Burada: Ovo Ticari Broiler Yumurtalarının Beslenmesi: Kas Gelişimini ve Büyümesini Etkilemek İçin Doğru ve Tekrarlanabilir Bir Yöntem

Özet

Doğal ve sentetik bileşiklerin , bu durumda, nikotinamid ribozidin kas gelişimini ve büyümesini etkileme yeteneğini test etmek için kuluçkalanmamış ticari piliç yumurtalarını kullanan ovo besleme araştırma denemelerinde yürütmek için sağlam bir metodoloji geliştirilmiştir.

Özet

Son otuz yılda, kırmızı et ve kümes hayvanları bilim adamları, embriyonik ve fetal gelişim sırasında kas gelişimini manipüle etmek için stratejiler ve teknolojiler geliştirmeye odaklandılar. Bu alan bir odak alanı olmaya devam ediyor, çünkü kas lifi sayısı bu süre zarfında belirleniyor ve gelecekteki tüm büyümenin temelini belirliyor. Kümes hayvanlarında, büyüme faktörlerinin, vitaminlerin veya diğer besin maddelerinin ovo beslenmesinde gösterilen çok sayıda çalışma, civciv embriyonik kasını ve bağırsak gelişimini iyileştirmiştir. Ovo kas gelişiminin iyileştirilmesi, muhtemelen et verimini, büyüme hızını veya miyopati koşullarını etkileyerek kanatlı hayvan endüstrisine fayda sağlayabilir. Geçtiğimiz beş yıl boyunca, Georgia Üniversitesi'ndeki Gonzalez Laboratuvarı, broiler-tavuk embriyoları için ovo besleme metodolojisinde kas gelişimini değiştiren bir nikotinamid ribozid geliştirdi. Gelişmekte olan bir embriyonun yumurta sarısı kesesine enjekte edildiğinde, nikotinamid ribozid pektoralis majör kas ağırlığını ve kapaktaki kas lifi yoğunluğunu arttırdı. Bu protokol, ticari standart ve yüksek verimli piliç embriyolarını kullanarak ovo besleme çalışmalarında doğru ve tekrarlanabilir bir şekilde yürütülecek bir metodoloji gösterecektir. Bu veriler ve yöntemler, diğer araştırma gruplarının ovo besleme çalışmalarında çok başarılı ve tekrarlanabilirlikle performans göstermelerini sağlayacaktır.

Giriş

1960'tan bu yana, Amerika Birleşik Devletleri'nin kümes hayvanlarından kişi başına düşen et tüketimi şaşırtıcı bir oranda artarken, diğer birincil protein kaynakları durgun, azalmış veya asgari düzeyde artmıştır. Kanatlı hayvan endüstrisi, talebe ayak uydurmak için verimli bir kuş üretmek için beslenme ve genetiği optimize etmek için önemli ölçüde zaman ve araştırma çabalarına yatırım yaptı. Kanatlı hayvan endüstrisinin temel amacı, ete dönüştürmek için kas üretmek olduğundan, çabaları kuşun hasattaki nihai kas kütlesini büyük ölçüde değiştirmiştir.

Çoğu tür gibi, kümes hayvanları da bifazik bir şekilde kas geliştirir. Primer miyogenez, kas lifi gelişiminin ikinci dalgası için iskele görevi gören birincil kas lifleri üretmek için mezenkimal kök hücreleri kullanır¹. Kümes hayvanlarında, primer miyogenez embriyonik günlerde 3 ila 8 arasında ortaya çıkar ve ikincil miyogenez 8 ila 21. günler arasında gerçekleşir². Bir kez geliştirildikten sonra, birincil ve ikincil kas lifleri, hücresel hipertrofi yoluyla gelecekteki tüm kas büyümesinin temelini oluşturur. Bu nedenle, bilim adamları ve endüstri, et verimini en üst düzeye çıkarmak için et üreten tüm türlerde birincil ve ikincil miyogenezi manipüle etmeye çalışmak için büyük çaba harcadılar.

Kümes hayvanlarında araştırılan ve ovo besleme olarak adlandırılan bir teknoloji, bileşiklerin enjeksiyon yoluyla beslenmesini içerir. Kanatlı hayvan endüstrisi tarafından yaklaşık 40 yıldır kullanılan bir teknoloji olan ovo beslemede, başlangıçta aşı uygulaması için geliştirilmiştir³. Literatür, yumurta içindeki farklı gelişim dönemlerinde ve konumlarında çeşitli bileşiklerin ve besin maddelerinin ovo beslenmesinde ovo kas gelişimi ve büyümesinde olumlu yönde etkilendiğini belgelemektedir 4,5,6. Bugüne kadar, Georgia Üniversitesi'ndeki Gonzalez Laboratuvarı, kümes hayvanı kas gelişimini manipüle etmek için ovo beslemede nikotinamid ribozid kullanmanın öncüsüdür.

B3 vitamininin piridin-nükleozid analoğu olan nikotinamid ribozit, kurtarma yolu⁷ boyunca NAD + üretir. Bu yol, NAD + üretmek için daha az enzimatik adım kullandığından, üretim en verimli^8'dir. Gonzalez ve Jackson 9, gelişmekte olan piliç embriyo yumurta sarısı kesesinin nikotinamid ribozid ile takviyesinin^, yumurtadan çıkmış nohutralis majör kas ağırlığını ve kas lifi yoğunluğunu arttırdığını göstermiştir. Bu daha sonra Xu ve ^ark.10 tarafından doğrulandı ve artan nikotinamid ribozid dozunun kas ağırlığını arttırdığını ve kas lifi yoğunluğunu arttırdığını buldu. Bu ilk iki çalışma ticari bir verim piliçlerinde gerçekleştirildi. Yüksek verimli piliçler, nihai kas kütlesi büyüklüğü için daha önemli bir genetik potansiyele sahip olduklarından, çalışmanın amacı, nikotinamid ribozid dozunun yüksek verimli piliç yumurtadan çıkmış nohut pektoralis majör kas gelişimi ve kapakta büyüme üzerindeki etkilerini belirlemekti.

Protokol

Tüm metodolojiler Georgia Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Yumurta inkübasyonu ve tedavi uygulaması

1. Yumurta temini ve tedavi ataması
   1. Kuluçkalanmamış, döllenmiş yüksek verimli piliç yumurtaları elde edin ve bunları laboratuvara taşıyın.
   2. Düşük kaliteli olduğu düşünülen yumurtaları inceleyin ve atın.
      NOT: Şekilsiz yumurtaları (yuvarlak, uzun, levha taraflı), çatlamış, kirli/lekeli, ince kabuklu ve buruşuk yumurtaları ortadan kaldırın. Bu, çürük yumurta riskini en aza indirmek için önemlidir.
   3. Tek tek yumurta numaraları atayın, tartın ve yumurta numaralarını ve ağırlıklarını bir elektronik tablo yazılım programına kaydedin.
   4. Yumurtaları ağırlığa göre sıralamak için elektronik tablo yazılım programını kullanın.
      1. Yumurta sayısını ve yumurta ağırlığı sütunlarını vurgulayın.
      2. Veri sekmesini ve ardından Sırala - verileri yumurta ağırlığına göre en küçüğünden en büyüğüne doğru sırala'yı seçin.
         NOT: En iyi kuluçka hızı için, 40 ila 70 g ağırlığındaki yumurtaları kullanın.
      3. Deneyin tasarımına dayanarak, yumurtalara (sayısal veya alfabetik olarak) bir enjeksiyon tedavisi ve ötenazi günü atayın. Ötanazi tedavi numarasını ve gününü ayrı sütunlara girin ve bu faktörleri her tabakaya rastgele atayın.
         NOT: Bu yayın için, tedaviler her 8 yumurtalı tabaka içinde rastgele atanmıştır.
   5. Her tedavinin benzer başlangıç yumurtası ağırlıklarına sahip olduğundan emin olmak için elektronik tablo yazılım programında bir PivotTable oluşturun.
      1. Analiz edilecek elektronik tablodaki tüm verileri vurgulayın.
      2. Ekle sekmesi altında PivotTable seçeneğini belirleyin .
      3. PivotTable Alanları alt penceresinde bağımsız değişkeni (Ötenazi Günü sütunu) seçin ve Satırlar alanına sürükleyin.
      4. B alt penceresinde bağımsız değişkeni (Tedavi sütunu) seçin ve Ötenazi Günü altındaki Satırlar alanına sürükleyin.
      5. İlgilenilen bağımlı değişkeni (Yumurta Ağırlığı) seçin ve Değerler alanına sürükleyin.
      6. Bağımlı değişkene tıklayıp Değer Alanı Ayarları'nı seçerek Değer alanı ayarlarını değiştirin.
         1. Ayarı Ortalama olarak değiştirin.
2. Tepsi ataması
   1. Elektronik tablo yazılım programında, yumurtaları bir tepsiye (sayısal veya alfabetik olarak) atayın, böylece tedaviler bir tepsi içinde eşit olarak temsil edilir.
      1. Atanmış tedavilerle ilk dört yumurtayı tepsi 1'e atayın. Sonraki dört yumurtayı tepsi 2'ye atayın ve tüm yumurtalar bir tepsiye atanana kadar devam edin.
         NOT: Bu adım, deneyde kullanılan inkübatör ve tepsi sayısına bağlı olarak değişecektir.
3. PivotTable işlevini kullanarak tüm işlemlerin bir tepside eşit olarak temsil edildiğinden emin olun.
   1. Analiz edilecek elektronik tablodaki tüm verileri vurgulayın.
   2. Ekle sekmesinin altındaki PivotTable seçeneğini belirleyin.
   3. PivotTable Alanları alt penceresinde bağımsız değişkeni (Tepsi sütunu) seçin ve Satırlar alanına sürükleyin.
   4. İlgilenilen bağımlı değişkeni (Yumurta Ağırlığı) seçin ve Değerler alanına sürükleyin.
   5. Bağımlı değişkene tıklayıp Değer Alanı Ayarları'nı seçerek Değer alanı ayarlarını değiştirin.
      1. Ayarı Say olarak değiştirin.
4. Kuluçka
   1. Yumurtaları uygun kuluçka tepsisine yerleştirin ve 6 saat boyunca% 40 ±% 4 bağıl nem ile 26.6 ° C'de ön inkübe edin.
      NOT: Bazı inkübatörler, tamamen doğru olmayabilecek kendi kendini izleme sistemlerine sahiptir. Koşulları kontrol etmek için diğer sıcaklık ve nem izleme cihazlarını kullanın.
   2. İnkübatör sıcaklığını% 40 ±% 4 bağıl nem ile 37 ° C'ye yükseltin ve bu koşulları inkübasyon günü 18'e kadar koruyun.
      1. Uygun inkübatör sıcaklığını sağlamak için, yüzey sıcaklıklarının 37 ° C olduğundan emin olmak için inkübatör boyunca günde iki kez birkaç yumurtanın yüzey sıcaklığını termal yüzey termometresi ile ölçün.
   3. Yeniden konumlandırmak için yumurtaları saatlik olarak döndürün.
   4. Kuluçkanın ilk 18.5 günü boyunca% 10 -% 12.5 yumurta ağırlığı kaybını sağlamak için günlük yumurta ağırlıklarını kaydedin.
      NOT: Kilo kaybı istenen aralıkta değilse, nemi ayarlayın (artırın veya azaltın).
5. Ovo enjeksiyonlarında kuluçka günü-10
   1. Her yumurta sarısı kesesine enjekte edilen 100 μL çözelti ile 290.07 g / mol formül ağırlığını kullanarak her tedavi için gereken nikotinamid ribozid miktarını hesaplayın.
      NOT: Tüm çözeltiler için seyreltici olarak steril salin (%0,9) çözeltisi kullanılacaktır.
      Hesaplama: 50 yumurta × 100 μL = 5.000 μL (5 mL) çözelti gereklidir. Enjeksiyon için yeterli çözeltinin mevcut olduğundan emin olmak için 6 mL'ye kadar yuvarlayın (Şekil 1).
      1. Çözeltiler yapıldıktan sonra, yumurtaların sıcaklığında tutmak için 37 ° C'lik bir su banyosuna yerleştirin.
   2. Yumurtaları inkübatörden her seferinde bir tepsiden çıkarın ve ılık bir havluyla örtün.
   3. Sarısı kesesini bulmak ve enjeksiyon alanını% 70 etanol ile temizlemek için mum yumurtası.
   4. Yumurta kabuğuna steril bir 20 G, 2.54 cm hipodermik iğne ~ 1 cm yerleştirin ve verilen dozu yumurta sarısı kesesine enjekte edin. Yumurtaları 0 mM nikotinamid ribozid tedavisinden 100 μL steril salin (% 0.9) ile enjekte edin.
   5. Hemen, aşırı nem kaybını önlemek için enjeksiyon bölgesini küçük bir parça mutlak su geçirmez bantla örtün.
   6. Tüm yumurtalar tedavilerini aldıktan sonra, tepsiyi tekrar inkübatöre yerleştirin.
   7. Kuluçka günü 18'de, yumurtaları tepsilerden çıkarın ve tedavilerine göre kuluçka kutularına yerleştirin.
   8. Kuluçka kutularını inkübatöre yerleştirin ve tüm yumurtalar yumurtadan çıkana kadar veya inkübasyonun 23. gününe kadar nemi% 60 ±% 2'ye yükseltin.
      NOT: Yumurtalar konservede embriyo içermiyorsa, yumurtayı atın. Bu çürük yumurta oluşumunu önleyecektir.

2. Ötenazi ve pektoralis majör kas örneği toplama

1. Civciv ötenazisi
   1. Kuluçka günü 18'de, embriyonik yumurtaları inkübatörden çıkarın ve metabolizmayı durdurmak için 1 saat oda sıcaklığına yerleştirin. Embriyoları yumurtalardan çıkarın, yumurta sarısı kesesi olmadan tartın ve sonra kafasını kesin. Kuluçkadan 12 saat sonra, civcivleri 10 dakika boyunca CO_2'ye maruz bırakarak ötenazi yapın, tartın, hızlı bir şekilde taçtan yumruya uzunluk ölçümü toplayın ve ardından kafasını kesin.
      NOT: Kuşun artık kafasına sahip olmaması ötenaziyi garanti eder.
   2. Embriyolar ve civcivler için dijital kumpaslar kullanarak aşağıdaki ölçümleri (adım 2.1.2.1-2.1.2.4) göz önünde bulundurun.
      1. Taç-yumru uzunluğunu belirlemek için, civcivi başı sıkışmış ve bacakları vücudunun altına sıkışmış olarak yan tarafına koyun. Başın üstünden kuyruğa kadar ölçün.
      2. Kafa genişliğini ölçmek için, bir kulak deliğinden diğer kulak deliğine kadar ölçüm yapın.
      3. Kafa uzunluğunu belirlemek için, gaganın arkasından kafatasının arkasına kadar ölçün.
      4. Elastik olmayan bir ip alın ve baş çevresini ölçmek için kafatasının etrafına bir kulak deliğinden diğerine sarın. Ölçüm elde etmek için dizeyi metrik cetvelin üzerine yerleştirin.
   3. Göğsün etrafına, kanatların vücuda temas ettiği yerin altına bir ip sararak ve ölçümü elde etmek için ipi metrik bir cetvel üzerine yerleştirerek göğüs çevresini toplayın.
   4. Göğüsleri% 70 etanol ile püskürtün ve parmakları kullanarak, pektoralis majör kaslarını ortaya çıkarmak için tüyleri ve cildi çekin ve ölçümleri (adım 2.1.4.1-2.1.4.2) dijital kumpaslarla yapın.
      1. Göğüs genişliğini belirlemek için, kanatların vücuda temas ettiği göğüs boyunca ölçün.
      2. Göğüs uzunluğunu belirlemek için, klavikulanın altından yağ yastığının üstüne kadar ölçün.
2. Pektoralis majör kasının çıkarılması, ölçümü ve toplanması
   1. Cerrahi makas veya neşter ve forseps kullanarak, omurga kemiği boyunca keserek ve kası vücut duvarından serbest bırakarak sağ pektoralis majör kasını çıkarın.
      NOT: Kasın göğüs kafesinde kaldığını görsel olarak tanımlayarak pektoralis minör kasını toplamadığınızdan emin olun.
   2. Pektoralis majör kasını çıkardıktan sonra, kası bir popsicle çubuğu üzerine düz bir şekilde yerleştirin ve dijital kumpaslar kullanarak aşağıdaki ölçümleri (adımlar 2.2.2.1-2.2.2.3) toplayın.
      1. Kas uzunluğunu belirlemek için, kranial kasın kaudal kısmına kadar ölçün.
      2. Kas genişliğini belirlemek için, kasın kafatası kısmının en geniş kısmında ölçüm yapın.
      3. Kas kalınlığını belirlemek için, forseps ile memeyi alın ve kasın kranial kısmının en kalın kısmında ölçün.
   3. İstenirse, bu kası ve sol pektoralis majör kasını daha ileri analizler için (histoloji, protein ve gen ekspresyonu vb.) bir yıla kadar -80 ° C'de saklayın.

3. İstatistik

1. Verileri deney birimi olarak yumurta / civciv ile tamamen rastgele bir tasarım olarak analiz edin.
   NOT: Nikotinamid ribozid dozu (DOS) sabit etki olarak görev yaptı. Tüm veriler istatistiksel bir analiz yazılımı programı ile analiz edildi (bakınız Malzeme Tablosu) ve en küçük kare tedavi araçları arasındaki ikili karşılaştırmalar hesaplandı. P < 0.05'te farklılıklar anlamlı bulundu.

Sonuçlar

18. gün embriyolarının ve yumurtadan çıkan civcivlerin vücut ağırlığı için DOS etkisi yoktu (P > 0.52; Şekil 2). Tüm gün-18 embriyo pektoralis majör kas ölçümleri için DOS etkisi yoktu (P > 0.24; Şekil 3). Yumurtadan çıkan nohut piktoralis majör kas uzunluğu ve genişliği ölçümleri için DOS etkisi yoktu (P > 0.26); Bununla birlikte, DOS kas ağırlığını ve derinliğini etkilemiştir (...

Tartışmalar

Bugüne kadar, Georgia Üniversitesi'ndeki Gonzalez Laboratuvarı, pektoralis majör kas gelişimi ve büyümesi üzerinde ovo beslenmesinde nikotinamid ribozidin olumlu etkilerini gösteren tek gruptur. İlk çalışma, 250 mM nikotinamid ribozidin ovo beslenmesinde, yumurta sarısı kesesi^9'a enjekte edildiğinde kas ağırlığını ve boyutlarını arttırdığını bulmuştur. Takip çalışmasında, mevcut çalışmada test edilen dozlara benzer şekilde, yumurta s...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air-Tite™ Sterile Hypodermic Needles- 20 G; 1 inch	Fisher Scientific	14-817-208	https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-hypodermic-needles-32/p-7182916#?keyword=
Analytical Balance	VWR	VWR-214B2	https://us.vwr.com/store/product/20970740/vwr-b2-series-analytical-and-precision-balances
Complete Dissection Set	DOCAZON	DK1001	https://www.amazon.com/DOCAZON-Complete-Dissection-Set-Dissecting/dp/B07VBHKSW3
Fisherbrand™ Isotemp™ General Purpose Deluxe Water Baths	Fisher Scientific	FSGPD02	https://www.fishersci.com/shop/products/isotemp-general-purpose-water-baths/p-6448020
Fisherbrand™ Sterile Syringes for Single Use	Fisher Scientific	14-955-464	https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/p-7114739#?keyword=
HIGH INTENSITY EGG CANDLER	Titan Incubators	N/A	https://www.titanincubators.com/collections/egg-candlers/products/egg-candler-high-intensity
Infrared Forehead Thermometer	HALIDODO	XZ-001
Microsoft Excel	Microsoft	N/A
Neiko Tools Digital Caliper	Neiko Tools	01408A	https://www.amazon.com/Neiko-01407A-Electronic-Digital-Stainless/dp/B000NEA0P8?th=1
Nexcare Absolute Waterproof Tape	Nexcare Brand	732	https://www.nexcare.com/3M/en_US/nexcare/products/catalog/~/Nexcare-Absolute-Waterproof-Tape/?N=4326+3294529207+3294631805 &rt=rud
Pen Size Temperature and Humidity USB Data Logger with Display	Omega	OM-HL-SP-TH	https://www.omega.com/en-us/temperature-measurement/temperature-and-humidity-data-loggers/p/OM-HL-SP-Series
SAS 9.4 for Windows	SAS Institute	N/A	https://www.sas.com/en_us/home.html
Sportsman 1502 Incubator	GQF Manufacturing	1502	https://www.gqfmfg.com/item/1502-digital-sportsman/
Tru Niagen (Nicotinamide riboside)	ChromaDex, Inc.	N/A	https://www.truniagen.com/truniagen-300mg/ - note, contact company for pure product
Wood Craft Sticks	Creatology	M20001547	https://www.michaels.com/wood-craft-sticks-by-creatology/M20001547.html