À Ovo Alimentation des œufs de poulets de chair commerciaux: une méthode précise et reproductible pour affecter le développement et la croissance musculaires

Résumé

Une méthodologie robuste a été développée pour mener des essais de recherche sur l’alimentation en utilisant des œufs de chair commerciaux non incubés pour tester la capacité des composés naturels et synthétiques, dans ce cas, le nicotinamide riboside, à influencer le développement et la croissance musculaires.

Résumé

Au cours des trois dernières décennies, les scientifiques de la viande rouge et de la volaille se sont concentrés sur le développement de stratégies et de technologies pour manipuler le développement musculaire pendant le développement embryonnaire et fœtal. Ce domaine continue d’être un domaine d’intérêt parce que le nombre de fibres musculaires est établi pendant cette période et détermine la base de toute croissance future. Chez la volaille, de nombreuses études ont démontré que l’alimentation en ovo de facteurs de croissance, de vitamines ou d’autres nutriments améliorait le développement musculaire embryonnaire et intestinal des poussins. L’amélioration du développement des muscles ovo pourrait bénéficier à l’industrie avicole en influençant éventuellement le rendement en viande, le taux de croissance ou les conditions de myopathie. Au cours des cinq dernières années, le laboratoire Gonzalez de l’Université de Géorgie a mis au point une méthodologie d’alimentation in ovo de nicotinamide riboside pour les embryons de poulet de chair, ce qui a modifié le développement musculaire. Lorsqu’il est injecté dans le sac vitellin d’un embryon en développement, le nicotinamide riboside augmente le poids musculaire majeur du pectoral et la densité des fibres musculaires à l’éclosion. Ce protocole démontrera une méthodologie permettant de mener avec précision et de manière reproductible des études sur l’alimentation en utilisant des embryons de poulets de chair à rendement standard et à haut rendement commercial. Ces données et méthodes permettront à d’autres groupes de recherche d’effectuer des études sur l’alimentation avec beaucoup de succès et de reproductibilité.

Introduction

Depuis 1960, la consommation par habitant de viande de volaille aux États-Unis a augmenté à un rythme stupéfiant, tandis que d’autres sources de protéines primaires sont restées stagnantes, ont diminué ou ont augmenté de manière minime. L’industrie avicole a investi beaucoup de temps et d’efforts de recherche pour optimiser la nutrition et la génétique afin de produire un oiseau efficace pour répondre à la demande. Parce que l’objectif principal de l’industrie avicole est de produire du muscle pour la conversion à la viande, leurs efforts ont radicalement changé la masse musculaire ultime de l’oiseau à la récolte.

Comme la plupart des espèces, la volaille développe ses muscles de manière biphasique. La myogenèse primaire utilise des cellules souches mésenchymateuses pour produire des fibres musculaires primaires, qui servent d’échafaudage pour la deuxième vague de développement des fibres musculaires¹. Chez la volaille, la myogenèse primaire se produit pendant les jours embryonnaires 3 à 8, et la myogenèse secondaire se produit des jours 8 à 21². Une fois développées, les fibres musculaires primaires et secondaires servent de base à toute croissance musculaire future par hypertrophie cellulaire. Par conséquent, les scientifiques et l’industrie ont déployé des efforts considérables pour tenter de manipuler la myogenèse primaire et secondaire chez toutes les espèces productrices de viande afin de maximiser le rendement en viande.

Une technologie explorée chez la volaille, appelée alimentation in ovo, consiste à nourrir des composés par injection. L’alimentation in ovo, une technologie employée par l’industrie avicole depuis près de 40 ans, a été initialement développée pour l’administration de vaccins³. La littérature documente que l’alimentation en ovo de divers composés et nutriments à différentes périodes de développement et à différents endroits dans l’œuf a eu un effet positif sur le développement et la croissance des muscles ovo ^4,5,6. À ce jour, le laboratoire Gonzalez de l’Université de Géorgie est le pionnier dans l’utilisation du nicotinamide riboside dans l’alimentation des ovo pour manipuler le développement musculaire de la volaille.

Le nicotinamide riboside, un analogue pyridine-nucléosidique de la vitamine B3, produit du NAD+ par la voie de récupération⁷. Étant donné que cette voie utilise moins d’étapes enzymatiques pour produire du NAD +, la production est la plus efficace⁸. Gonzalez et Jackson⁹ ont démontré que la supplémentation du sac vitellin embryonnaire de poulet de chair en développement avec du nicotinamide riboside augmentait le poids musculaire majeur du pectoral de poussin éclos et la densité des fibres musculaires. Cela a été confirmé plus tard par Xu et ^al.10, qui ont constaté que l’augmentation de la dose de nicotinamide riboside augmentait le poids musculaire et augmentait la densité des fibres musculaires. Ces deux premières études ont été menées dans un poulet de chair à rendement commercial. Parce que les poulets de chair à haut rendement possèdent un potentiel génétique plus important pour la taille de la masse musculaire ultime, l’objectif de l’étude était de déterminer les effets de la dose de nicotinamide riboside sur le développement musculaire majeur et la croissance des poussins pectoraux à haut rendement à l’éclosion.

Protocole

Toutes les méthodologies ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Géorgie.

1. Incubation des œufs et administration du traitement

1. Approvisionnement en œufs et affectation du traitement
   1. Obtenez des œufs de poulet de chair à haut rendement non inincubés et fécondés et transportez-les au laboratoire.
   2. Inspecter et jeter les œufs jugés de mauvaise qualité.
      REMARQUE: Éliminez les œufs difformes (ronds, allongés, côtés en dalle), fissurés, sales / tachés, à coquille mince et ridés. Ceci est important pour minimiser le risque d’œufs pourris.
   3. Attribuez des numéros d’œufs individuels, pesez et enregistrez les numéros et les poids d’œufs dans un tableur.
   4. Utilisez le tableur pour trier les œufs en fonction du poids.
      1. Mettez en surbrillance les colonnes du nombre d’œufs et du poids des œufs .
      2. Sélectionnez l’onglet Données , puis Trier - trier les données par poids d’œuf du plus petit au plus grand.
         REMARQUE: Pour obtenir le meilleur taux d’éclosion, utilisez des œufs pesant entre 40 et 70 g.
      3. En fonction de la conception de l’expérience, attribuez aux ovules (numériquement ou alphabétiquement) un traitement par injection et un jour d’euthanasie. Entrez le numéro de traitement et le jour de l’euthanasie dans des colonnes distinctes et attribuez aléatoirement ces facteurs dans chaque strate.
         NOTE : Pour cette publication, les traitements ont été répartis au hasard dans chaque strate de 8 œufs.
   5. Générez un tableau croisé dynamique dans le tableur pour vous assurer que chaque traitement possède des poids d’œufs de départ similaires.
      1. Mettez en surbrillance toutes les données de la feuille de calcul à analyser.
      2. Sélectionnez l’option de tableau croisé dynamique sous l’onglet Insertion .
      3. Sélectionnez la variable indépendante (colonne Jour de l’euthanasie ) dans la sous-fenêtre Champs de tableau croisé dynamique et faites-la glisser vers le champ Lignes.
      4. Sélectionnez la variable indépendante (colonne Traitement ) dans la sous-fenêtre B et faites glisser jusqu’au champ Lignes , sous Jour de l’euthanasie.
      5. Sélectionnez la variable d’intérêt dépendante (Poids de l’œuf) et faites-la glisser vers le champ Valeurs.
      6. Modifiez les paramètres du champ Valeur en cliquant sur la variable dépendante et en sélectionnant Paramètres du champ Valeur.
         1. Définissez le paramètre sur Moyenne.
2. Affectation des bacs
   1. Dans le tableur, attribuez des œufs à un plateau (numériquement ou par ordre alphabétique), de sorte que les traitements soient également représentés dans un plateau.
      1. Affectez les quatre premiers œufs avec les traitements assignés au plateau 1. Affectez les quatre œufs suivants au plateau 2 et continuez jusqu’à ce que tous les œufs soient affectés à un plateau.
         REMARQUE: Cette étape varie en fonction du nombre d’incubateurs et de plateaux utilisés dans l’expérience.
3. Assurez-vous que tous les traitements sont représentés de manière égale sur un plateau à l’aide de la fonction de tableau croisé dynamique .
   1. Mettez en surbrillance toutes les données de la feuille de calcul à analyser.
   2. Sélectionnez l’option Tableau croisé dynamique sous l’onglet Insertion .
   3. Sélectionnez la variable indépendante (colonne Barre d’état ) dans la sous-fenêtre Champs de tableau croisé dynamique et faites-la glisser jusqu’au champ Lignes .
   4. Sélectionnez la variable d’intérêt dépendante (Poids de l’œuf) et faites-la glisser vers le champ Valeurs.
   5. Modifiez les paramètres du champ Valeur en cliquant sur la variable dépendante et en sélectionnant Paramètres du champ Valeur.
      1. Définissez le paramètre sur Count.
4. Incubation
   1. Placer les œufs dans leur plateau d’incubation approprié et les pré-incuber à 26,6 °C avec 40 % ± 4 % d’humidité relative pendant 6 h.
      REMARQUE: Certains incubateurs ont des systèmes d’autosurveillance qui peuvent ne pas être tout à fait précis. Utilisez d’autres appareils de surveillance de la température et de l’humidité pour contrôler les conditions.
   2. Augmentez la température de l’incubateur à 37 °C avec 40 % ± 4 % d’humidité relative et maintenez ces conditions jusqu’au jour d’incubation 18.
      1. Pour assurer une température d’incubateur appropriée, mesurez deux fois par jour la température de surface de plusieurs œufs dans l’incubateur à l’aide d’un thermomètre thermique de surface pour vous assurer que les températures de surface sont de 37 ° C.
   3. Faire pivoter les œufs toutes les heures pour les repositionner.
   4. Enregistrez le poids des œufs quotidiennement pour assurer une perte de poids de 10% à 12,5% au cours des 18,5 premiers jours d’incubation.
      REMARQUE: Si la perte de poids n’est pas dans la plage souhaitée, ajustez (augmentez ou diminuez) l’humidité.
5. Jour d’incubation-10 en injections d’ovo
   1. Calculer la quantité de nicotinamide riboside nécessaire pour chaque traitement en utilisant le poids de formule de 290,07 g/mol, avec 100 μL de solution injectée dans le sac vitellin de chaque œuf.
      REMARQUE: Une solution saline stérile (0,9%) sera utilisée comme diluant pour toutes les solutions.
      Calcul : 50 œufs × 100 μL = 5 000 μL (5 mL) de solution nécessaire. Arrondissez jusqu’à 6 mL pour vous assurer qu’une solution suffisante est disponible pour l’injection (Figure 1).
      1. Une fois les solutions préparées, placez-les dans un bain-marie à 37 °C pour les maintenir à la température des œufs.
   2. Retirer les œufs de l’incubateur un plateau à la fois et couvrir avec une serviette chaude.
   3. Œuf de bougie pour localiser le sac vitellin et nettoyer la zone d’injection avec de l’éthanol à 70%.
   4. Insérez une aiguille hypodermique stérile de 20 G et 2,54 cm ~ 1 cm dans la coquille de l’œuf et injectez la dose assignée dans le sac vitellin. Injecter les œufs du traitement au nicotinamide riboside 0 mM avec 100 μL de solution saline stérile (0,9%).
   5. Immédiatement, couvrez le site d’injection avec un petit morceau de ruban adhésif imperméable absolu pour éviter une perte d’humidité excessive.
   6. Une fois que tous les œufs ont reçu leur traitement, replacez le plateau dans l’incubateur.
   7. Le jour de l’incubation 18, retirez les œufs des plateaux et placez-les dans des boîtes à couver en fonction de leurs traitements.
   8. Placez les boîtes d’éclosion dans l’incubateur et augmentez l’humidité à 60 ± 2% jusqu’à ce que tous les œufs éclosent ou jusqu’au jour 23 de l’incubation.
      REMARQUE: Si les œufs ne contiennent pas d’embryon au moment de la mise en conserve, jetez l’œuf. Cela empêchera l’apparition d’œufs pourris.

2. Prélèvement d’échantillons d’euthanasie et de muscle pectoral majeur

1. Euthanasie des poussins
   1. Le jour d’incubation 18, retirez les œufs embryonnaires de l’incubateur et placez-les à température ambiante pendant 1 h pour arrêter le métabolisme. Retirez les embryons des œufs, pesez sans le sac vitellin, puis décapitez. 12 h après l’éclosion, euthanasier les poussins par exposition au CO₂ pendant 10 min, peser, recueillir rapidement la mesure de la longueur de la couronne au croupion, puis décapiter.
      NOTE: Le fait que l’oiseau n’ait plus la tête assure l’euthanasie.
   2. Considérez les mesures suivantes (étapes 2.1.2.1-2.1.2.4) à l’aide d’étriers numériques pour les embryons et les poussins.
      1. Pour déterminer la longueur de la couronne au croupion, posez le poussin sur le côté, la tête baissée et les pattes sous le corps. Mesurez du haut de la tête à la queue.
      2. Pour mesurer la largeur de la tête, mesurez d’un trou d’oreille à l’autre trou d’oreille.
      3. Pour déterminer la longueur de la tête, mesurez de l’arrière du bec à l’arrière du crâne.
      4. Prenez une ficelle non élastique et enroulez-la autour du crâne d’un trou d’oreille à l’autre pour mesurer la circonférence de la tête. Placez la chaîne sur une règle métrique pour obtenir une mesure.
   3. Recueillez le tour de poitrine en enroulant une ficelle autour de la poitrine, sous laquelle les ailes entrent en contact avec le corps et en plaçant la ficelle sur une règle métrique pour obtenir la mesure.
   4. Vaporisez les seins avec de l’éthanol à 70% et, à l’aide des doigts, tirez les plumes et la peau pour révéler les principaux muscles pectoraux et prenez les mesures (étapes 2.1.4.1-2.1.4.2) avec des étriers numériques.
      1. Pour déterminer la largeur de la poitrine, mesurez à travers la poitrine où les ailes entrent en contact avec le corps.
      2. Pour déterminer la longueur de la poitrine, mesurez du bas de la clavicule au haut du coussinet adipeux.
2. Extraction du muscle pectoral majeur , mesure et collecte
   1. À l’aide de ciseaux chirurgicaux ou d’un scalpel et d’une pince, retirez le muscle pectoral majeur droit en coupant le long de l’os de la quille et en libérant le muscle de la paroi du corps.
      REMARQUE: Assurez-vous de ne pas recueillir le muscle pectoral mineur en identifiant visuellement que le muscle reste sur la cage thoracique.
   2. Après avoir retiré le muscle pectoral majeur , posez le muscle à plat sur un bâton de sucettes glacées et collectez les mesures suivantes (étapes 2.2.2.1-2.2.2.3) à l’aide d’étriers numériques.
      1. Pour déterminer la longueur musculaire, mesurez de la partie crânienne à la partie caudale du muscle.
      2. Pour déterminer la largeur du muscle, mesurez la partie la plus large de la partie crânienne du muscle.
      3. Pour déterminer l’épaisseur musculaire, ramassez le sein avec une pince et mesurez la partie la plus épaisse de la partie crânienne du muscle.
   3. Si vous le souhaitez, stockez ce muscle et le muscle pectoral majeur gauche pour d’autres analyses (telles que l’histologie, l’expression des protéines et des gènes, etc.) à -80 ° C pendant un an.

3. Statistiques

1. Analysez les données sous la forme d’un plan complètement randomisé avec l’œuf / poussin comme unité expérimentale.
   REMARQUE: La dose de nicotinamide riboside (DOS) a servi d’effet fixe. Toutes les données ont été analysées à l’aide d’un logiciel d’analyse statistique (voir Tableau des matériaux) et des comparaisons par paires entre les moyennes de traitements les moins carrées ont été calculées. Les différences ont été jugées significatives à P < 0,05.

Résultats

Il n’y avait pas d’effets DOS sur le poids corporel des embryons du jour 18 et des poussins éclos (P > 0,52; Graphique 2). Il n’y avait pas d’effets DOS pour toutes les mesures musculaires majeures de l’embryon pectoral du jour 18 (P > 0,24; Graphique 3). Il n’y avait pas d’effets DOS pour les mesures de longueur et de largeur des muscles majeurs des poussins pectoraux éclos (P > 0,26); cependant, le D...

Discussion

À ce jour, le laboratoire Gonzalez de l’Université de Géorgie est le seul groupe à démontrer les effets positifs du nicotinamide riboside dans l’alimentation des ovo sur le développement et la croissance des muscles pectoraux majeurs . La première étude a révélé que dans l’alimentation ovo de 250 mM nicotinamide riboside augmentait le poids musculaire et les dimensions lorsqu’il était injecté dans le sac vitellin⁹. Dans l’étude de suivi, l’injec...

matériels

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