisherbrand™ Sterile Syringes for Single Use	Fisher Scientific	14-955-464	https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/p-7114739#?keyword=
HIGH INTENSITY EGG CANDLER	Titan Incubators	N/A	https://www.titanincubators.com/collections/egg-candlers/products/egg-candler-high-intensity
Infrared Forehead Thermometer	HALIDODO	XZ-001
Microsoft Excel	Microsoft	N/A
Neiko Tools Digital Caliper	Neiko Tools	01408A	https://www.amazon.com/Neiko-01407A-Electronic-Digital-Stainless/dp/B000NEA0P8?th=1
Nexcare Absolute Waterproof Tape	Nexcare Brand	732	https://www.nexcare.com/3M/en_US/nexcare/products/catalog/~/Nexcare-Absolute-Waterproof-Tape/?N=4326+3294529207+3294631805 &rt=rud
Pen Size Temperature and Humidity USB Data Logger with Display	Omega	OM-HL-SP-TH	https://www.omega.com/en-us/temperature-measurement/temperature-and-humidity-data-loggers/p/OM-HL-SP-Series
SAS 9.4 for Windows	SAS Institute	N/A	https://www.sas.com/en_us/home.html
Sportsman 1502 Incubator	GQF Manufacturing	1502	https://www.gqfmfg.com/item/1502-digital-sportsman/
Tru Niagen (Nicotinamide riboside)	ChromaDex, Inc.	N/A	https://www.truniagen.com/truniagen-300mg/ - note, contact company for pure product
Wood Craft Sticks	Creatology	M20001547	https://www.michaels.com/wood-craft-sticks-by-creatology/M20001547.html