JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

שיטה לא מתויגת, לא רדיו-איזוטופית כדי לבדוק פעילות גליקוסילאז uracil-DNA פותחה באמצעות ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF לניתוח מוצר ישיר apurinic / apyrimidinic המכיל אתרים. הבדיקה הוכיחה להיות די פשוט, ספציפי, מהיר, וקל לשימוש עבור מדידת גליקוזילאאז DNA.

Abstract

Uracil-DNA גליקוסילאז (UDG) הוא מרכיב מפתח במסלול תיקון כריתת הבסיס לתיקון של אורסיל שנוצר מ deamination הידרוליטי של ציטוזין. לכן, זה חיוני לתחזוקת שלמות הגנום. פותחה שיטה ספציפית מאוד, שאינה מתויגת, שאינה רדיו-איזוטופית, למדידת פעילות UDG. דופלקס דנ"א סינתטי המכיל אורסיל ספציפי לאתר נבקע על ידי UDG ולאחר מכן היה נתון לפירוק לייזר בסיוע מטריקס / יינון זמן טיסה ספקטרומטריה מסה (MALDI-TOF MS) ניתוח. הוקם פרוטוקול לשימור המוצר של האתר האפוריני/אפירימידיני (AP) בדנ"א ללא שבירת גדילים. השינוי בערך m/z מהמצע למוצר שימש להערכת הידרוליזת אורסיל על ידי UDG. מצע G:U שימש לניתוח קינטי של UDG שהניב את ה- Km = 50 nM, Vmax = 0.98 nM/ s, ו- Kcat = 9.31 s-1. יישום של שיטה זו למעכב גליקוסילאז uracil (UGI) בדיקה הניבה ערך IC50 של 7.6 pM. הספציפיות של UDG באמצעות uracil בעמדות שונות בתוך מצעים DNA חד גדילי כפול תקוע כפול הדגים יעילות מחשוף שונה. לפיכך, שיטת MALDI-TOF MS פשוטה, מהירה ורב-תכליתית זו יכולה להיות שיטת התייחסות מצוינת לגליקוסילות DNA מונו-תעשייתיות שונות. יש לו גם את הפוטנציאל ככלי עבור DNA גליקוסילאז מעכב הקרנה.

Introduction

למרות uracil הוא בסיס נורמלי ב RNA, זה נגע נפוץ מאוד mutagenic מאוד בדנ"א גנומי. אורסיל יכול לנבוע מזיהום הידרוליטי ספונטני/אנזימטי של דיאוקסיציטדין. בכל תא חי, זיהום זה מתרחש 100-500 פעמים ביום בתנאים פיזיולוגיים1,2. אם שינויים אלה אינם מתוקנים, יכול להיות שינוי בהרכב רצף ה- DNA, גרימת מוטציה. כמו uracil ב- DNA מעדיף לזווג עם dATP במהלך השכפול, אם ציטוסין deaminates כדי uracil, בשני אירועי שכפול, תהיה מוטציה חדשה G:C כדי A:T מעבר במחצית DNA הצאצאים3.

בין האסטרטגיות התאיות לשמירה על יציבות גנטית, תיקון כריתת בסיס (BER) הוא מנגנון חיוני המתקנת בסיסים פגומים, כגון אורסיל, ב- DNA4. BER הוא תהליך שמור מאוד אבולוציונית. ישנם שני מסלולי BER כלליים: מסלול התיקון הקצר המוביל למערכת תיקון של נוקלאוטיד יחיד ומסלול התיקון הארוך המייצר מערכת תיקון של לפחות שני נוקלאוטידים5. BER הוא מנגנון מתואם המתרחש במספר שלבים. הצעד הראשון ב- BER הוא ההידרוליזה האנזימטית של בסיס הנוקלאוטיד הפגוע על ידי גליקוסילאז DNA ספציפי לנזק כדי ליצור אתר ביניים אפורני /אפירימידיני (AP)6. זה ואחריו המחשוף של עמוד השדרה סוכר-פוספט באתר AP על ידי אנדונוקלאז, ניקוי של ה- DNA מסתיים על ידי ליאז, מילוי פערים על ידי פולימראז DNA, ואיטום הניק הסופי על ידי ligase5.

גליקוסיל-DNA (UDG) עובר הידרוליזה של האורסיל מדנ"א המכיל אורסיל עבור BER באשריצ'יה קולי. בדיקות UDG קונבנציונליות באמצעות DNA עם תווית רדיואקטיבית הכוללות טכניקות הפרדה שונות6,7,8,9,10,11,11,12,13 הן בדרך כלל גוזלות זמן, דורשות עבודה אינטנסיבית, עתירות עבודה, עם ריאגנטים יקרים לתיוג, הליכים מסובכים, ודורש הכשרה ותרגול אינטנסיביים כדי להפחית את הסיכונים של חשיפה לחומרים רדיואקטיביים. בדיקות oligonucleotide פלואורומטריות פותחו כתחליף לתיוג רדיואיזוטופ14, בנוסף למשואות מולקולריות וטכנולוגיית העברת אנרגיה תהודה של Förster15,16,17,18,19,20. עם זאת, תיוג ספציפי נדרש עבור כל השיטות הנ"ל. לאחרונה פותחו ביו-סנסורים נטולי תוויות21,22,23 ושיטות צבע המבוססות על היווצרות של G-quadruplex24,25,26. עם זאת, זוגות A:U מרובים או רצפים שתוכננו במיוחד בבדיקות מסבכים את הגדרת יחידת האנזים.

מלדי-TOF טרשת נפוצה היא טכנולוגיה שיכולה להיות שימושית מאוד בניתוח DNA. יישומים שפותחו כוללים גנוטיפינג נוקלאוטיד יחיד-נוקלאוטיד27,28, ניתוח נוקלאוטיד שונה29, וזיהוי ביניים של תיקון DNA30,31,32,33,34. MALDI-TOF MS צריך להיות מאומץ בקלות לניתוח גליקוסילאז DNA כדי לזהות מוצרי DNA המכילים אתר AP. עם זאת, אתרי AP בדנ"א נוטים להישבר בתנאים ניסיוניים רבים33. בדיקת UDG מוצגת כאן באמצעות MALDI-TOF MS כדי למדוד ישירות את הייצור באתר AP ללא רעש משמעותי של שבירת גדילים. שיטה זו ללא תוויות קלה לעבודה ויש לה פוטנציאל גבוה ליישום התרופות של הקרנת מעכבי גליקוזילאאז DNA.

Protocol

1. הכנת מצע/תבנית

  1. עיצוב מצע /תבנית דופלקס עם תוכן G+C מאוזן של ~ 50 ± 10% וטמפרטורת ההיתוך המינימלית של 50 °C (50 °F) עבור אזור הדופלקס.
    הערה: הבדל נוקלאוטיד אחד בין מצעים של 18 nt לבין תבניות 19 nt (טבלה 1 ואיור 1) מסייע לפרשנות טובה יותר של אותות טרשת נפוצה וחישול מתאים. גדיל התבנית משמש כ- DNA משלים ליצירת אי-התאמות A-U או G-U (טבלה 1) אך יכול לשמש גם כאות ייחוס במדידות MS. השימוש באוליגונוקלאוטידים סינתטיים מטוהרים HPLC משביע רצון למחקר זה.
  2. להמיס DNA ב 1 mM EDTA ו 10 mM Tris-HCl (pH 8.0 ב 25 °C (TE) בריכוז של 100 מיקרומול / L כמו מלאי ולאחסן ב -20 °C (60 °F). דלל את מלאי 20 הμL הזה עם TE לנפח סופי של 800 μL (דילול של פי 25 ל-4 מיקרומול/ליטר). למדוד את הספיגה של פתרון ה- DNA בספקטרופוטומטר גלוי UV ב λ = 260 ננומטר כדי להבטיח את הריכוז שהוקצה ליצרן. לדוגמה: A260 = 0.204 עבור 4 מיקרומול / ליטר של U + 9 ו- A260 = 0.192 עבור 4 מיקרומול / L של T1 (טבלה 1).
  3. בצע ניתוח MALDI-TOF MS (סעיפים 4.6) עבור בקרת איכות oligonucleotide על-ידי בדיקת אותות שיא ייחודיים בערכי m/z ייעודיים וכן על-ידי בדיקה שיחס האות לרעש הוא >100 (איור 1B ואיור 1D).

2. בדיקת גליקוזילאאז DNA

  1. באמצעות מצע G:U של T1/U +9 דופלקס (טבלה 1 ואיור 1A) לתגובת הגליקוסילאז, לדוגמה, בצינור מיקרו-צנטריפוגה סטרילי של 1.5 מ"ל, הוסף 70 μL של H2O, 10 μL של מאגר תגובת UDG 10x, 5 μL של מלאי T1, ו 5 μL של מלאי U +9 (שלב 1.2.).
    הערה: בחר את הסוג הנכון של micropipette ובצע את הוראות היצרנים כדי לטפל באמצעי האחסון הנדרש. לדוגמה, השתמש פיפטה 2 μL לוותר 0.1-2 μL של נוזל, להשתמש פיפטה 10 μL לחלק 2-10 μL של נוזל, ולהשתמש 100 μL pipette לחלק 20-100 μL של נוזל כדי להבטיח דיוק ודיוק של התוצאות. הנפח המתואר של תערובת הריאגנט הוא עבור 10 בדיקות; כוונן את עוצמת הקול עבור מספר התגובות הרצוי. מאגר התגובה 1x UDG מכיל 1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol, ו 20 mM Tris-HCl (pH 8.0 ב 25 °C (25 °C). עיין בטבלת החומרים לקבלת המקור של מאגר תגובת UDG 10x.
  2. סגור את הצינור בצורה מאובטחת; דגירה באמבט מים במשך 30 דקות ב 65 °C (65 °F), ולאחר מכן במשך 30 דקות ב 37 °C (50 °F), ולבסוף על קרח במשך 3 דקות כדי להבטיח חישול נאות של דופלקס המצע / תבנית.
  3. בצינור מיקרו-צנטריפוגה סטרילי 1.5 מ"ל, הוסף 49 μL של מאגר תגובה UDG קר כקרח 1x ו 1 μL של UDG (5,000 יחידות / מ"ל; ראה את טבלת החומרים), דילול ל 0.1 יחידות / μL. בצע דילול סדרתי עם חיץ UDG 1x לריכוזי האנזים הרצויים של 0.05, 0.02, או 0.01 יחידות / μL. תמיד לשמור על UDG מדולל על קרח.
    הערה: בתגובה של 10 μL, 0.1 יחידות של UDG יכול לבקע יותר מ 30 pmol של uracil מדופלקס T1 / U + 9 ב 3 דקות.
  4. בצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי בגודל 1.5 מ"ל, הוסיפו 9.0 μL של תערובת מצע משלב 2.2 והקדימו את הצינור ל-37 מעלות צלזיוס. הוסף 1.0 μL של UDG מדולל משלב 2.3. השתמש טיימר כדי לתזמן את התגובה ולהעיף את הצינור לערבב תוכן.
    הערה: עבור בדיקת הגדרת יחידה, זמן הדגירה הוא 30 דקות. לקבלת בדיקה קינטית, השתמש בניתוח קורס זמן של 0.5, 1, 2, 2, 3, 5 דקות כדי להשיג את התעריף ההתחלתי. לקבלת בדיקת עיכוב UGI, זמן התגובה במשך 15 דקות.
  5. צנטריפוגה הצינורות עם תערובת התגובה עבור 3-5 s ב 3,200 × גרם בטמפרטורת הסביבה. לאחר מכן, להעביר את התגובה מיד ל 37 °C (50 °F).
  6. סיום תגובה
    1. הכן פתרונות של 0.25 M HCl ובסיס 0.23 M Tris. במבחנה של 15 מ"ל, הוסף 10 מ"ל של פתרון של 1 מ"מ EDTA ו 20 mM Tris-HCl (pH 8.0 ב 25 °C (25 °C )) כדי לחקות 1x מאגר תגובה UDG. חומצי עם 1 מ"ל של 0.25 M HCl ולבדוק עם מונה pH כדי להבטיח את ה- pH הוא ~ 2 ± 0.5. נטרלו עם 1 מ"ל של בסיס 0.23 M Tris ובדקו עם מד pH לקבלת pH סופי של 6.5 ± 0.5.
      הערה: שימוש ברצועות בדיקת pH הוא דרך מהירה וקלה לאשר מחדש את רמות החומציות של תערובת הריאגנט.
    2. הוסף 1 μL של 0.25 M HCl כדי חומצי את תערובת התגובה 10 μL כדי להשבית את האנזים ולהניח אותו על קרח במשך 6 דקות. הוסף 1 μL של בסיס 0.23 M Tris כדי לנטרל את מוצרי ה- DNA כדי למנוע שבירה של אתר AP על ידי חשיפה ממושכת לחומצה. הוסף 13 μL TE כדי להגדיל את הנפח של תערובת המוצר להעברת שבב מטריצה ולאחר מכן למקם אותו על קרח.
      הערה: מוצר AP אינו יציב מבחינה כימית ויש לנתח אותו על ידי MALDI-TOF MS תוך יומיים. לאחר אחסון ממושך במשך יותר משבוע, הצטברות של חלק ניכר מהפסקות גדיל מתרחשת עקב תגובות חיסול β/δ של מוצרי AP (איור 1D-G).
  7. העבר את כל מוצרי התגובה UDG 25 μL מצינורות microcentrifuge לצלחת מיקרוטיטר 384 well.
    הערה: ריכוזים גבוהים של cations, כגון נתרן או אשלגן במאגרים, ליצור הפרעה בניתוח MALDI-TOF MS ולכן דורשים התפלה. כמו E. coli UDG מאגר תגובה מכיל ריכוזים נמוכים מאוד של cations, התפלה אינה הכרחית. עם זאת, שנה פרוטוקול זה כדי למדוד תגובות גליקוסילאז DNA אחרות המכילות cations מתכת הדורשים התפלה כפי שתואר בעבר 35.

3. העבר מוצרי תגובה UDG לשבב מטריצה

  1. פתח את הדלת של מתקן הננו-ליטר (ראה טבלת החומרים) וטען את צלחת המיקרוטיטר בעלת 384 הבאר משלב 2.7 למחזיק הצלחת של הסיפון.
  2. הכנס את מערך שבב המטריצה למיקום לוחית הסיור המתאימה. מניחים את צלחת הסקאוט הטעונה על סיפון העיבוד של מתקן הננו-ליטר וסוגרים את הדלת.
  3. גע בלחצן הריצה במסך ההעברה, והמתן שהמכשיר יתחיל לחלק דגימות מלוח המיקרוטיטר של 384 well לשבב המטריצה.
  4. השתמש באפשרות הכרטיסיה 'חזון' כדי להציג את התמונה של השבב ואת אמצעי האחסון של חלוקה עבור כל נקודה במהלך ההפצה. ודא שהנפח המנוקד על השבב נמצא בטווח של 5-10 nL.

4. הגדר את פרמטרי הבדיקה על ספקטרומטר המסה

  1. השתמש בתוכנית היישום (עיין בטבלת החומרים) כדי להכין קובץ .xlsx המכיל את ערך האות m/z החזוי לייבוא.
    הערה: ההגדרות בקובץ I.xlsx (טבלה 2) הן הגדרות לדוגמה עבור בדיקת UDG של מצע G:U בסעיף 2.
  2. השתמש בתוכנית היישום כדי ליצור ולהגדיר בדיקת UDG חדשה על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני על האפשרות ייבוא קבוצת חיפוש בתבנית מעצב ובחירה בקובץ .xlsx מהרשימה הנפתחת (לדוגמה, FILE I.xlsx משלב 4.1).
  3. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על לחצן לקוח:פרוייקט:צלחת ולחץ על החלק העליון של עץ האפשרויות הנפתח כדי ליצור לוח בדיקה חדש. בתיבת הדו-שיח , הקלד שם קובץ (לדוגמה, CTT20210620 עבור קוד המעבדה ותאריך הבדיקה), וברשימה הנפתחת סוג לוחית , בחר את סוג הלוח 384-well ולחץ על אישור. חפש לוח ריק שיופיע מימין למסך.
  4. לחץ על האפשרות 'בדיקה '; בחר את הבדיקה (לדוגמה, קובץ I.xlsx) מהרשימה הנפתחת.
  5. כדי להקצות את הבדיקה שנבחרה (לדוגמה, FILE I.xlsx) לכל מיקום נקודה לדוגמה בלוח, הזז את הסמן לכל מיקום של הלוח הריק, לחץ כדי לסמן את הבאר ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לבחור הוסף Plex.
  6. השתמש במחשב שולחני או מחשב נישא כדי להכין רשימת עבודה בתבנית .xlsx ללא כותרת עליונה (לדוגמה, 0620.xlsx של טבלה 3) עבור כל הדוגמאות על השבב משלב 2.7. לחץ על לחצן הוסף פרוייקט לדוגמה חדש ; בחר את הקובץ (לדוגמה, 0620.xlsx) מהרשימה הנפתחת כדי לייבא את רשימת העבודה.
  7. חפש את כל קודי מדגם הבדיקה ברשימת העבודה (לדוגמה, מ - 0620.xlsx) בצד שמאל של המסך. לחץ על הקוד לדוגמה ברשימת העבודה ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על המיקום המתאים של הצלחת כדי לקשר את הבדיקות לכל מיקום.

5. פעולת ספקטרומטר מסה

  1. השתמש בתוכנית היישום כדי לקשר את ספקטרומטר המסה (ראה טבלת החומרים) לשבב המדגם (מסעיף 3) שיש לנתח.
  2. לחץ על הגדרת ברירת המחדל. בתיבת הדו-שיח , הקלד שם קובץ משלב 4.3 (לדוגמה, CTT20210620); בתיבה שם הניסוי, הקלד את מזהה השבב בברקוד השבב ושמור את ההגדרות.
  3. התחל את תוכנית בקרת ספקטרומטר המסה (ראה טבלת החומרים).
  4. לחצו על כפתור הכניסה/יציאה של ספקטרומטר המסה ותנו לסיפון להתרחב. הוציאו את מחזיק השבב והכניסו את שבב הדגימה משלב 3.4 למחזיק השבב. הניחו את מחזיק השבב הטעון על הסיפון המורחב ולחצו על כפתור הכניסה/יציאה כדי שהשבב לדוגמה ייכנס למכשיר.
  5. לחץ פעמיים על סמל רכישה של תוכנית היישום. בחלון רכישה , לחץ על כרטיסיית ההפעלה האוטומטית כדי להפעיל את המכשיר ולקבל ספקטרום מסה מהדגימות על השבב.

6. צפייה בספקטרום המסה וניתוח הנתונים

  1. הפעל את תוכנית ניתוח הנתונים (עיין בטבלת החומרים).
  2. עיין בעץ מסד הנתונים ובחר את מזהה השבב משלב 5.2. לחץ כדי להדגיש היטב יעד על השבב, ולחץ על סמל הספקטרום כדי להציג את ספקטרום המסה.
  3. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לבחור תיבת דו-שיח של התאמה אישית כדי לחתוך טווח מסוים של ספקטרום בחלון חדש. לחץ על ציר ה- X כדי להקליד את הגבולות העליונים והתחתונים של m/z, ולחץ על אישור כדי להציג את ספקטרום הטווח שצוין, כולל אותות העניין.
    הערה: כמות הדנ"א פרופורציונלית לעוצמת השיא בכל יחידת ערך m/z.
  4. מדוד את גובה השיא של ערכי m/z של אותות התואמים למצע U, מוצר AP ותבנית. לחץ על הפסגה והצג את גובה השיא בפינה הימנית העליונה של המסך.
    הערה: ספקטרום של 1,600 רוחב /1,200 יחידה הוא ממד סביר לבדיקה על מסך מחשב, כמו גם עבור תיעוד.
  5. כדי לשמור את הספקטרום עבור תיעוד, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על ייצוא ובחר סוג קובץ JPEG ברשימה הנפתחת. לחץ על דיסק יעד ועיון כדי לבחור את התקן האחסון ברשימה הנפתחת (לדוגמה, דיסק הבזק E:). הקלד את שם הקובץ (לדוגמה, 0620_1-2.jpg) ולחץ על ייצוא.
  6. במידת הצורך, הדפס קובץ JPEG מיוצא ומדוד את גובה השיא באופן ידני באמצעות סרגל.

תוצאות

תבניות ומצעים
אם ניקח אוליגונוקלאוטידים סינתטיים עם U במרכז (U+9) בשילוב עם תבנית G כדוגמה (איור 1A), בקרה ריקה של כמויות שיווימולריות של תבנית ומצע המכיל אורסיל יכולה לשמש לבקרת איכות של טוהר אוליגונוקלאוטיד סינתטי (איור 1B; האותות תואמים ל- m/z המיועד ...

Discussion

מאמר זה מספק הליך מפורט לשימוש בשיטת בדיקת MS UDG MALDI-TOF MS לזיהוי ישיר של מוצרי DNA המכילים AP. היתרונות העיקריים של שיטה זו הם כי מצעים המכילים uracil הם ללא תוויות, מדרגי, קל לעבוד עם, ולאפשר גמישות רבה יותר בעיצוב מצע.

מיצוי פנול/כלורופורם המומלץ על ידי ספק UDG מאפשר השבתה של האנזים כד?...

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

אנו מודים למתקן הליבה המשולב NCFPB לגנומיקה פונקציונלית (טאיפיי, טייוואן) ולמעבדת הפרמקוגנומיקה של NRPB (טאיפיי, טייוואן) על התמיכה הטכנית שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי משרד המדע והטכנולוגיה, טייוואן, R.O.C. [מספר מענק MOST109-2314-B-002-186 ל- K.-Y.S., רוב 107-2320-B-002-016-MY3 ל- S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-043 ל- W.h.F.]. H.-L.C. הוא מקבל מלגת דוקטורט מאוניברסיטת טייוואן הלאומית. מימון תשלום בגין גישה פתוחה: משרד המדע והטכנולוגיה, R.O..C.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol (Tris base)J.T bakerProtocol 1,2
Autoclaved deionized waterMILLIPOREProtocol 1,2
EDTAJ.T BakerProtocol 1,2
GlovesAQUAGLOVEProtocol 1,2,3
Hydrochloric acid (HCl)SIGMAProtocol 1,2
Ice bucketTaiwan.IncProtocol 2
Low retention pipette tips(0.5-10 µL)extra geneProtocol 1,2
Low retention pipette tips(1,250 µL)national scientific supply co, Inc.Protocol 1,2
Low retention pipette tips(200 µL)national scientific supply co, Inc.Protocol 1,2
MassARRAY Agena Bioscience, CAProtocol 4, 5
Mass spectrometry control programs include Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE, and Start RT Process.
MassARRAY NanodispenserAAT Bioquest, Inc.RS1000Protocol 3
MicrocentrifugeKubotaProtocol 2
MicrocentrifugeClubioProtocol 2
Microcentrifuge tube (1.5 mL)National scientific supply co, Inc.Protocol 2
Microcentrifuge tube rackTaiwan.IncProtocol 1,2
Micropipette  (P1000)GilsonProtocol 1,2
Micropipette  (P2)GilsonProtocol 1,2
Micropipette (P10)GilsonProtocol 1,2
Micropipette (P100)GilsonProtocol 1,2
Micropipette (P200)GilsonProtocol 1,2
Micropipette (SL2)RaininProtocol 1,2
OligonucleotidesIntegrated DNA Technologies (Singapore)Protocol 1,2
Quest Graph IC50 Calculator (v.1)AAT Bioquest, Inc.Fig. 4
https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1
Sodium hydroxide (NaOH)WAKOProtocol 2
SpectroCHIP array Agena Bioscience, CA#01509Protocol 3, 5
TimerTaiwan.IncProtocol 2
Typer 4.0 software Agena Bioscience, CA#10145Protocol 6
Typer 4.0 consists four programs including Assay Designer, Assay Editor, Plate Editor, and Typer Analyzer.
UDG Reaction Buffer (10x)New England Biolabs, MAB0280SProtocol 2
Uracil Glycosylase InhibitorNew England Biolabs, MAM0281SProtocol 2
Uracil-DNA GlycosylaseNew England Biolabs, MAM0280LProtocol 2
UV-VISBLE spectrophotometer UV-1601SHIMADZUProtocol 1
Water bathZETA ZC-4000 (Taiwan.Inc)Protocol 2

References

  1. Frederico, L. A., Kunkel, T. A., Shaw, B. R. A sensitive genetic assay for the detection of cytosine deamination: determination of rate constants and the activation energy. Biochemistry. 29 (10), 2532-2537 (1990).
  2. Kavli, B., Otterlei, M., Slupphaug, G., Krokan, H. E. Uracil in DNA-General mutagen, but normal intermediate in acquired immunity. DNA Repair. 6 (4), 505-516 (2007).
  3. Duncan, B. K., Miller, J. H. Mutagenic deamination of cytosine residues in DNA. Nature. 287 (5782), 560-561 (1980).
  4. Gros, L., Saparbaev, M. K., Laval, J. Enzymology of the repair of free radicals-induced DNA damage. Oncogene. 21 (58), 8905-8925 (2002).
  5. Robertson, A. B., Klungland, A., Rognes, T., Leiros, I. Base excision repair: The long and short of it. Cellular and Molecular Life Sciences. 66 (6), 981-993 (2009).
  6. Lindahl, T. An N-glycosidase from Escherichia coli that releases free uracil from DNA containing deaminated cytosine residues. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (9), 3649-3653 (1974).
  7. Caradonna, S. J., Cheng, Y. C. Uracil DNA-glycosylase. Purification and properties of this enzyme isolated from blast cells of acute myelocytic leukemia patients. Journal of Biological Chemistry. 255 (6), 2293-2300 (1980).
  8. Krokan, H., Urs Wittwer, C. Uracil DNA-glycosylase from HeLa cells: general properties, substrate specificity and effect of uracil analogs. Nucleic Acids Research. 9 (11), 2599-2614 (1981).
  9. Tchou, J., et al. 8-oxoguanine (8-hydroxyguanine) DNA glycosylase and its substrate specificity. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (11), 4690-4694 (1991).
  10. Knævelsrud, I., et al. Excision of uracil from DNA by the hyperthermophilic Afung protein is dependent on the opposite base and stimulated by heat-induced transition to a more open structure. Mutation Research-DNA Repair. 487 (3-4), 173-190 (2001).
  11. Minko, I. G., et al. Recognition of DNA adducts by edited and unedited forms of DNA glycosylase NEIL1. DNA Repair. 85, 102741 (2020).
  12. Bennett, S. E., Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. Processivity of Escherichia coli and rat liver mitochondrial uracil-DNA glycosylase is affected by NaCl concentration. Biochemistry. 34 (18), 6109-6119 (1995).
  13. Xia, L., O'Connor, T. R. DNA glycosylase activity assay based on streptavidin paramagnetic bead substrate capture. Analytical Biochemistry. 298 (2), 322-326 (2001).
  14. Kreklau, E. L., et al. A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O(6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase. Nucleic Acids Research. 29 (12), 2558-2566 (2001).
  15. Liu, B., et al. Real-time monitoring of uracil removal by uracil-DNA glycosylase using fluorescent resonance energy transfer probes. Analytical Biochemistry. 366 (2), 237-243 (2007).
  16. Zhang, L., Zhao, J., Jiang, J., Yu, R. A target-activated autocatalytic DNAzyme amplification strategy for the assay of base excision repair enzyme activity. Chemical Communications. 48 (70), 8820-8822 (2012).
  17. Zhou, D. M., et al. Graphene oxide-hairpin probe nanocomposite as a homogeneous assay platform for DNA base excision repair screening. Biosensors and Bioelectronics. 41, 359-365 (2013).
  18. Wang, X., Hou, T., Lu, T., Li, F. Autonomous exonuclease iii-assisted isothermal cycling signal amplification: A facile and highly sensitive fluorescence DNA glycosylase activity assay. Analytical Chemistry. 86 (19), 9626-9631 (2014).
  19. Wu, Y., Wang, L., Zhu, J., Jiang, W. A DNA machine-based fluorescence amplification strategy for sensitive detection of uracil-DNA glycosylase activity. Biosensors and Bioelectronics. 68, 654-659 (2015).
  20. Xi, Q., Li, J. J., Du, W. F., Yu, R. Q., Jiang, J. H. A highly sensitive strategy for base excision repair enzyme activity detection based on graphene oxide mediated fluorescence quenching and hybridization chain reaction. Analyst. 141 (1), 96-99 (2016).
  21. Liu, X., et al. A novel electrochemical biosensor for label-free detection of uracil DNA glycosylase activity based on enzyme-catalyzed removal of uracil bases inducing strand release. Electrochimica Acta. 113, 514-518 (2013).
  22. McWilliams, M. A., Anka, F. H., Balkus, K. J., Slinker, J. D. Sensitive and selective real-time electrochemical monitoring of DNA repair. Biosensors and Bioelectronics. 54, 541-546 (2014).
  23. Jiao, F., et al. A novel and label-free biosensors for uracil-DNA glycosylase activity based on the electrochemical oxidation of guanine bases at the graphene modified electrode. Talanta. 147, 98-102 (2016).
  24. Liu, X., et al. Label-free colorimetric assay for base excision repair enzyme activity based on nicking enzyme assisted signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 54, 598-602 (2014).
  25. Nie, H., Wang, W., Li, W., Nie, Z., Yao, S. A colorimetric and smartphone readable method for uracil-DNA glycosylase detection based on the target-triggered formation of G-quadruplex. Analyst. 140 (8), 2771-2777 (2015).
  26. Du, Y. C., Jiang, H. X., Huo, Y. F., Han, G. M., Kong, D. M. Optimization of strand displacement amplification-sensitized G-quadruplex DNAzyme-based sensing system and its application in activity detection of uracil-DNA glycosylase. Biosensors and Bioelectronics. 77, 971-977 (2016).
  27. Haff, L. A., Smirnov, I. P. Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry. Genome Research. 7 (4), 378-388 (1997).
  28. Blondal, T., et al. A novel MALDI-TOF based methodology for genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Research. 31 (24), 155 (2003).
  29. Cui, Z., Theruvathu, J. A., Farrel, A., Burdzy, A., Sowers, L. C. Characterization of synthetic oligonucleotides containing biologically important modified bases by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 379 (2), 196-207 (2008).
  30. Darwanto, A., Farrel, A., Rogstad, D. K., Sowers, L. C. Characterization of DNA glycosylase activity by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 394 (1), 13-23 (2009).
  31. Redrejo-Rodríguez, M., et al. New insights in the removal of the Hydantoins, oxidation product of pyrimidines, via the base excision and Nucleotide incision repair pathways. PLoS ONE. 6 (7), 21039 (2011).
  32. Prorok, P., et al. Uracil in duplex DNA is a substrate for the nucleotide incision repair pathway in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 3695-3703 (2013).
  33. Alexeeva, M., et al. Excision of uracil from DNA by hSMUG1 includes strand incision and processing. Nucleic Acids Research. 47 (2), 779-793 (2019).
  34. Thapar, U., Demple, B. Deployment of DNA polymerases beta and lambda in single-nucleotide and multinucleotide pathways of mammalian base excision DNA repair. DNA Repair. 76, 11-19 (2019).
  35. Su, K. Y., et al. Proofreading and DNA repair assay using single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (136), e57862 (2018).
  36. Hillenkamp, F., Karas, M., Beavis, R. C., Chait, B. T. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of biopolymers. Analytical Chemistry. 63 (24), 1193-1202 (1991).
  37. Brammer, K. W., Jones, A. S., Mian, A. M., Walker, R. T. Study of the use of alkaline degradation of DNA derivative as a procedure for the determination of nucleotide distribution. Biochimica et Biophysica Acta. 166 (3), 732-734 (1968).
  38. Lindahl, T., Ljungquist, S., Siegert, W., Nyberg, B., Sperens, B. DNA N-glycosidases: properties of uracil-DNA glycosidase from Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 252 (10), 3286-3294 (1977).
  39. Rashtchian, A., Buchman, G. W., Schuster, D. M., Berninger, M. S. Uracil DNA glycosylase-mediated cloning of polymerasechain reaction-amplified DNA: Application to genomic and cDNA cloning. Analytical Biochemistry. 206 (1), 91-97 (1992).
  40. Varshney, U., van de Sande, J. H. Specificities and kinetics of uracil excision from uracil-containing DNA oligomers by Escherichia coli uracil DNA glycosylase. Biochemistry. 30 (16), 4055-4061 (1991).
  41. Delort, A. M., et al. Excision of uracil residues in DNA: Mechanism of action of Escherichia coli and Micrococcus luteus uracil-DNA glycosylases. Nucleic Acids Research. 13 (2), 319-335 (1985).
  42. Wang, Z. G., Smith, D. G., Mosbaugh, D. W. Overproduction and characterization of the uracil-DNA glycosylase inhibitor of bacteriophage PBS2. Gene. 99 (1), 31-37 (1991).
  43. Chang, H. L., et al. Measurement of uracil-DNA glycosylase activity by matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry technique. DNA Repair. 97, 103028 (2021).
  44. Minko, I. G., et al. Catalysts of DNA strand cleavage at apurinic/apyrimidinic sites. Scientific Reports. 6 (1), 28894 (2016).
  45. Lindahl, T. Uracil-DNA glycosylase from Escherichia coli. Methods in Enzymology. 65, 284-290 (1980).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

182MALDI TOFDNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved