오보에서 상업용 육계 달걀 먹이기 : 근육 발달과 성장에 영향을 미치는 정확하고 재현 가능한 방법

요약

인큐베이션되지 않은 상업용 육계 알을 활용하여 근육 발달과 성장에 영향을 미치는 천연 및 합성 화합물, 이 경우 니코틴 아미드 리보시드의 능력을 테스트하기 위해 난소 수유 연구 시험을 수행하기 위해 강력한 방법론이 개발되었습니다.

초록

지난 삼십 년 동안 붉은 고기와 가금류 과학자들은 배아 및 태아 발달 중에 근육 발달을 조작하기위한 전략과 기술을 개발하는 데 중점을 두었습니다. 이 영역은 근육 섬유 수가이 시간 동안 확립되고 모든 미래 성장을위한 기초를 결정하기 때문에 계속 초점 영역이됩니다. 가금류에서는 성장 인자, 비타민 또는 기타 영양소의 난소 먹이에서 병아리 배아 근육과 장 발달을 개선 한 수많은 연구가 입증되었습니다. 난소 근육 발달의 개선은 육류 수확량, 성장 속도 또는 근병증 조건에 영향을 미침으로써 가금류 산업에 도움이 될 수 있습니다. 지난 다섯 년 동안 조지아 대학의 곤잘레스 연구소는 육계-닭 배아 에 대한 난소 먹이 방법론에서 니코틴아미드 리보시드를 개발하여 근육 발달을 변화시켰습니다. 발달중인 배아의 노른자 주머니에 주입했을 때, 니코틴 아미드 리보시드는 부화시 가슴 근육 무게와 근육 섬유 밀도 를 증가 시켰습니다. 이 프로토콜은 상업적 표준 및 고수율 육계 배아를 활용하여 난소 수유 연구에서 정확하고 재현 가능하게 수행하는 방법론을 입증 할 것입니다. 이러한 데이터와 방법을 통해 다른 연구 그룹은 많은 성공과 재현성을 갖춘 난소 수유 연구를 수행 할 수 있습니다.

서문

1960 년 이래로 미국의 가금류로 인한 육류의 일인당 소비량은 놀라운 속도로 증가한 반면, 다른 주요 단백질 공급원은 정체, 감소 또는 최소 증가로 유지되었습니다. 가금류 산업은 수요를 따라 잡을 수있는 효율적인 새를 생산하기 위해 영양과 유전학을 최적화하는 데 상당한 시간과 연구 노력을 투자했습니다. 가금류 산업의 주요 목표는 고기로의 전환을위한 근육을 생산하는 것이기 때문에 그들의 노력은 수확시 새의 궁극적 인 근육 질량을 크게 변화 시켰습니다.

대부분의 종과 마찬가지로, 가금류는 이분법 방식으로 근육을 발달시킵니다. 원발성 근형성은 중간엽 줄기 세포를 이용하여 일차 근섬유를 생산하며, 이는 근섬유 발달의 두 번째 파동을 위한 스캐폴드 역할을 한다¹. 가금류에서 일차 근형성은 배아 3 일에서 8 일 사이에 발생하고 2 차 근 형성은 8 일에서 21 일² 일까지 발생합니다. 일단 개발되면, 일차 및 이차 근육 섬유는 세포 비대를 통한 모든 미래 근육 성장의 기초가됩니다. 따라서 과학자들과 산업계는 육류 수확량을 극대화하기 위해 모든 육류 생산 종에서 일차 및 이차 근형성을 조작하려고 상당한 노력을 기울였습니다.

가금류에서 탐구 된 한 가지 기술은 난소 먹이기라고 불리며 주사를 통해 화합물을 공급하는 것입니다. 거의 40 년 동안 가금류 산업에서 채택 된 기술 인 ovo feeding에서 처음에는 백신 투여를 위해 개발되었습니다³. 문헌은 난자 내의 다른 발달 기간과 위치에서 다양한 화합물과 영양소의 난소 먹이가 난소 근육 발달 및 성장에 긍정적 인 영향을 미친다는 것을 문서화합니다 ^4,5,6. 현재까지 조지아 대학의 곤잘레스 연구소는 가금류 근육 발달을 조작하기 위해 난소 먹이에서 니코틴 아미드 리보시드를 활용하는 선구자입니다.

비타민 B3의 피리딘-뉴클레오시드 유사체인 니코틴아미드 리보시드는 구조 경로⁷을 통해 NAD+를 생산합니다. 이 경로는 NAD +를 생산하기 위해 더 적은 효소 단계를 활용하기 때문에 생산이 가장 효율적입니다⁸. 곤잘레스와 잭슨⁹ 은 니코틴아미드 리보시드를 사용한 육계 배아 노른자 낭을 보충하면 부화 병아리 가슴 뼈가 주요 근육 무게와 근육 섬유 밀도를 증가시킨다는 것을 입증했다. 이것은 나중에 Xu et ^al.10에 의해 확인되었는데, 그는 니코틴 아미드 리보시드 복용량이 증가하면 근육 무게가 증가하고 근육 섬유 밀도가 증가한다는 것을 발견했습니다. 이 처음 두 연구는 상업적 수확량 육계에서 수행되었습니다. 고수율 육계는 궁극적 인 근육 질량 크기에 대한보다 중요한 유전 적 잠재력을 가지고 있기 때문에이 연구의 목적은 고수율 육계가 부화 한 병아리 가슴 뼈 발달 및 부화시 성장에 대한 니코틴 아미드 리보시드 용량의 효과를 결정하는 것이 었습니다.

프로토콜

모든 방법론은 조지아 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다.

1. 계란 배양 및 치료 투여

1. 계란 조달 및 처리 과제
   1. 배양되지 않은 수정 된 고수율 육계 알을 얻어 실험실로 운반하십시오.
   2. 품질이 좋지 않은 것으로 간주되는 계란을 검사하고 폐기하십시오.
      참고 : 잘못된 모양의 계란 (둥글고, 길쭉하고, 슬래브 면), 금이 가고, 더러워 지거나 얼룩지고, 얇은 껍질과 주름을 제거하십시오. 이것은 썩은 알의 위험을 최소화하는 데 중요합니다.
   3. 스프레드시트 소프트웨어 프로그램에서 개별 계란 번호를 할당하고, 무게를 측정하고, 계란 번호와 가중치를 기록합니다.
   4. 스프레드 시트 소프트웨어 프로그램을 사용하여 계란을 무게로 정렬하십시오.
      1. 계란 번호와 계란 무게 열을 강조 표시합니다.
      2. 데이터 탭을 선택한 다음 정렬 - 계란 무게별로 데이터를 가장 작은 것에서 가장 큰 것까지 정렬합니다.
         참고: 최상의 부화 속도를 위해서는 40g에서 70g 사이의 알을 사용하십시오.
      3. 실험의 설계에 따라 계란 (숫자 또는 알파벳순)을 주사 치료와 안락사 당일에 할당하십시오. 치료 횟수와 안락사 날짜를 별도의 열에 입력하고 각 지층 내에서 이러한 요인을 무작위로 할당하십시오.
         참고 :이 출판물의 경우, 각 8 달걀 지층 내에서 무작위로 치료법이 할당되었습니다.
   5. 스프레드시트 소프트웨어 프로그램 내에서 피벗 테이블을 생성하여 각 트리트먼트가 비슷한 시작 계란 가중치를 갖는지 확인합니다.
      1. 분석할 스프레드시트 내의 모든 데이터를 강조 표시합니다.
      2. 삽입 탭에서 피벗 테이블 옵션을 선택합니다.
      3. 피벗 테이블 필드 하위 창에서 독립 변수(안락사 날짜 열)를 선택하고 행 필드로 끕니다.
      4. B 하위 창 내에서 독립 변수(처리 열)를 선택하고 안락사 날짜 아래의 행 필드로 드래그합니다.
      5. 관심 종속 변수(계란 무게)를 선택하고 값 필드로 끕니다.
      6. 종속 변수를 클릭하고 값 필드 설정을 선택하여 값 필드 설정을 변경합니다.
         1. 설정을 평균으로 변경합니다.
2. 트레이 할당
   1. 스프레드 시트 소프트웨어 프로그램에서 계란을 트레이에 할당하면 (숫자 또는 알파벳순으로) 치료가 트레이 내에서 동일하게 표현됩니다.
      1. 배정 된 치료법을 가진 처음 네 개의 알을 트레이 1에 할당하십시오. 다음 네 개의 알을 트레이 2 에 할당하고 모든 계란이 트레이에 배정 될 때까지 계속하십시오.
         참고: 이 단계는 실험에 사용된 인큐베이터 및 트레이의 수에 따라 달라집니다.
3. 피벗 테이블 기능을 사용하여 트레이에 모든 트리트먼트가 동일하게 표시되는지 확인합니다.
   1. 분석할 스프레드시트 내의 모든 데이터를 강조 표시합니다.
   2. 삽입 탭에서 피벗 테이블 옵션을 선택합니다.
   3. 피벗 테이블 필드 하위 창에서 독립 변수(트레이 열)를 선택하고 행 필드로 끕니다.
   4. 관심 종속 변수(계란 무게)를 선택하고 값 필드로 끕니다.
   5. 종속 변수를 클릭하고 값 필드 설정을 선택하여 값 필드 설정을 변경합니다.
      1. 설정을 개수로 변경합니다.
4. 잠복
   1. 알을 적절한 인큐베이션 트레이에 넣고 26.6 °C에서 40 % ± 4 % 상대 습도로 6 시간 동안 예비 배양하십시오.
      참고: 일부 인큐베이터에는 완전히 정확하지 않을 수 있는 자체 모니터링 시스템이 있습니다. 다른 온도 및 습도 모니터링 장치를 사용하여 조건을 제어하십시오.
   2. 인큐베이터 온도를 40% ± 4% 상대 습도로 37°C로 증가시키고 인큐베이션 18일까지 이러한 조건을 유지한다.
      1. 적절한 인큐베이터 온도를 보장하려면 열 표면 온도계로 인큐베이터 전체에서 여러 알의 표면 온도를 하루에 두 번 측정하여 표면 온도가 37 ° C인지 확인하십시오.
   3. 달걀을 매시간 회전시켜 재배치하십시오.
   4. 배양 첫 18.5 일 동안 10 % -12.5 %의 달걀 체중 감소를 보장하기 위해 매일 달걀 무게를 기록하십시오.
      참고: 체중 감량이 원하는 범위 내에 있지 않으면 습도를 조정(증가 또는 감소)하십시오.
5. 난 소 주사에서 잠복기-10 일
   1. 290.07 g / mol의 공식 중량을 사용하여 각 치료에 필요한 니코틴 아미드 리보시드의 양을 계산하고 100 μL의 용액을 각 달걀의 노른자 주머니에 주입하십시오.
      참고 : 멸균 식염수 (0.9 %) 용액은 모든 용액의 희석제로 사용됩니다.
      계산 : 100 μL = 5,000 μL (5 mL)의 용액이 필요한 × 50 개의 알. 최대 6mL까지 반올림하여 주사에 사용할 수 있는 충분한 용액을 확보합니다(그림 1).
      1. 용액이 만들어지면 37 ° C 수조에 넣어 계란의 온도로 유지하십시오.
   2. 인큐베이터에서 계란을 한 번에 하나의 트레이로 제거하고 따뜻한 수건으로 덮으십시오.
   3. 촛불 달걀을 노른자 주머니를 찾아 70 % 에탄올로 주사 부위를 청소하십시오.
   4. 멸균 된 20G, 2.54cm 피하 주사 바늘 ~ 1cm를 달걀 껍질에 넣고 할당 된 복용량을 노른자 주머니에 주입하십시오. 0 mM 니코틴아미드 리보시드 처리로부터 알을 100 μL의 멸균 식염수(0.9%)로 주입한다.
   5. 즉시, 과도한 수분 손실을 피하기 위해 주입 부위를 절대 방수 테이프의 작은 조각으로 덮으십시오.
   6. 모든 달걀이 치료를 받으면 트레이를 인큐베이터에 다시 넣으십시오.
   7. 잠복기 18 일에 쟁반에서 알을 제거하고 처리에 따라 부화 상자에 넣으십시오.
   8. 부화 상자를 인큐베이터에 넣고 모든 알이 부화 할 때까지 또는 부화 23 일까지 습도를 60 ± 2 %로 높입니다.
      참고 : 계란에 캔들링시 배아가 포함되어 있지 않으면 난자를 버리십시오. 이것은 썩은 알의 발생을 예방할 것입니다.

2. 안락사 및 가슴 주요 근육 샘플 수집

1. 병아리 안락사
   1. 배양 18 일에 인큐베이터에서 배아 난자를 제거하고 신진 대사를 중단하기 위해 실온에서 1 시간 동안 놓습니다. 계란에서 배아를 제거하고 노른자 주머니없이 무게를 측정 한 다음 목을 졸라. 부화 후 12 시간,_CO2 에 10 분 동안 노출시켜 병아리를 안락사시키고, 무게를 측정하고, 크라운 대 엉덩이 길이 측정을 신속하게 수집 한 다음 목을 졸라.
      참고 : 새가 더 이상 머리가 없다는 사실은 안락사를 보장합니다.
   2. 배아 및 병아리에 디지털 캘리퍼를 사용하는 다음 측정(단계 2.1.2.1-2.1.2.4)을 고려하십시오.
      1. 크라운에서 엉덩이까지의 길이를 결정하려면 병아리를 옆으로 눕히고 머리를 아래로 젖히고 다리를 몸 아래에 놓습니다. 머리 꼭대기에서 꼬리까지 측정하십시오.
      2. 헤드 폭을 측정하려면 한 귀 구멍에서 다른 귀 구멍까지 측정하십시오.
      3. 머리 길이를 결정하려면 부리의 뒤쪽에서 두개골 뒤쪽까지 측정하십시오.
      4. 비 탄성 끈을 가져 와서 한쪽 귀 구멍에서 다른 쪽 귀 구멍으로 두개골 주위를 감싸서 머리 둘레를 측정하십시오. 메트릭 눈금자에 문자열을 배치하여 측정값을 가져옵니다.
   3. 날개가 신체에 닿는 곳 아래에 가슴 주위에 끈을 감싸고 메트릭 눈금자에 끈을 올려 가슴 둘레를 수집하여 측정을 얻습니다.
   4. 유방에 70 % 에탄올을 뿌리고 손가락을 사용하여 깃털과 피부를 당겨 가슴의 주요 근육을 드러내고 디지털 캘리퍼로 측정 (단계 2.1.4.1-2.1.4.2)을 수행하십시오.
      1. 가슴 너비를 결정하려면 날개가 신체에 닿는 가슴을 가로 질러 측정하십시오.
      2. 가슴 길이를 결정하려면 쇄골 바닥에서 뚱뚱한 패드의 꼭대기까지 측정하십시오.
2. 가슴 주요 근육의 추출, 측정 및 수집
   1. 외과 용 가위 또는 메스와 포셉을 사용하여 용골 뼈를 따라 자르고 신체 벽에서 근육을 방출하여 오른쪽 가슴 주근을 제거하십시오.
      참고 : 근육이 흉곽에 남아 있음을 시각적으로 식별하여 가슴 경부 근육을 수집하지 않도록하십시오.
   2. 가슴 주요 근육을 제거한 후, 근육을 팝시클 스틱 위에 평평하게 놓고, 디지털 캘리퍼를 사용하여 다음 측정치(단계 2.2.2.1-2.2.2.3)를 수집한다.
      1. 근육 길이를 결정하려면 두개골에서 근육의 꼬리 부분까지 측정하십시오.
      2. 근육 폭을 결정하려면 근육의 두개골 부분의 가장 넓은 부분을 측정하십시오.
      3. 근육 두께를 결정하려면 포셉으로 유방을 집어 들고 근육의 두개골 부분의 가장 두꺼운 부분을 측정하십시오.
   3. 원하는 경우, 추가 분석을 위해 이 근육 및 좌측 가슴 주요 근육(조직학, 단백질 및 유전자 발현 등)을 -80°C에서 최대 일 년 동안 저장한다.

3. 통계

1. 달걀 / 병아리를 실험 단위로 사용하여 완전히 무작위 설계된 데이터로 데이터를 분석하십시오.
   참고: 니코틴아미드 리보시드 투여량(DOS)은 고정 효과로 작용하였다. 모든 데이터는 통계 분석 소프트웨어 프로그램 ( 자료 표 참조)으로 분석되었고, 치료의 최소 제곱 수단 간의 쌍 별 비교가 계산되었습니다. 차이는 P < 0.05에서 유의한 것으로 간주되었다.

결과

18일째 배아 및 부화한 병아리의 체중에 대한 DOS 효과는 없었다(P> 0.52; 그림 2). 하루 종일 DOS 효과는 없었다-18 배아 가슴 결핵 주요 근육 측정값 (P > 0.24; 그림 3). 부화 병아리 가슴 뼈 주요 근육 길이 및 폭 측정에 대한 DOS 효과는 없었다 (P > 0.26); 그러나, DOS는 근육 무게와 깊이에 영향을 미쳤다 (P < 0.03;

토론

현재까지 조지아 대학의 곤잘레스 연구소는 가슴 핵 주요 근육 발달 및 성장에 대한 오보 먹이에서 니코틴 아미드 리보시드의 긍정적 인 효과를 입증 한 유일한 그룹입니다. 첫 번째 연구는 250 mM 니코틴아미드 리보시드의 난소 공급에서 노른자 낭⁹에 주사 할 때 근육량과 치수를 증가 시킨다는 것을 발견했습니다. 후속 연구에서, 현재 연구에서 테스트 된 용?...

자료

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