In zona Ovo Alimentazione di uova di pollo commerciali: un metodo accurato e riproducibile per influenzare lo sviluppo e la crescita muscolare

Riepilogo

È stata sviluppata una solida metodologia per condurre studi di ricerca sull'alimentazione ovo utilizzando uova di pollo commerciali non incubate per testare la capacità di composti naturali e sintetici, in questo caso, nicotinamide riboside, di influenzare lo sviluppo e la crescita muscolare.

Abstract

Negli ultimi tre decenni, gli scienziati della carne rossa e del pollame si sono concentrati sullo sviluppo di strategie e tecnologie per manipolare lo sviluppo muscolare durante lo sviluppo embrionale e fetale. Quest'area continua ad essere un'area di interesse perché il numero di fibre muscolari viene stabilito durante questo periodo e determina la base per tutta la crescita futura. Nel pollame, numerosi studi hanno dimostrato che l'alimentazione ovo di fattori di crescita, vitamine o altri nutrienti ha migliorato il muscolo embrionale del pulcino e lo sviluppo intestinale. Il miglioramento dello sviluppo muscolare ovo potrebbe avvantaggiare l'industria avicola influenzando eventualmente la resa della carne, il tasso di crescita o le condizioni di miopatia. Negli ultimi cinque anni, il Gonzalez Laboratory dell'Università della Georgia ha sviluppato un riboside nicotinamide nella metodologia di alimentazione ovo per embrioni di pollo da carne, che ha alterato lo sviluppo muscolare. Quando iniettato nel sacco vitellino di un embrione in via di sviluppo, la nicotinamide riboside aumentava il peso muscolare maggiore pettorale e la densità delle fibre muscolari al portello. Questo protocollo dimostrerà una metodologia per condurre in modo accurato e riproducibile studi di alimentazione ovo utilizzando embrioni di polli da carne commerciali standard e ad alto rendimento. Questi dati e metodi consentiranno ad altri gruppi di ricerca di eseguire studi sull'alimentazione ovo con molto successo e riproducibilità.

Introduzione

Dal 1960, il consumo pro capite degli Stati Uniti di carne di pollame è aumentato a un ritmo sorprendente, mentre altre fonti proteiche primarie sono rimaste stagnanti, diminuite o minimamente aumentate. L'industria avicola ha investito molto tempo e sforzi di ricerca ottimizzando la nutrizione e la genetica per produrre un uccello efficiente per tenere il passo con la domanda. Poiché l'obiettivo principale dell'industria avicola è quello di produrre muscoli per la conversione in carne, i loro sforzi hanno drasticamente cambiato la massa muscolare finale dell'uccello al momento del raccolto.

Come la maggior parte delle specie, il pollame sviluppa il muscolo in modo bifasico. La miogenesi primaria utilizza cellule staminali mesenchimali per produrre fibre muscolari primarie, che fungono da impalcatura per la seconda ondata di sviluppo delle fibre muscolari¹. Nel pollame, la miogenesi primaria si verifica durante i giorni embrionali da 3 a 8 e la miogenesi secondaria avviene dai giorni 8 a 21². Una volta sviluppate, le fibre muscolari primarie e secondarie fungono da base per tutta la futura crescita muscolare attraverso l'ipertrofia cellulare. Pertanto, gli scienziati e l'industria hanno speso notevoli sforzi nel tentativo di manipolare la miogenesi primaria e secondaria in tutte le specie produttrici di carne per massimizzare la resa della carne.

Una tecnologia esplorata nel pollame, chiamata alimentazione ovo, prevede l'alimentazione di composti attraverso l'iniezione. Nell'alimentazione ovo, una tecnologia impiegata dall'industria avicola per quasi 40 anni, è stata inizialmente sviluppata per la somministrazione del vaccino³. La letteratura documenta che nell'alimentazione ovo di vari composti e nutrienti in diversi periodi di sviluppo e posizioni all'interno dell'uovo hanno influenzato positivamente lo sviluppo e la crescita del muscolo ovo ^4,5,6. Ad oggi, il Gonzalez Laboratory dell'Università della Georgia è il pioniere nell'utilizzo della nicotinamide riboside nell'alimentazione dell'ovo per manipolare lo sviluppo muscolare del pollame.

Nicotinamide riboside, un analogo piridina-nucleosidico della vitamina B3, produce NAD+ attraverso la via di salvataggio⁷. Poiché questo percorso utilizza meno passaggi enzimatici per produrre NAD+, la produzione è la più efficiente⁸. Gonzalez e Jackson⁹ hanno dimostrato che l'integrazione dello sviluppo del sacco vitellino dell'embrione di pollo con nicotinamide riboside ha aumentato il peso muscolare maggiore del pulcino tratteggiato e la densità delle fibre muscolari. Ciò è stato successivamente confermato da Xu et ^al.10, che hanno scoperto che l'aumento della dose di nicotinamide riboside aumentava il peso muscolare e aumentava la densità delle fibre muscolari. Questi primi due studi sono stati condotti in un pollaio a resa commerciale. Poiché i polli da carne ad alto rendimento possiedono un potenziale genetico più significativo per la dimensione finale della massa muscolare, l'obiettivo dello studio era determinare gli effetti della dose di nicotinamide riboside sulla dose di nicotinamide riboside sul broiler ad alto rendimento schiuso pulcino pettorale maggiore sviluppo muscolare e crescita al portello.

Protocollo

Tutte le metodologie sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università della Georgia.

1. Incubazione delle uova e somministrazione del trattamento

1. Approvvigionamento di uova e assegnazione del trattamento
   1. Ottenere uova di pollo ad alto rendimento non incubate e fecondate e trasportarle in laboratorio.
   2. Ispezionare e scartare le uova ritenute di scarsa qualità.
      NOTA: Eliminare le uova deformi (rotonde, allungate, con lastra), screpolate, sporche / macchiate, a guscio sottile e rugose. Questo è importante per ridurre al minimo il rischio di uova marce.
   3. Assegna singoli numeri di uova, pesa e registra numeri e pesi di uova in un programma software per fogli di calcolo.
   4. Utilizza il programma software per fogli di calcolo per ordinare le uova in base al peso.
      1. Evidenzia le colonne del numero dell'uovo e del peso dell'uovo .
      2. Seleziona la scheda Dati e quindi Ordina - ordina i dati in base al peso dell'uovo dal più piccolo al più grande.
         NOTA: per la migliore velocità di schiusa, utilizzare uova di peso compreso tra 40 e 70 g.
      3. Sulla base del design dell'esperimento, assegnare alle uova (numericamente o alfabeticamente) un trattamento di iniezione e il giorno dell'eutanasia. Inserisci il numero di trattamento e il giorno dell'eutanasia in colonne separate e assegna casualmente questi fattori all'interno di ogni strato.
         NOTA: Per questa pubblicazione, i trattamenti sono stati assegnati in modo casuale all'interno di ogni strato di 8 uova.
   5. Generare una tabella pivot all'interno del programma software del foglio di calcolo per garantire che ogni trattamento possieda pesi di uova iniziali simili.
      1. Evidenzia tutti i dati all'interno del foglio di calcolo da analizzare.
      2. Selezionare l'opzione Tabella pivot nella scheda Inserisci .
      3. Selezionare la variabile indipendente (colonna Giorno dell'eutanasia ) all'interno della sottofinestra Campi tabella pivot e trascinare nel campo Righe .
      4. Selezionare la variabile indipendente (colonna Trattamento ) all'interno della sottofinestra B e trascinare nel campo Righe , in Giorno dell'eutanasia.
      5. Selezionare la variabile dipendente di interesse (Peso uovo) e trascinarla nel campo Valori .
      6. Modificare le impostazioni del campo Valore facendo clic sulla variabile dipendente e selezionando Impostazioni campo valore.
         1. Modificare l'impostazione su Media.
2. Assegnazione vassoio
   1. Nel programma software del foglio di calcolo, assegna le uova a un vassoio (numericamente o alfabeticamente), in modo che i trattamenti siano ugualmente rappresentati all'interno di un vassoio.
      1. Assegnare le prime quattro uova con trattamenti assegnati al vassoio 1. Assegnare le quattro uova successive al vassoio 2 e continuare fino a quando tutte le uova non vengono assegnate a un vassoio.
         NOTA: questo passaggio varia a seconda del numero di incubatori e vassoi utilizzati nell'esperimento.
3. Assicurarsi che tutti i trattamenti siano rappresentati in modo uguale su un vassoio utilizzando la funzione Tabella pivot .
   1. Evidenzia tutti i dati all'interno del foglio di calcolo da analizzare.
   2. Selezionare l'opzione Tabella pivot nella scheda Inserisci .
   3. Selezionare la variabile indipendente (colonna Vassoio ) all'interno della sottofinestra Campi tabella pivot e trascinare nel campo Righe .
   4. Selezionare la variabile dipendente di interesse (Peso uovo) e trascinarla nel campo Valori .
   5. Modificare le impostazioni del campo Valore facendo clic sulla variabile dipendente e selezionando Impostazioni campo valore.
      1. Modificare l'impostazione in Conteggio.
4. Incubazione
   1. Mettere le uova nel vassoio di incubazione appropriato e pre-incubarle a 26,6 °C con il 40% di ± il 4% di umidità relativa per 6 ore.
      NOTA: alcuni incubatori dispongono di sistemi di automonitoraggio che potrebbero non essere del tutto accurati. Utilizzare altri dispositivi di monitoraggio della temperatura e dell'umidità per controllare le condizioni.
   2. Aumentare la temperatura dell'incubatore a 37 °C con il 40% di umidità relativa ± il 4% e mantenere queste condizioni fino al giorno di incubazione 18.
      1. Per garantire una corretta temperatura dell'incubatore, misurare le temperature superficiali di diverse uova in tutto l'incubatore due volte al giorno con un termometro termico di superficie per garantire che le temperature superficiali siano di 37 °C.
   3. Ruotare le uova ogni ora per riposizionare.
   4. Registra i pesi delle uova ogni giorno per garantire una perdita di peso delle uova del 10% -12,5% durante i primi 18,5 giorni di incubazione.
      NOTA: se la perdita di peso non rientra nell'intervallo desiderato, regolare (aumentare o diminuire) l'umidità.
5. Incubazione giorno-10 in iniezioni di ovo
   1. Calcolare la quantità di nicotinamide riboside necessaria per ogni trattamento utilizzando il peso della formula di 290,07 g/mol, con 100 μL di soluzione iniettata nel sacco vitellino di ciascuna uova.
      NOTA: la soluzione salina sterile (0,9%) sarà utilizzata come diluente per tutte le soluzioni.
      Calcolo: 50 uova × 100 μL = 5.000 μL (5 mL) di soluzione necessaria. Arrotondare fino a 6 ml per garantire che sia disponibile una soluzione iniettabile sufficiente (Figura 1).
      1. Una volta realizzate le soluzioni, metterle a bagnomaria a 37 °C per mantenerle alla temperatura delle uova.
   2. Rimuovere le uova dall'incubatrice un vassoio alla volta e coprire con un asciugamano caldo.
   3. Uovo di candela per localizzare il sacco vitellino e pulire l'area di iniezione con etanolo al 70%.
   4. Inserire un ago ipodermico sterile da 20 G, 2,54 cm ~ 1 cm nel guscio d'uovo e iniettare la dose assegnata nel sacco vitellino. Iniettare gli ovuli dal trattamento con nicotinamide riboside 0 mM con 100 μL di soluzione salina sterile (0,9%).
   5. Coprire immediatamente il sito di iniezione con un piccolo pezzo di nastro impermeabile assoluto per evitare un'eccessiva perdita di umidità.
   6. Una volta che tutte le uova hanno ricevuto il loro trattamento, riposizionare il vassoio nell'incubatrice.
   7. Il giorno di incubazione 18, rimuovere le uova dai vassoi e metterle in scatole da cova secondo i loro trattamenti.
   8. Posizionare le scatole da cova nell'incubatrice e aumentare l'umidità a 60 ± 2% fino a quando tutte le uova si schiudono o fino al giorno 23 di incubazione.
      NOTA: Se le uova non contengono un embrione al momento della canditura, scartare l'uovo. Ciò impedirà il verificarsi di uova marce.

2. Eutanasia e raccolta di campioni muscolari principali pettorali

1. Eutanasia del pulcino
   1. Il giorno di incubazione 18, rimuovere le uova embrionali dall'incubatrice e metterle a temperatura ambiente per 1 ora per cessare il metabolismo. Rimuovere gli embrioni dalle uova, pesare senza il sacco vitellino e quindi decapitare. 12 ore dopo la schiusa, eutanasizzare i pulcini per esposizione a CO₂ per 10 minuti, pesare, raccogliere rapidamente la misurazione della lunghezza da corona a groppa e quindi decapitare.
      NOTA: Il fatto che l'uccello non abbia più la testa garantisce l'eutanasia.
   2. Si considerino le seguenti misurazioni (passaggi 2.1.2.1-2.1.2.4) utilizzando pinze digitali per embrioni e pulcini.
      1. Per determinare la lunghezza da corona a groppa, appoggia il pulcino su un fianco con la testa infilata verso il basso e le gambe sotto il corpo. Misura dalla cima della testa alla coda.
      2. Per misurare la larghezza della testa, misurare da un foro dell'orecchio all'altro foro dell'orecchio.
      3. Per determinare la lunghezza della testa, misurare dalla parte posteriore del becco alla parte posteriore del cranio.
      4. Prendi una corda non elastica e avvolgila attorno al cranio da un foro per l'orecchio all'altro per misurare la circonferenza della testa. Posizionare la stringa su un righello metrico per ottenere una misurazione.
   3. Raccogli la circonferenza del torace avvolgendo una corda attorno al torace, sotto il punto in cui le ali entrano in contatto con il corpo e posizionando la corda su un righello metrico per ottenere la misurazione.
   4. Spruzzare il seno con etanolo al 70% e, usando le dita, tirare le piume e la pelle per rivelare i muscoli principali pettorali e prendere le misure (passi 2.1.4.1-2.1.4.2) con pinze digitali.
      1. Per determinare la larghezza del torace, misurare attraverso il torace dove le ali entrano in contatto con il corpo.
      2. Per determinare la lunghezza del torace, misurare dal fondo della clavicola alla parte superiore del cuscinetto di grasso.
2. Estrazione del muscolo maggiore pettorale , misurazione e raccolta
   1. Usando forbici chirurgiche o bisturi e pinze, rimuovere il muscolo maggiore pettorale destro tagliando lungo l'osso della chiglia e rilasciando il muscolo dalla parete del corpo.
      NOTA: Assicurarsi di non raccogliere il muscolo pettorale minore identificando visivamente che il muscolo rimane sulla gabbia toracica.
   2. Dopo aver rimosso il muscolo maggiore pettorale , appoggiare il muscolo su un bastoncino di ghiacciolo e raccogliere le seguenti misurazioni (passaggi 2.2.2.1-2.2.2.3) utilizzando pinze digitali.
      1. Per determinare la lunghezza muscolare, misurare dalla porzione cranica a quella caudale del muscolo.
      2. Per determinare la larghezza muscolare, misurare nella parte più ampia della parte cranica del muscolo.
      3. Per determinare lo spessore muscolare, raccogliere il seno con una pinza e misurare la parte più spessa della parte cranica del muscolo.
   3. Se lo si desidera, conservare questo muscolo e il muscolo maggiore pettorale sinistro per ulteriori analisi (come istologia, proteine ed espressione genica, ecc.) a -80 °C per un massimo di un anno.

3. Statistiche

1. Analizza i dati come un design completamente randomizzato con uovo / pulcino come unità sperimentale.
   NOTA: La dose di nicotinamide riboside (DOS) è servita come effetto fisso. Tutti i dati sono stati analizzati con un programma software di analisi statistica (vedi Tabella dei materiali) e sono stati calcolati confronti a coppie tra i mezzi di trattamento meno quadrati. Le differenze sono state considerate significative a P < 0,05.

Risultati

Non ci sono stati effetti DOS per il peso corporeo degli embrioni del giorno 18 e dei pulcini nati (P > 0,52; Figura 2). Non ci sono stati effetti DOS per tutte le misurazioni muscolari maggiori pettorali embrionali del giorno 18 (P > 0,24; Figura 3). Non ci sono stati effetti DOS per le misurazioni della lunghezza e della larghezza dei muscoli maggiori del cece pettorale tratteggiato (P > 0,26); tuttavia, DOS ha infl...

Discussione

Ad oggi, il Gonzalez Laboratory presso l'Università della Georgia è l'unico gruppo a dimostrare gli effetti positivi della nicotinamide riboside nell'ovo che si nutre di sviluppo e crescita muscolare maggiore pettorale . Il primo studio ha rilevato che nell'alimentazione ovo di 250 mM nicotinamide riboside aumentava il peso e le dimensioni muscolari quando iniettato nel sacco vitellino⁹. Nello studio di follow-up, l'iniezione di nicotinamide riboside in aumento della d...

Materiali

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