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Resumen

Se desarrolló un método no radioisotópico no marcado para evaluar la actividad de la uracilo-ADN glicosilasa utilizando la espectrometría de masas MALDI-TOF para el análisis directo de productos que contienen sitios apurínicos/apirimidínicos. El ensayo demostró ser bastante simple, específico, rápido y fácil de usar para la medición de la GLICosilasa de ADN.

Resumen

La uracilo-ADN glicosilasa (UDG) es un componente clave en la vía de reparación de la escisión de base para la corrección del uracilo formado por la desaminación hidrolítica de la citosina. Por lo tanto, es crucial para el mantenimiento de la integridad del genoma. Se desarrolló un método altamente específico, no etiquetado, no radioisotópico para medir la actividad de UDG. Un dúplex de ADN sintético que contenía un uracilo específico del sitio fue escindido por UDG y luego sometido a un análisis de espectrometría de masas de tiempo de vuelo asistido por láser / ionización asistido por matrix (MALDI-TOF MS). Se estableció un protocolo para preservar el producto del sitio apurínico/apirimidínico (AP) en el ADN sin rotura de hebra. El cambio en el valor m/z del sustrato al producto se utilizó para evaluar la hidrólisis de uracilo por UDG. Se utilizó un sustrato G:U para el análisis cinético UDG que arrojó el Km = 50 nM, Vmax = 0.98 nM/s y Kcat = 9.31 s-1. La aplicación de este método a un ensayo de inhibidor de la uraciloglicosasa (UGI) arrojó un valor de IC50 de 7,6 pM. La especificidad de UDG utilizando uracilo en varias posiciones dentro de sustratos de ADN de cadena simple y doble cadena demostró diferentes eficiencias de escisión. Por lo tanto, este método SIMPLE, rápido y versátil MALDI-TOF MS podría ser un excelente método de referencia para varias glucosilasas de ADN monofuncionales. También tiene el potencial como una herramienta para la detección de inhibidores de la GLUCosilasa de ADN.

Introducción

Aunque el uracilo es una base normal en el ARN, es una lesión común y altamente mutagénica en el ADN genómico. El uracilo puede surgir de la desaminación hidrolítica espontánea/enzimática de una desoxicitidina. En cada célula viva, esta desaminación ocurre 100-500 veces al día en condiciones fisiológicas1,2. Si estas alteraciones no se reparan, puede haber un cambio en la composición de la secuencia de ADN, causando mutación. Como el uracilo en el ADN prefiere emparejarse con dATP durante la replicación, si la citosina se desamina a uracilo, en dos eventos de replicación, habrá una nueva mutación de transición de G:C a A:T en la mitad de la progenie DNA3.

Entre las estrategias celulares para mantener la estabilidad genética, la reparación por escisión de bases (BER) es un mecanismo esencial que repara las bases dañadas, como el uracilo, en el ADN4. BER es un proceso altamente conservado evolutivamente. Existen dos vías generales de BER: la vía de parche corto que conduce a un tracto de reparación de un solo nucleótido y la vía de parche largo que produce un tracto de reparación de al menos dos nucleótidos5. BER es un mecanismo coordinado que se produce en varios pasos. El primer paso en BER es la hidrólisis enzimática de la base de nucleótidos dañada por una GLICosilasa de ADN específica del daño para generar un sitio intermedio apurínico/apirimidínico (AP)6. Esto es seguido por la escisión de la columna vertebral de azúcar-fosfato en el sitio AP por una endonucleasa, la limpieza de los extremos del ADN por una liasa, el llenado de huecos por una ADN polimerasa y el sellado del corte final por una ligasa5.

La uracilo-ADN glicosilasa (UDG) hidroliza el uracilo del ADN que contiene uracilo para BER en Escherichia coli. Los ensayos convencionales de UDG que utilizan ADN radiomarcado que involucran diferentes técnicas de separación6,7,8,9,10,11,12,13 suelen requerir mucho tiempo, mano de obra, con costosos reactivos de etiquetado, procedimientos complicados y que requieren capacitación y práctica intensivas para reducir los riesgos de exposición a materiales radiactivos. Se han desarrollado ensayos fluorométricos de oligonucleótidos como sustituto del etiquetado de radioisótopos14, además de balizas moleculares y tecnología de transferencia de energía de resonancia de Förster15,16,17,18,19,20. Sin embargo, se requiere un etiquetado específico para todos los métodos antes mencionados. Recientemente se han desarrollado ensayos de biosensores libres de etiquetas21,22,23 y métodos colorimétricos basados en la formación de un G-quadruplex24,25,26. Sin embargo, múltiples pares A:U o secuencias especialmente diseñadas en las sondas complican la definición de la unidad enzimática.

MALDI-TOF MS es una tecnología que podría ser de gran utilidad en el análisis de ADN. Las aplicaciones desarrolladas incluyen el genotipado de polimorfismo de un solo nucleótido27,28, el análisis de nucleótidos modificados29 y la identificación intermedia de reparación de ADN30,31,32,33,34. MALDI-TOF MS debe adoptarse fácilmente para el análisis de glicosilasa de ADN para detectar productos de ADN que contienen sitios AP. Sin embargo, los sitios AP en el ADN son propensos a la rotura de hebras bajo muchas condiciones experimentales33. Aquí se presenta un ensayo UDG utilizando MALDI-TOF MS para medir directamente la producción del sitio AP sin un ruido significativo de rotura de hebras. Este método sin etiqueta es fácil de trabajar y tiene un alto potencial para la aplicación farmacéutica de la detección de inhibidores de la GLUCosilasa de ADN.

Protocolo

1. Preparación de sustrato/plantilla

  1. Diseñe sustrato de uracilo / dúplex de plantilla con un contenido equilibrado de G + C de ~ 50 ± 10% y una temperatura de fusión mínima de 50 ° C para la región dúplex.
    NOTA: Una diferencia de nucleótidos entre sustratos de 18 nt y plantillas de 19 nt (Tabla 1 y Figura 1) ayuda a una mejor interpretación de la señal de EM y al recocido apropiado. La hebra de plantilla sirve como ADN complementario para generar desajustes A-U o G-U (Tabla 1), pero también se puede utilizar como señal de referencia en las mediciones de EM. El uso de oligonucleótidos sintéticos purificados con HPLC es satisfactorio para este estudio.
  2. Disolver el ADN en 1 mM EDTA y 10 mM Tris-HCl (pH 8.0 a 25 °C) (TE) a una concentración de 100 μmol/L como caldo y almacenar a -20 °C. Diluir esta cepa de 20 μL con TE a un volumen final de 800 μL (dilución de 25 veces a 4 μmol/L). Mida la absorbancia de la solución de ADN en un espectrofotómetro UV-visible a λ = 260 nm para garantizar la concentración asignada por el fabricante. Por ejemplo: A260 = 0,204 para 4 μmol/L de U+9 y A260 = 0,192 para 4 μmol/L de T1 (Tabla 1).
  3. Realizar el análisis MALDI-TOF MS (secciones 4-6) para el control de calidad de oligonucleótidos inspeccionando señales pico únicas a valores m/z designados, así como comprobando que la relación señal-ruido sea >100 (Figura 1B y Figura 1D).

2. Ensayo de ADN glicosilasa

  1. Usando un sustrato G:U de dúplex T1/U+9 (Tabla 1 y Figura 1A) para la reacción de la glicosilasa, por ejemplo, en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mL, agregue 70 μL de H2O, 10 μL de tampón de reacción 10x UDG, 5 μL de stock T1 y 5 μL de stock U+9 (paso 1.2.).
    NOTA: Elija el tipo correcto de micropipeta y siga las instrucciones del fabricante para manejar el volumen requerido. Por ejemplo, use una pipeta de 2 μL para dispensar 0.1-2 μL de líquido, use una pipeta de 10 μL para dispensar 2-10 μL de líquido y use una pipeta de 100 μL para dispensar 20-100 μL de líquido para garantizar la exactitud y precisión de los resultados. El volumen descrito de la mezcla de reactivos es para 10 ensayos; ajustar el volumen para el número deseado de reacciones. El tampón de reacción 1x UDG contiene 1 mM EDTA, 1 mM de ditiotreitol y 20 mM de Tris-HCl (pH 8.0 a 25 °C). Consulte la Tabla de materiales para la fuente del tampón de reacción UDG 10x.
  2. Cierre el tubo de forma segura; incubar en un baño de agua durante 30 min a 65 °C, luego durante 30 min a 37 °C, y finalmente en hielo durante 3 min para asegurar el recocido adecuado del sustrato/plantilla dúplex.
  3. En un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml, agregue 49 μL de tampón de reacción UDG helado 1x y 1 μL de UDG (5,000 unidades / ml; consulte la Tabla de materiales), diluyendo a 0.1 unidades / μL. Haga diluciones en serie con 1 tampón UDG a las concentraciones enzimáticas deseadas de 0.05, 0.02 o 0.01 unidades / μL. Siempre mantenga el UDG diluido en hielo.
    NOTA: En una reacción de 10 μL, 0,1 unidades de UDG pueden escindir más de 30 pmol de uracilo de un dúplex T1/U+9 en 3 min.
  4. En un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml, agregue 9,0 μL de mezcla de sustrato del paso 2.2 y precaliente el tubo a 37 °C. Añadir 1,0 μL del UDG diluido a partir del paso 2.3. Use un temporizador para cronometrar la reacción y mueva el tubo para mezclar el contenido.
    NOTA: Para un ensayo de definición de unidad, el tiempo de incubación es de 30 min. Para un ensayo cinético, utilice un análisis de curso de tiempo de 0.5, 1, 2, 3, 5 min para obtener la tasa inicial. Para un ensayo de inhibición de UGI, cronometre la reacción durante 15 min.
  5. Centrifugar los tubos con la mezcla de reacción durante 3-5 s a 3.200 × g a temperatura ambiente. Luego, transfiera la reacción inmediatamente a 37 ° C.
  6. Terminación de la reacción
    1. Preparar soluciones de 0,25 M HCl y 0,23 M de base Tris. En un tubo de ensayo de 15 ml, agregue 10 ml de una solución de 1 mM de EDTA y 20 mM de Tris-HCl (pH 8.0 a 25 °C) para imitar 1x tampón de reacción UDG. Acidifique con 1 ml de HCl de 0,25 M y verifique con un medidor de pH para asegurarse de que el pH sea de ~ 2 ± 0.5. Neutralice con 1 mL de base Tris de 0,23 M y compruebe con un medidor de pH un pH final de 6,5 ± 0,5.
      NOTA: El uso de tiras reactivas de pH es una forma rápida y fácil de reconfirmar los niveles de pH de la mezcla de reactivos.
    2. Añadir 1 μL de 0,25 M HCl para acidificar la mezcla de reacción de 10 μL para inactivar la enzima y colocarla en hielo durante 6 min. Agregue 1 μL de base Tris de 0,23 M para neutralizar los productos de ADN y evitar la rotura del sitio AP por exposición prolongada al ácido. Agregue 13 μL TE para aumentar el volumen de la mezcla de productos para la transferencia de virutas de matriz y luego colóquelo en hielo.
      NOTA: El producto AP es químicamente inestable y debe ser analizado por MALDI-TOF MS dentro de los 2 días. Después de un almacenamiento prolongado durante más de una semana, la acumulación de una parte sustancial de las roturas de hebras se produce debido a las reacciones de eliminación de β/δ de los productos AP (Figura 1D-G).
  7. Transfiera todos los productos de reacción UDG de 25 μL de los tubos de microcentrífuga a una placa de microtitulación de 384 pocillos.
    NOTA: Las altas concentraciones de cationes, como el sodio o el potasio en tampones, generan interferencias en el análisis MALDI-TOF MS y, por lo tanto, requieren desalinización. Como el tampón de reacción UDG de E. coli contiene concentraciones muy bajas de cationes, no es necesario desalinizar. Sin embargo, modifique este protocolo para medir otras reacciones de LA ADN glicosilasa que contengan cationes metálicos que requieran desalinización como se describió anteriormente35.

3. Transfiera productos de reacción UDG a un chip de matriz

  1. Abra la puerta del dispensador de nanolitros (consulte la Tabla de materiales) y cargue la placa de microtitulación de 384 pocillos del paso 2.7 en el soporte de la placa de la cubierta.
  2. Inserte la matriz de chips en la posición correspondiente de la placa exploradora. Coloque la placa de exploración cargada en la plataforma de procesamiento del dispensador de nanolitros y cierre la puerta.
  3. Toque el botón de ejecución en la pantalla de transferencia y espere a que el instrumento comience a dispensar muestras desde la placa de microtitulación de 384 pocillos al chip de matriz.
  4. Utilice la opción de la pestaña Visión para mostrar la imagen del chip y los volúmenes de dispensación para cada punto durante la dispensación. Asegúrese de que el volumen manchado en el chip esté en el rango de 5-10 nL.

4. Configure los parámetros de ensayo en el espectrómetro de masas

  1. Utilice el programa de aplicación (consulte la Tabla de materiales) para preparar un archivo .xlsx que contenga el valor de señal previsto m/z para la importación.
    NOTA: La configuración del ARCHIVO I.xlsx (Tabla 2) es una configuración de ejemplo para el ensayo UDG del sustrato G:U de la sección 2.
  2. Utilice el programa de aplicación para crear y definir un nuevo ensayo UDG haciendo clic con el botón derecho en la opción Importar grupo de ensayo en formato de diseñador y seleccionando el archivo .xlsx de la lista desplegable (por ejemplo, ARCHIVO I.xlsx del paso 4.1).
  3. Haga clic con el botón derecho en el botón Cliente:Proyecto:Placa y haga clic en la parte superior del árbol de opciones desplegable para establecer una nueva placa de ensayo. En el cuadro de diálogo, escriba un nombre de archivo (por ejemplo, CTT20210620 para el código de laboratorio y la fecha de ensayo) y, en el menú desplegable Tipo de placa , seleccione el tipo de placa de 384 pocillos y presione OK. Busque una placa en blanco para que aparezca a la derecha de la pantalla.
  4. Haga clic en la opción Ensayo ; seleccione el ensayo (por ejemplo, ARCHIVO I.xlsx) en la lista desplegable.
  5. Para asignar el ensayo seleccionado (por ejemplo, ARCHIVO I.xlsx) a cada posición del punto de muestra en la placa, mueva el cursor a cada posición de la placa en blanco, haga clic para resaltar el pozo y haga clic con el botón derecho para seleccionar Agregar Plex.
  6. Utilice una computadora de escritorio o portátil para preparar una lista de trabajo en formato .xlsx sin encabezado (por ejemplo, 0620.xlsx de la Tabla 3) para todas las muestras en el chip del paso 2.7. Haga clic en el botón Agregar nuevo proyecto de ejemplo; seleccione el archivo (por ejemplo, 0620.xlsx) en la lista desplegable para importar la lista de trabajo.
  7. Busque todos los códigos de muestra de prueba en la lista de trabajo (por ejemplo, de 0620.xlsx) a la izquierda de la pantalla. Haga clic en el código de ejemplo en la lista de trabajo y haga clic con el botón derecho en la posición correspondiente de la placa para vincular las pruebas a cada posición.

5. Funcionamiento del espectrómetro de masas

  1. Utilice el programa de aplicación para vincular el espectrómetro de masas (consulte la Tabla de materiales) al chip de muestra (de la sección 3) que se va a analizar.
  2. Haga clic en la configuración predeterminada. En el cuadro de diálogo, escriba un nombre de archivo del paso 4.3 (por ejemplo, CTT20210620); en el Nombre del experimento, escriba el ID del chip en el código de barras del chip y guarde la configuración.
  3. Inicie el programa de control del espectrómetro de masas (consulte la Tabla de materiales).
  4. Presione el botón de entrada / salida del espectrómetro de masas y deje que la cubierta se extienda. Saque el soporte del chip e inserte el chip de muestra del paso 3.4 en el soporte del chip. Coloque el soporte de chip cargado en la cubierta extendida y presione el botón de entrada / salida para que el chip de muestra ingrese al instrumento.
  5. Haga doble clic en el icono Adquirir del programa de aplicación. En la ventana Adquirir , haga clic en la pestaña de ejecución automática para iniciar el instrumento y adquirir espectros de masas de las muestras del chip.

6. Visualización de espectros de masas y análisis de los datos

  1. Ejecute el programa de análisis de datos (consulte la Tabla de materiales).
  2. Explore el árbol de la base de datos y seleccione el ID del chip en el paso 5.2. Haga clic para resaltar un pozo objetivo en el chip y haga clic en el icono de espectro para mostrar el espectro de masas.
  3. Haga clic con el botón derecho para elegir Cuadro de diálogo de personalización para recortar un rango específico de espectro en una ventana nueva. Haga clic en el eje X para escribir los límites superior e inferior de m/z, y pulse OK para mostrar el espectro de rango especificado, incluidas las señales de interés.
    NOTA: La cantidad de ADN es proporcional a la intensidad máxima en cada unidad de valor m/z.
  4. Mida la altura máxima de los valores m/z de las señales correspondientes al sustrato U, al producto AP y a la plantilla. Haga clic en el pico y vea la altura del pico en la esquina superior izquierda de la pantalla.
    NOTA: Un espectro de 1.600 de ancho/1.200 unidades es una dimensión razonable para la inspección en una pantalla de computadora, así como para el mantenimiento de registros.
  5. Para guardar el espectro para el mantenimiento de registros, haga clic con el botón derecho en Exportar y seleccione tipo de archivo JPEG en la lista desplegable. Haga clic en Destino y Examinar disco para seleccionar el dispositivo de almacenamiento en la lista desplegable (por ejemplo, disco flash E:). Escriba el nombre del archivo (por ejemplo, 0620_1-2.jpg) y haga clic en Exportar.
  6. Si es necesario, imprima un archivo JPEG exportado y mida la altura máxima manualmente con una regla.

Resultados

Plantillas y sustratos
Tomando como ejemplo los oligonucleótidos sintéticos con U en el centro (U+9) emparejados con una plantilla G (Figura 1A), se puede utilizar un control en blanco de las cantidades equimolares de plantilla y sustrato que contiene uracilo para el control de calidad de la pureza de los oligonucleótidos sintéticos (Figura 1B; las señales coinciden con el m/z designado y el bajo ruido de fondo). Para el análisis de los...

Discusión

Este documento proporciona un procedimiento detallado para el uso de un método de ensayo UDG MALDI-TOF MS para detectar directamente productos de ADN que contienen AP. Las principales ventajas de este método son que los sustratos que contienen uracilo no contienen etiquetas, son escalables, fáciles de trabajar y ofrecen una mayor flexibilidad en el diseño del sustrato.

La extracción de fenol/cloroformo recomendada por el proveedor de UDG permite la inactivación de la enzima para evitar l...

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos al NCFPB Integrated Core Facility for Functional Genomics (Taipei, Taiwán) y al Laboratorio de Farmacogenómica del NRPB (Taipei, Taiwán) por su apoyo técnico. Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de Ciencia y Tecnología, Taiwán, R.O.C. [número de subvención MOST109-2314-B-002 -186 a K.-Y.S., MOST 107-2320-B-002-016-MY3 a S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-043 a W.-h.F.]. H.-L.C. ha recibido una beca de doctorado de la Universidad Nacional de Taiwán. Financiación para la tasa de acceso abierto: Ministerio de Ciencia y Tecnología, R.O.C.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol (Tris base)J.T bakerProtocol 1,2
Autoclaved deionized waterMILLIPOREProtocol 1,2
EDTAJ.T BakerProtocol 1,2
GlovesAQUAGLOVEProtocol 1,2,3
Hydrochloric acid (HCl)SIGMAProtocol 1,2
Ice bucketTaiwan.IncProtocol 2
Low retention pipette tips(0.5-10 µL)extra geneProtocol 1,2
Low retention pipette tips(1,250 µL)national scientific supply co, Inc.Protocol 1,2
Low retention pipette tips(200 µL)national scientific supply co, Inc.Protocol 1,2
MassARRAY Agena Bioscience, CAProtocol 4, 5
Mass spectrometry control programs include Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE, and Start RT Process.
MassARRAY NanodispenserAAT Bioquest, Inc.RS1000Protocol 3
MicrocentrifugeKubotaProtocol 2
MicrocentrifugeClubioProtocol 2
Microcentrifuge tube (1.5 mL)National scientific supply co, Inc.Protocol 2
Microcentrifuge tube rackTaiwan.IncProtocol 1,2
Micropipette  (P1000)GilsonProtocol 1,2
Micropipette  (P2)GilsonProtocol 1,2
Micropipette (P10)GilsonProtocol 1,2
Micropipette (P100)GilsonProtocol 1,2
Micropipette (P200)GilsonProtocol 1,2
Micropipette (SL2)RaininProtocol 1,2
OligonucleotidesIntegrated DNA Technologies (Singapore)Protocol 1,2
Quest Graph IC50 Calculator (v.1)AAT Bioquest, Inc.Fig. 4
https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1
Sodium hydroxide (NaOH)WAKOProtocol 2
SpectroCHIP array Agena Bioscience, CA#01509Protocol 3, 5
TimerTaiwan.IncProtocol 2
Typer 4.0 software Agena Bioscience, CA#10145Protocol 6
Typer 4.0 consists four programs including Assay Designer, Assay Editor, Plate Editor, and Typer Analyzer.
UDG Reaction Buffer (10x)New England Biolabs, MAB0280SProtocol 2
Uracil Glycosylase InhibitorNew England Biolabs, MAM0281SProtocol 2
Uracil-DNA GlycosylaseNew England Biolabs, MAM0280LProtocol 2
UV-VISBLE spectrophotometer UV-1601SHIMADZUProtocol 1
Water bathZETA ZC-4000 (Taiwan.Inc)Protocol 2

Referencias

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