Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تم تطوير طريقة غير موسومة وغير نظيرية مشعة لفحص نشاط اليوراسيل - الحمض النووي للجليكوسيلاز باستخدام مطياف الكتلة MALDI-TOF لتحليل المنتج المباشر المحتوي على موقع apurinic / apyrimidinic. أثبت الفحص أنه بسيط للغاية ومحدد وسريع وسهل الاستخدام لقياس جليكوزيلاز الحمض النووي.

Abstract

يعد اليوراسيل - الحمض النووي غليكوزيلاز (UDG) مكونا رئيسيا في مسار إصلاح استئصال القاعدة لتصحيح اليوراسيل المتكون من إزالة الأمين المائي للسيتوزين. وبالتالي ، فمن الأهمية بمكان للحفاظ على سلامة الجينوم. ووضعت طريقة محددة للغاية وغير موسومة وغير نظائر مشعة لقياس نشاط ال UDG. تم شق دوبلكس الحمض النووي الاصطناعي الذي يحتوي على يوراسيل خاص بالموقع بواسطة UDG ثم تم إخضاعه لتحليل الطيف الكتلي للامتصاص بالليزر / التأين بمساعدة المصفوفة (MALDI-TOF MS). تم إنشاء بروتوكول للحفاظ على منتج موقع apurinic / apyrimidinic (AP) في الحمض النووي دون كسر حبل. تم استخدام التغيير في قيمة m / z من الركيزة إلى المنتج لتقييم التحلل المائي لليوراسيل بواسطة UDG. تم استخدام الركيزة G:U للتحليل الحركي UDG مما أسفر عن Km = 50 nM ، Vmax = 0.98 nM / s ، و Kcat = 9.31 s-1. أدى تطبيق هذه الطريقة على اختبار مثبط جليكوزيلاز اليوراسيل (UGI) إلى قيمة IC50 تبلغ 7.6 جزء في المليون. أظهرت خصوصية UDG باستخدام uracil في مواقع مختلفة داخل ركائز الحمض النووي المفردة والمزدوجة التي تقطعت بها السبل كفاءات انقسام مختلفة. وبالتالي ، يمكن أن تكون طريقة MALDI-TOF MS البسيطة والسريعة ومتعددة الاستخدامات طريقة مرجعية ممتازة لمختلف جليكوزيلاز الحمض النووي أحادي الوظيفة. كما أن لديها القدرة كأداة لفحص مثبطات الحمض النووي للجليكوزيلاز.

Introduction

على الرغم من أن اليوراسيل هو قاعدة طبيعية في الحمض النووي الريبي ، إلا أنه آفة شائعة ومطفرة للغاية في الحمض النووي الجينومي. يمكن أن ينشأ Uracil من إزالة الأمين المائي التلقائي / الأنزيمي من deoxycytidine. في كل خلية حية ، يحدث هذا التطهير 100-500 مرة في اليوم في ظل الظروف الفسيولوجية1,2. إذا لم يتم إصلاح هذه التعديلات ، فقد يكون هناك تغيير في تكوين تسلسل الحمض النووي ، مما يسبب طفرة. نظرا لأن اليوراسيل في الحمض النووي يفضل الاقتران مع dATP أثناء التكرار ، إذا كان السيتوزين يزيل الأمينات إلى اليوراسيل ، في حدثين للتكرار ، ستكون هناك طفرة انتقالية جديدة من G:C إلى A:T في نصف الحمض النووي للذرية 3.

من بين الاستراتيجيات الخلوية للحفاظ على الاستقرار الوراثي ، يعد إصلاح استئصال القاعدة (BER) آلية أساسية لإصلاح القواعد التالفة ، مثل اليوراسيل ، في DNA4. BER هي عملية محفوظة تطوريا للغاية. هناك مساران عامان ل BER: مسار التصحيح القصير المؤدي إلى مسار إصلاح لنيوكليوتيد واحد ومسار التصحيح الطويل الذي ينتج مسارا لإصلاح اثنين على الأقل من النيوكليوتيدات 5. BER هي آلية منسقة تحدث في عدة خطوات. الخطوة الأولى في BER هي التحلل المائي الأنزيمي لقاعدة النيوكليوتيدات التالفة بواسطة جليكوزيلاز الحمض النووي الخاص بالتلف لتوليد موقع وسيط أبورينيك / أبيريميدينيك (AP) 6. ويتبع ذلك انقسام العمود الفقري للسكر والفوسفات في موقع AP بواسطة endonuclease ، وينتهي تنظيف الحمض النووي بواسطة لياز ، وملء الفجوة بواسطة بوليميراز الحمض النووي ، وختم النيك النهائي بواسطة ligase5.

يقوم اليوراسيل-الحمض النووي غليكوزيلاز (UDG) بتحلل اليوراسيل من الحمض النووي المحتوي على اليوراسيل ل BER في الإشريكية القولونية. عادة ما تكون فحوصات UDG التقليدية باستخدام الحمض النووي الموسوم إشعاعيا والتي تنطوي على تقنيات فصل مختلفة6،7،8،9،10،11،12،13 تستغرق وقتا طويلا وكثيفة العمالة ، مع كواشف وضع العلامات المكلفة ، والإجراءات المعقدة ، وتتطلب تدريبا وممارسة مكثفين للحد من مخاطر التعرض للمواد المشعة. تم تطوير مقايسات أوليغونوكليوتيد الفلورومترية كبديل لوضع العلامات على النظائر المشعة14، بالإضافة إلى المنارات الجزيئية وتكنولوجيا نقل طاقة الرنين Förster15,16,17,18,19,20. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى وضع علامات محددة لجميع الطرق المذكورة أعلاه. تم مؤخرا تطوير اختبارات أجهزة الاستشعار الحيوية الخالية من الملصقات 21،22،23 وطرق قياس الألوان القائمة على تشكيل G-quadruplex24،25،26. ومع ذلك ، فإن أزواج A: U المتعددة أو التسلسلات المصممة خصيصا في المجسات تعقد تعريف وحدة الإنزيم.

MALDI-TOF MS هي تقنية يمكن أن تكون ذات فائدة كبيرة في تحليل الحمض النووي. وتشمل التطبيقات التي تم تطويرها التنميط الجيني متعدد الأشكال أحادي النوكليوتيدات27،28، وتحليل النيوكليوتيدات المعدلة29، وتحديد وسيط إصلاح الحمض النووي30،31،32،33،34. يجب اعتماد MALDI-TOF MS بسهولة لتحليل جليكوزيلاز الحمض النووي للكشف عن منتجات الحمض النووي التي تحتوي على موقع AP. ومع ذلك ، فإن مواقع AP في الحمض النووي عرضة لكسر الخيوط في ظل العديد من الظروف التجريبية 33. يتم عرض فحص UDG هنا باستخدام MALDI-TOF MS لقياس إنتاج موقع AP مباشرة دون ضوضاء كبيرة في كسر الحبل السري. هذه الطريقة الخالية من الملصقات سهلة الاستخدام ولديها إمكانات عالية للتطبيق الصيدلاني لفحص مثبطات الحمض النووي للجليكوزيلاز.

Protocol

1. إعداد الركيزة / القالب

  1. تصميم الركيزة / قالب اليوراسيل دوبلكس مع محتوى G + C متوازن من ~ 50 ± 10 ٪ والحد الأدنى من درجة حرارة الانصهار من 50 درجة مئوية لمنطقة دوبلكس.
    ملاحظة: يساعد اختلاف واحد في النيوكليوتيدات بين ركائز 18 nt وقوالب 19 nt (الجدول 1 والشكل 1) على تحسين تفسير إشارة MS والتلدين المناسب. يعمل شريط القالب كحمض نووي تكميلي لتوليد عدم تطابق A-U أو G-U (الجدول 1) ولكن يمكن استخدامه أيضا كإشارة مرجعية في قياسات MS. استخدام أوليغونوكليوتيدات الاصطناعية المنقاة من HPLC مرض لهذه الدراسة.
  2. يذوب الحمض النووي في 1 mM EDTA و 10 mM Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 8.0 عند 25 درجة مئوية) (TE) بتركيز 100 ميكرومول / لتر كمخزون ويخزن عند -20 درجة مئوية. قم بتخفيف هذا المخزون 20 ميكرولتر مع TE إلى حجم نهائي قدره 800 ميكرولتر (تخفيف 25 ضعفا إلى 4 ميكرومول / لتر). قم بقياس امتصاص محلول الحمض النووي في مقياس الطيف الضوئي المرئي للأشعة فوق البنفسجية عند λ = 260 نانومتر لضمان التركيز المعين من قبل الشركة المصنعة. على سبيل المثال: A260 = 0.204 ل 4 ميكرومول / لتر من U + 9 و A260 = 0.192 ل 4 ميكرومول / لتر من T1 (الجدول 1).
  3. إجراء تحليل MALDI-TOF MS (الأقسام 4-6) لمراقبة جودة أوليغونوكليوتيد من خلال فحص إشارات الذروة الفريدة عند قيم M/Z المعينة وكذلك عن طريق التحقق من أن نسبة الإشارة إلى الضوضاء هي >100 (الشكل 1B والشكل 1D).

2. فحص الحمض النووي غليكوزيلاز

  1. باستخدام ركيزة G:U من T1 / U + 9 المزدوجة (الجدول 1 والشكل 1A) لتفاعل الجليكوسيلاز ، على سبيل المثال ، في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم 1.5 مل ، أضف 70 ميكرولتر من H2O ، و 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتفاعل UDG 10x ، و 5 ميكرولتر من مخزون T1 ، و 5 ميكرولتر من مخزون U + 9 (الخطوة 1.2).
    ملاحظة: اختر النوع الصحيح من الماصة الدقيقة واتبع تعليمات الشركات المصنعة للتعامل مع وحدة التخزين المطلوبة. على سبيل المثال ، استخدم ماصة 2 ميكرولتر لتوزيع 0.1-2 ميكرولتر من السائل ، واستخدم ماصة 10 ميكرولتر لتوزيع 2-10 ميكرولتر من السائل ، واستخدم ماصة 100 ميكرولتر لتوزيع 20-100 ميكرولتر من السائل لضمان دقة ودقة النتائج. الحجم الموصوف لمزيج الكاشف هو ل 10 مقاييسات. ضبط مستوى الصوت لعدد التفاعلات المطلوب. يحتوي المخزن المؤقت لتفاعل UDG 1x على 1 mM EDTA و 1 mM dithiothreitol و 20 mM Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 8.0 عند 25 درجة مئوية). راجع جدول المواد لمعرفة مصدر المخزن المؤقت لتفاعل UDG بمعدل 10 أضعاف.
  2. أغلق الأنبوب بإحكام. احتضن في حمام مائي لمدة 30 دقيقة عند 65 درجة مئوية ، ثم لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، وأخيرا على الجليد لمدة 3 دقائق لضمان التلدين السليم للركيزة / القالب على الوجهين.
  3. في أنبوب الطرد المركزي الدقيق المعقم سعة 1.5 مل ، أضف 49 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتفاعل 1x UDG البارد و 1 ميكرولتر من UDG (5000 وحدة / مل ؛ انظر جدول المواد) ، مع التخفيف إلى 0.1 وحدة / ميكرولتر. قم بإجراء تخفيفات تسلسلية باستخدام مخزن مؤقت UDG 1x إلى تركيزات الإنزيم المطلوبة من 0.05 أو 0.02 أو 0.01 وحدة / ميكرولتر.
    ملاحظة: في تفاعل 10 ميكرولتر، يمكن ل 0.1 وحدة من UDG شق أكثر من 30 بمول من اليوراسيل من دوبلكس T1/U+9 في 3 دقائق.
  4. في أنبوب الطرد المركزي الدقيق المعقم سعة 1.5 مل ، أضف 9.0 ميكرولتر من مزيج الركيزة من الخطوة 2.2 وقم بتسخين الأنبوب إلى 37 درجة مئوية. أضف 1.0 ميكرولتر من UDG المخفف من الخطوة 2.3. استخدم مؤقت لتوقيت التفاعل وقم بتحريك الأنبوب لخلط المحتويات.
    ملاحظة: بالنسبة لفحص تعريف الوحدة، يكون وقت الحضانة 30 دقيقة. لإجراء فحص حركي ، استخدم تحليلا زمنيا من 0.5 ، 1 ، 2 ، 3 ، 5 دقائق للحصول على المعدل الأولي. لإجراء فحص تثبيط UGI ، قم بتوقيت التفاعل لمدة 15 دقيقة.
  5. قم بطرد الأنابيب مركزيا باستخدام خليط التفاعل لمدة 3-5 ثانية عند 3200 × جم عند درجة الحرارة المحيطة. ثم انقل التفاعل على الفور إلى 37 درجة مئوية.
  6. إنهاء التفاعل
    1. إعداد حلول من 0.25 M HCl و 0.23 M Tris قاعدة. في أنبوب اختبار 15 مل ، أضف 10 مل من محلول 1 mM EDTA و 20 mM Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 8.0 عند 25 درجة مئوية) لتقليد المخزن المؤقت لتفاعل UDG 1x. تحمض مع 1 مل من 0.25 M HCl وتحقق مع مقياس الرقم الهيدروجيني للتأكد من أن الرقم الهيدروجيني هو ~ 2 ± 0.5. قم بالتحييد باستخدام 1 مل من قاعدة Tris 0.23 M وتحقق باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني للحصول على درجة حموضة نهائية تبلغ 6.5 ± 0.5.
      ملاحظة: يعد استخدام شرائط اختبار الأس الهيدروجيني طريقة سريعة وسهلة لإعادة تأكيد مستويات الأس الهيدروجيني لمزيج الكاشف.
    2. أضف 1 ميكرولتر من 0.25 M HCl لتحمض خليط تفاعل 10 ميكرولتر لتعطيل الإنزيم ووضعه على الجليد لمدة 6 دقائق. أضف 1 ميكرولتر من قاعدة 0.23 M Tris لتحييد منتجات الحمض النووي لتجنب كسر موقع AP عن طريق التعرض الطويل للحمض. أضف 13 ميكرولتر TE لزيادة حجم خليط المنتج لنقل رقاقة المصفوفة ثم ضعه على الثلج.
      ملاحظة: منتج AP غير مستقر كيميائيا ويجب تحليله بواسطة MALDI-TOF MS في غضون 2 أيام. بعد التخزين المطول لأكثر من أسبوع ، يحدث تراكم جزء كبير من فواصل الخيوط بسبب تفاعلات التخلص من β / δ لمنتجات AP (الشكل 1D-G).
  7. انقل جميع منتجات تفاعل UDG سعة 25 ميكرولتر من أنابيب الطرد المركزي الدقيق إلى صفيحة ميكروتيتر 384 بئرا.
    ملاحظة: التركيزات العالية من الكاتيونات ، مثل الصوديوم أو البوتاسيوم في المخازن المؤقتة ، تولد تداخلا في تحليل MALDI-TOF MS وبالتالي تتطلب تحلية المياه. نظرا لأن المخزن المؤقت لتفاعل E. coli UDG يحتوي على تركيزات منخفضة جدا من الكاتيونات ، فإن تحلية المياه ليست ضرورية. ومع ذلك ، قم بتعديل هذا البروتوكول لقياس تفاعلات غليكوزيلاز الحمض النووي الأخرى التي تحتوي على كاتيونات معدنية تتطلب تحلية المياه كما هو موضح سابقا35.

3. نقل منتجات تفاعل UDG إلى شريحة مصفوفة

  1. افتح باب موزع النانولتر (انظر جدول المواد) وقم بتحميل لوحة الميكروتيتر 384 بئر من الخطوة 2.7 على حامل اللوحة في سطح السفينة.
  2. أدخل صفيف رقاقة المصفوفة في موضع لوحة الكشافة المقابل. ضع لوحة الكشافة المحملة على سطح المعالجة الخاص بموزع النانولتر وأغلق الباب.
  3. المس زر التشغيل على شاشة النقل، وانتظر حتى يبدأ الجهاز في توزيع العينات من لوحة الميكروتيتر 384 بئر إلى شريحة المصفوفة.
  4. استخدم خيار علامة التبويب Vision لإظهار صورة الشريحة ووحدات تخزين التوزيع لكل بقعة أثناء التوزيع. تأكد من أن الحجم المرقط على الشريحة يتراوح بين 5-10 نانولتر.

4. إعداد معلمات الفحص على مطياف الكتلة

  1. استخدم البرنامج التطبيقي (انظر جدول المواد) لإعداد ملف .xlsx يحتوي على قيمة m/z المتوقعة للإشارة للاستيراد.
    ملاحظة: الإعدادات في FILE I.xlsx (الجدول 2) هي أمثلة على إعدادات فحص UDG للركيزة G:U في القسم 2.
  2. استخدم برنامج التطبيق لإنشاء فحص UDG جديد وتعريفه بالنقر بزر الماوس الأيمن فوق الخيار استيراد مجموعة مقايسة بتنسيق المصمم وتحديد ملف .xlsx من القائمة المنسدلة (على سبيل المثال، FILE I.xlsx من الخطوة 4.1).
  3. انقر بزر الماوس الأيمن فوق الزر Customer:Project:Plate وانقر فوق الجزء العلوي من شجرة الخيارات المنسدلة لإنشاء لوحة فحص جديدة. في مربع الحوار، اكتب اسم ملف (على سبيل المثال، CTT20210620 لرمز المختبر وتاريخ الفحص)، وفي القائمة المنسدلة نوع اللوحة ، حدد نوع اللوحة 384 بئرا واضغط على موافق. ابحث عن لوحة فارغة لتظهر على يسار الشاشة.
  4. انقر فوق خيار المقايسة ; حدد الفحص (على سبيل المثال، FILE I.xlsx) من القائمة المنسدلة.
  5. لتعيين المقايسة المحددة (على سبيل المثال، FILE I.xlsx) لكل موضع بقعة عينة على اللوحة، حرك المؤشر إلى كل موضع من مواضع اللوحة الفارغة، وانقر لتمييز البئر، وانقر بزر الماوس الأيمن لتحديد إضافة بلكس.
  6. استخدم كمبيوتر سطح مكتب أو كمبيوتر محمول لإعداد قائمة عمل بتنسيق .xlsx بدون رأس (على سبيل المثال، 0620.xlsx من الجدول 3) لجميع العينات الموجودة على الشريحة من الخطوة 2.7. انقر فوق الزر إضافة نموذج مشروع جديد ؛ حدد الملف (على سبيل المثال، 0620.xlsx) من القائمة المنسدلة لاستيراد قائمة العمل.
  7. ابحث عن جميع رموز نماذج الاختبار في قائمة العمل (على سبيل المثال، من 0620.xlsx) على يسار الشاشة. انقر فوق نموذج التعليمات البرمجية في قائمة العمل، وانقر بزر الماوس الأيمن فوق الموضع المقابل للوحة لربط الاختبارات بكل موضع.

5. تشغيل مطياف الكتلة

  1. استخدم البرنامج التطبيقي لربط مطياف الكتلة (انظر جدول المواد) بشريحة العينة (من القسم 3) المراد تحليلها.
  2. انقر على الإعداد الافتراضي. في مربع الحوار، اكتب اسم ملف من الخطوة 4.3 (على سبيل المثال، CTT20210620)؛ في اسم التجربة، اكتب معرف الشريحة في الباركود الخاص بالشريحة، واحفظ الإعدادات.
  3. ابدأ برنامج التحكم في مطياف الكتلة (انظر جدول المواد).
  4. اضغط على زر الإدخال/الخروج الخاص بمقياس الطيف الكتلي واترك سطح السفينة يتمدد. أخرج حامل الشريحة وأدخل شريحة العينة من الخطوة 3.4 في حامل الشريحة. ضع حامل الشريحة المحملة على السطح الممتد واضغط على زر الإدخال/الخروج لتدخل شريحة العينة إلى الجهاز.
  5. انقر نقرا مزدوجا فوق رمز الحصول على برنامج التطبيق. في النافذة الحصول على، انقر فوق علامة التبويب تشغيل تلقائي لبدء تشغيل الأداة والحصول على أطياف الكتلة من العينات الموجودة على الشريحة.

6. عرض أطياف الكتلة وتحليل البيانات

  1. قم بتشغيل برنامج تحليل البيانات (انظر جدول المواد).
  2. استعرض شجرة قاعدة البيانات وحدد معرف الشريحة من الخطوة 5.2. انقر لتسليط الضوء على هدف جيدا على الشريحة ، وانقر فوق رمز الطيف لإظهار الطيف الكتلي.
  3. انقر بزر الماوس الأيمن لاختيار مربع حوار التخصيص لاقتصاص نطاق معين من الطيف في نافذة جديدة. انقر فوق X-Axis لكتابة الحدود العليا والسفلية ل m/z، واضغط على موافق ( OK) لإظهار طيف النطاق المحدد، بما في ذلك إشارات الاهتمام.
    ملاحظة: تتناسب كمية الحمض النووي مع شدة الذروة في كل وحدة قيمة m/z.
  4. قم بقياس ارتفاع الذروة لقيم m/z للإشارات المقابلة للركيزة U والمنتج AP والقالب. انقر على الذروة واعرض ارتفاع الذروة في الزاوية العلوية اليسرى من الشاشة.
    ملاحظة: يعد الطيف الذي يبلغ عرضه 1600 / 1200 وحدة بعدا معقولا للفحص على شاشة الكمبيوتر وكذلك لحفظ السجلات.
  5. لحفظ الطيف لحفظ السجلات، انقر بزر الماوس الأيمن فوق تصدير وحدد نوع ملف JPEG في القائمة المنسدلة. انقر فوق الوجهة وتصفح القرص لتحديد جهاز التخزين في القائمة المنسدلة (على سبيل المثال ، قرص فلاش E:). اكتب اسم الملف (على سبيل المثال، 0620_1-2.jpg) وانقر فوق تصدير.
  6. إذا لزم الأمر، اطبع ملف JPEG تم تصديره وقم بقياس ارتفاع الذروة يدويا باستخدام مسطرة.

النتائج

القوالب والركائز
مع أخذ oligonucleotides الاصطناعية مع U في الوسط (U + 9) مقترنة بقالب G كمثال (الشكل 1A) ، يمكن استخدام تحكم فارغ في الكميات متساوية المولار من القالب والركيزة المحتوية على اليوراسيل لمراقبة جودة نقاء oligonucleotide الاصطناعي (الشكل 1B ؛ تتطابق الإش...

Discussion

توفر هذه الورقة إجراء مفصلا لاستخدام طريقة فحص UDG MALDI-TOF MS للكشف مباشرة عن منتجات الحمض النووي المحتوية على AP. المزايا الرئيسية لهذه الطريقة هي أن الركائز التي تحتوي على اليوراسيل خالية من الملصقات ، وقابلة للتطوير ، وسهلة العمل معها ، وتوفر مرونة أكبر في تصميم الركيزة.

يتيح ?...

Disclosures

وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgements

نشكر المرفق الأساسي المتكامل لعلم الجينوم الوظيفي التابع للمجلس الوطني لعلم الجينوم الوظيفي (تايبيه، تايوان) ومختبر الجينوم الدوائي NRPB (تايبيه، تايوان) على دعمهما التقني. تم دعم هذا العمل من قبل وزارة العلوم والتكنولوجيا ، تايوان ، R.O.C. [رقم المنحة MOST109-2314-B-002 -186 إلى K.-Y.S. ، ومعظمها 107-2320-B-002-016-MY3 إلى S.-Y.C. ، ومعظمها 110-2320-B-002-043 إلى W.-h.F.]. H.-L.C. حاصل على زمالة الدكتوراه من جامعة تايوان الوطنية. تمويل رسوم الوصول المفتوح: وزارة العلوم والتكنولوجيا، R.O.C.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol (Tris base)J.T bakerProtocol 1,2
Autoclaved deionized waterMILLIPOREProtocol 1,2
EDTAJ.T BakerProtocol 1,2
GlovesAQUAGLOVEProtocol 1,2,3
Hydrochloric acid (HCl)SIGMAProtocol 1,2
Ice bucketTaiwan.IncProtocol 2
Low retention pipette tips(0.5-10 µL)extra geneProtocol 1,2
Low retention pipette tips(1,250 µL)national scientific supply co, Inc.Protocol 1,2
Low retention pipette tips(200 µL)national scientific supply co, Inc.Protocol 1,2
MassARRAY Agena Bioscience, CAProtocol 4, 5
Mass spectrometry control programs include Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE, and Start RT Process.
MassARRAY NanodispenserAAT Bioquest, Inc.RS1000Protocol 3
MicrocentrifugeKubotaProtocol 2
MicrocentrifugeClubioProtocol 2
Microcentrifuge tube (1.5 mL)National scientific supply co, Inc.Protocol 2
Microcentrifuge tube rackTaiwan.IncProtocol 1,2
Micropipette  (P1000)GilsonProtocol 1,2
Micropipette  (P2)GilsonProtocol 1,2
Micropipette (P10)GilsonProtocol 1,2
Micropipette (P100)GilsonProtocol 1,2
Micropipette (P200)GilsonProtocol 1,2
Micropipette (SL2)RaininProtocol 1,2
OligonucleotidesIntegrated DNA Technologies (Singapore)Protocol 1,2
Quest Graph IC50 Calculator (v.1)AAT Bioquest, Inc.Fig. 4
https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1
Sodium hydroxide (NaOH)WAKOProtocol 2
SpectroCHIP array Agena Bioscience, CA#01509Protocol 3, 5
TimerTaiwan.IncProtocol 2
Typer 4.0 software Agena Bioscience, CA#10145Protocol 6
Typer 4.0 consists four programs including Assay Designer, Assay Editor, Plate Editor, and Typer Analyzer.
UDG Reaction Buffer (10x)New England Biolabs, MAB0280SProtocol 2
Uracil Glycosylase InhibitorNew England Biolabs, MAM0281SProtocol 2
Uracil-DNA GlycosylaseNew England Biolabs, MAM0280LProtocol 2
UV-VISBLE spectrophotometer UV-1601SHIMADZUProtocol 1
Water bathZETA ZC-4000 (Taiwan.Inc)Protocol 2

References

  1. Frederico, L. A., Kunkel, T. A., Shaw, B. R. A sensitive genetic assay for the detection of cytosine deamination: determination of rate constants and the activation energy. Biochemistry. 29 (10), 2532-2537 (1990).
  2. Kavli, B., Otterlei, M., Slupphaug, G., Krokan, H. E. Uracil in DNA-General mutagen, but normal intermediate in acquired immunity. DNA Repair. 6 (4), 505-516 (2007).
  3. Duncan, B. K., Miller, J. H. Mutagenic deamination of cytosine residues in DNA. Nature. 287 (5782), 560-561 (1980).
  4. Gros, L., Saparbaev, M. K., Laval, J. Enzymology of the repair of free radicals-induced DNA damage. Oncogene. 21 (58), 8905-8925 (2002).
  5. Robertson, A. B., Klungland, A., Rognes, T., Leiros, I. Base excision repair: The long and short of it. Cellular and Molecular Life Sciences. 66 (6), 981-993 (2009).
  6. Lindahl, T. An N-glycosidase from Escherichia coli that releases free uracil from DNA containing deaminated cytosine residues. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (9), 3649-3653 (1974).
  7. Caradonna, S. J., Cheng, Y. C. Uracil DNA-glycosylase. Purification and properties of this enzyme isolated from blast cells of acute myelocytic leukemia patients. Journal of Biological Chemistry. 255 (6), 2293-2300 (1980).
  8. Krokan, H., Urs Wittwer, C. Uracil DNA-glycosylase from HeLa cells: general properties, substrate specificity and effect of uracil analogs. Nucleic Acids Research. 9 (11), 2599-2614 (1981).
  9. Tchou, J., et al. 8-oxoguanine (8-hydroxyguanine) DNA glycosylase and its substrate specificity. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (11), 4690-4694 (1991).
  10. Knævelsrud, I., et al. Excision of uracil from DNA by the hyperthermophilic Afung protein is dependent on the opposite base and stimulated by heat-induced transition to a more open structure. Mutation Research-DNA Repair. 487 (3-4), 173-190 (2001).
  11. Minko, I. G., et al. Recognition of DNA adducts by edited and unedited forms of DNA glycosylase NEIL1. DNA Repair. 85, 102741 (2020).
  12. Bennett, S. E., Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. Processivity of Escherichia coli and rat liver mitochondrial uracil-DNA glycosylase is affected by NaCl concentration. Biochemistry. 34 (18), 6109-6119 (1995).
  13. Xia, L., O'Connor, T. R. DNA glycosylase activity assay based on streptavidin paramagnetic bead substrate capture. Analytical Biochemistry. 298 (2), 322-326 (2001).
  14. Kreklau, E. L., et al. A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O(6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase. Nucleic Acids Research. 29 (12), 2558-2566 (2001).
  15. Liu, B., et al. Real-time monitoring of uracil removal by uracil-DNA glycosylase using fluorescent resonance energy transfer probes. Analytical Biochemistry. 366 (2), 237-243 (2007).
  16. Zhang, L., Zhao, J., Jiang, J., Yu, R. A target-activated autocatalytic DNAzyme amplification strategy for the assay of base excision repair enzyme activity. Chemical Communications. 48 (70), 8820-8822 (2012).
  17. Zhou, D. M., et al. Graphene oxide-hairpin probe nanocomposite as a homogeneous assay platform for DNA base excision repair screening. Biosensors and Bioelectronics. 41, 359-365 (2013).
  18. Wang, X., Hou, T., Lu, T., Li, F. Autonomous exonuclease iii-assisted isothermal cycling signal amplification: A facile and highly sensitive fluorescence DNA glycosylase activity assay. Analytical Chemistry. 86 (19), 9626-9631 (2014).
  19. Wu, Y., Wang, L., Zhu, J., Jiang, W. A DNA machine-based fluorescence amplification strategy for sensitive detection of uracil-DNA glycosylase activity. Biosensors and Bioelectronics. 68, 654-659 (2015).
  20. Xi, Q., Li, J. J., Du, W. F., Yu, R. Q., Jiang, J. H. A highly sensitive strategy for base excision repair enzyme activity detection based on graphene oxide mediated fluorescence quenching and hybridization chain reaction. Analyst. 141 (1), 96-99 (2016).
  21. Liu, X., et al. A novel electrochemical biosensor for label-free detection of uracil DNA glycosylase activity based on enzyme-catalyzed removal of uracil bases inducing strand release. Electrochimica Acta. 113, 514-518 (2013).
  22. McWilliams, M. A., Anka, F. H., Balkus, K. J., Slinker, J. D. Sensitive and selective real-time electrochemical monitoring of DNA repair. Biosensors and Bioelectronics. 54, 541-546 (2014).
  23. Jiao, F., et al. A novel and label-free biosensors for uracil-DNA glycosylase activity based on the electrochemical oxidation of guanine bases at the graphene modified electrode. Talanta. 147, 98-102 (2016).
  24. Liu, X., et al. Label-free colorimetric assay for base excision repair enzyme activity based on nicking enzyme assisted signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 54, 598-602 (2014).
  25. Nie, H., Wang, W., Li, W., Nie, Z., Yao, S. A colorimetric and smartphone readable method for uracil-DNA glycosylase detection based on the target-triggered formation of G-quadruplex. Analyst. 140 (8), 2771-2777 (2015).
  26. Du, Y. C., Jiang, H. X., Huo, Y. F., Han, G. M., Kong, D. M. Optimization of strand displacement amplification-sensitized G-quadruplex DNAzyme-based sensing system and its application in activity detection of uracil-DNA glycosylase. Biosensors and Bioelectronics. 77, 971-977 (2016).
  27. Haff, L. A., Smirnov, I. P. Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry. Genome Research. 7 (4), 378-388 (1997).
  28. Blondal, T., et al. A novel MALDI-TOF based methodology for genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Research. 31 (24), 155 (2003).
  29. Cui, Z., Theruvathu, J. A., Farrel, A., Burdzy, A., Sowers, L. C. Characterization of synthetic oligonucleotides containing biologically important modified bases by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 379 (2), 196-207 (2008).
  30. Darwanto, A., Farrel, A., Rogstad, D. K., Sowers, L. C. Characterization of DNA glycosylase activity by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 394 (1), 13-23 (2009).
  31. Redrejo-Rodríguez, M., et al. New insights in the removal of the Hydantoins, oxidation product of pyrimidines, via the base excision and Nucleotide incision repair pathways. PLoS ONE. 6 (7), 21039 (2011).
  32. Prorok, P., et al. Uracil in duplex DNA is a substrate for the nucleotide incision repair pathway in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 3695-3703 (2013).
  33. Alexeeva, M., et al. Excision of uracil from DNA by hSMUG1 includes strand incision and processing. Nucleic Acids Research. 47 (2), 779-793 (2019).
  34. Thapar, U., Demple, B. Deployment of DNA polymerases beta and lambda in single-nucleotide and multinucleotide pathways of mammalian base excision DNA repair. DNA Repair. 76, 11-19 (2019).
  35. Su, K. Y., et al. Proofreading and DNA repair assay using single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (136), e57862 (2018).
  36. Hillenkamp, F., Karas, M., Beavis, R. C., Chait, B. T. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of biopolymers. Analytical Chemistry. 63 (24), 1193-1202 (1991).
  37. Brammer, K. W., Jones, A. S., Mian, A. M., Walker, R. T. Study of the use of alkaline degradation of DNA derivative as a procedure for the determination of nucleotide distribution. Biochimica et Biophysica Acta. 166 (3), 732-734 (1968).
  38. Lindahl, T., Ljungquist, S., Siegert, W., Nyberg, B., Sperens, B. DNA N-glycosidases: properties of uracil-DNA glycosidase from Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 252 (10), 3286-3294 (1977).
  39. Rashtchian, A., Buchman, G. W., Schuster, D. M., Berninger, M. S. Uracil DNA glycosylase-mediated cloning of polymerasechain reaction-amplified DNA: Application to genomic and cDNA cloning. Analytical Biochemistry. 206 (1), 91-97 (1992).
  40. Varshney, U., van de Sande, J. H. Specificities and kinetics of uracil excision from uracil-containing DNA oligomers by Escherichia coli uracil DNA glycosylase. Biochemistry. 30 (16), 4055-4061 (1991).
  41. Delort, A. M., et al. Excision of uracil residues in DNA: Mechanism of action of Escherichia coli and Micrococcus luteus uracil-DNA glycosylases. Nucleic Acids Research. 13 (2), 319-335 (1985).
  42. Wang, Z. G., Smith, D. G., Mosbaugh, D. W. Overproduction and characterization of the uracil-DNA glycosylase inhibitor of bacteriophage PBS2. Gene. 99 (1), 31-37 (1991).
  43. Chang, H. L., et al. Measurement of uracil-DNA glycosylase activity by matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry technique. DNA Repair. 97, 103028 (2021).
  44. Minko, I. G., et al. Catalysts of DNA strand cleavage at apurinic/apyrimidinic sites. Scientific Reports. 6 (1), 28894 (2016).
  45. Lindahl, T. Uracil-DNA glycosylase from Escherichia coli. Methods in Enzymology. 65, 284-290 (1980).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

182 MALDI TOF Uracil DNA apurinic apyrimidinic

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved